Днк mycoplasma genitalium: Микоплазма, определение ДНК (Mycoplasma genitalium, DNA) в соскобе эпителиальных клеток урогенитального тракта

(ii) Воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) — ВЗОМТ представляет собой клинический синдром, обусловленный распространением микроорганизмов из нижних половых путей в верхние.Некоторые бактерии, в том числе обнаруженные при бактериальном вагинозе, C. trachomatis и N. gonorrhoeae , могут вызывать ВЗОМТ. Установление связи между M. genitalium и инфекцией верхних отделов половых путей имеет большое значение для определения значимости инфекции ¹³ . Более ранние исследования, основанные на серологии, были противоречивыми. В исследовании 115 женщин, обратившихся в клинику ЗППП в Кении с острой тазовой болью, плазмоклеточный эндометрит был обнаружен у 58 и 900–20 М.genitalium была обнаружена в цервикальных мазках или биоптатах эндометрия у 16 ​​процентов по сравнению с 2 процентами женщин без эндометрита ⁶³ . Целых 33% обследованных женщин были ВИЧ-позитивными, но M. genitalium чаще не выявлялась у ВИЧ-инфицированных женщин. В другом исследовании у женщин с клиническим подозрением на ВЗОМТ ⁶⁴ , M. genitalium чаще выявлялась у ВИЧ-позитивных женщин (19 против 5%). В исследовании случай-контроль Симмс и его коллеги ⁶⁵ обследовали 45 женщин с клинически диагностированным ВЗОМТ и обнаружили M.genitalium с помощью ПЦР в мазках из эндоцервикса у девяти (16%) по сравнению с ни одним из 37 контрольных пациентов.

(iii) Бактериальный вагиноз (БВ) — Хотя в одном из ранних отчетов M. genitalium был обнаружен у 4 (16%) из 25 невыбранных женщин и у 3 из 10 женщин с БВ ⁶⁶ , последующие исследования показали отсутствие связи M. genitalium с БВ. Keane et al ⁶⁷ изучали 15 женщин с БВ, ни у одной из которых не было M.genitalium положительная, как и только 2 (12%) из 17 женщин без БВ, посещавших клинику ЗППП. Таким образом, в отличие от M. hominis , M. genitalium , вероятно, не ассоциирован с BV ¹⁷ .

(iv) Неблагоприятный исход беременности и бесплодие — Имеется мало информации о роли M. genitalium в неблагоприятном исходе беременности, будь то преждевременные роды, аборт или мертворождение. В одном исследовании M. genitalium была обнаружена только в 4 процентах вагинальных мазков в середине триместра от 124 женщин, родивших преждевременно ⁶⁸ .Это, вероятно, немного выше, чем распространенность в нормальной популяции беременных женщин, как было оценено в другом исследовании ⁶⁹ , где только 0,7% женщин, беременных в первом триместре, были M. genitalium положительными. Что касается бесплодия, были представлены только косвенные доказательства. В датском исследовании ⁷⁰ образцы сыворотки от 308 бесплодных женщин исследовали на наличие антител к M. genitalium с помощью иммуноблотинга против цельноклеточных белков M. genitalium и M. pneumoniae , а также против рекомбинантного антигена MgPa. Среди женщин с трубным бесплодием 22% были серопозитивными по сравнению с 7% женщин с бесплодием по мужскому фактору или бесплодием неясного генеза с нормальными маточными трубами.

Результаты экспериментов на животных убедительно свидетельствуют о патогенности M. genitalium для урогенитального тракта человекообразных приматов, а возбудитель передается половым путем между партнерами ¹³ .Представляется разумным заключить, что M. genitalium может вызывать слизисто-гнойный цервицит, хотя гуморальный ответ отсутствует. M. genitalium передается половым путем с частотой передачи, аналогичной C. trachomatis ¹³ . Роль M. genitalium у женщин установлена ​​хуже, чем у мужчин, и необходимы дальнейшие исследования для изучения ее связи с ВЗОМТ и поздними последствиями, такими как бесплодие. Существуют только косвенные доказательства бесплодия, а БВ и неблагоприятный исход беременности, по-видимому, не связаны с 900–20 М. гениталиум инфекции. Как и у мужчин, необходимы рандомизированные контролируемые клинические испытания, направленные на определение оптимального лечения инфекции.

Ассоциация

Поскольку путь передачи является общим для всех инфекций, передающихся половым путем, многие авторы наблюдали коинфекцию M. genitalium с другими патогенами. В исследовании Yokoi et al. ⁷¹ частота коинфекции M.genitalium среди мужчин с гонококковым уретритом оказалась низкой (4,1%) по сравнению с коинфекцией C. trachomatis (21,2%). В другом исследовании, когда 45 мужчин с гонококковым уретритом были одновременно обследованы на M. genitalium с помощью ПЦР, 4,4% показали положительный результат ⁷² . Gaydos et al ⁷³ при проведении исследований ИППП среди мужчин, посещающих клиники ЗППП, показали, что 5,9% из них были коинфицированы C.трахоматис . В Западной Африке Pepin et al. ⁷⁴ показали, что почти половина инфекций, вызванных M. genitalium , происходила как коинфекция. Распространенность коинфекции с гонококковым уретритом C. trachomatis и Trichomonas vaginalis составила 37,9, 10,6 и 7,6% соответственно ⁷⁴ . Сообщалось также о коинфекциях среди генитальных микоплазм. В исследовании Amirmozafari et al ⁷⁵ одновременное появление M.genitalium и U. urealyticum была выявлена ​​у 1,4% женщин с генитальными инфекциями, тогда как тройная инфекция M. genitalium , U. urealyticum и M. hominis наблюдалась у 0,5% этих пациенток. . Другие авторы также продемонстрировали сосуществование M. genitalium с другими патогенами ^{76 ,77} .

МОДЕЛИ НА ЖИВОТНЫХ

Исследования на животных полезны для установления трансмиссивности M.genitalium у человека. Хотя урогенитальные исследования на животных имеют серьезные ограничения, до сих пор шимпанзе считаются лучшими моделями животных для изучения мужского уретрита, вызванного M. genitalium ¹³ . Было показано, что интрауретральная инокуляция M. genitalium самцам шимпанзе приводит к инфекции у них, и в некоторых случаях микроорганизмы выделялись из крови ^{45 ,46} . Исследования на животных инфекций самок M. genitalium были более полезными, чем исследования, проведенные на самцах животных.У низших приматов, таких как макаки-резусы и яванские макаки, ​​снижена восприимчивость к инфекции ¹³ . Исследования, проведенные у мужчин с НГУ и их партнерш-женщин, показали, что M. genitalium передается половым путем так же эффективно, как и C. trachomatis , который был изучен более подробно ^{48 ,78 ,79} . Основываясь как на показателях конкордантности среди партнеров, так и на типировании ДНК, показывающем один и тот же тип последовательности среди партнеров, не вызывает сомнений, что M. genitalium является патогеном, передающимся половым путем ⁸⁰ , но для подтверждения требуются дальнейшие исследования.

ДИАГНОСТИКА

Идентификация микоплазмы и лабораторная диагностика микоплазменных инфекций основана на классических бактериологических тестах, включая морфологию, культуральные характеристики, физиологические и серологические свойства. Новые тесты, основанные на молекулярном анализе геномной ДНК, рибосомных РНК, клеточных белков и липидов, похоже, вытесняют классические тесты, и можно ожидать, что молекулярные тесты вскоре станут преобладающими тестами для идентификации микоплазм ¹⁷ .

(i) Сбор проб

Образцы, подходящие для обнаружения M. genitalium культуральными или некультуральными методами, включают уретральный мазок, мочу, эндоцервикальный мазок и биопсию эндометрия. Предпочтительны тампоны из альгината кальция, дакрона или полиэстера с алюминиевыми или пластиковыми стержнями. Следует избегать использования ватных тампонов с деревянным стержнем из-за потенциального ингибирующего эффекта. Перед транспортировкой в ​​лабораторию мазки всегда следует снимать с образцов ⁸¹ .По возможности образцы следует инокулировать у постели больного с использованием подходящего транспорта и/или питательной среды. SP4 считается хорошим транспортом, а также культуральной средой для M. genitalium . Если немедленная транспортировка в лабораторию невозможна, образцы следует хранить в холодильнике, но не более 24 часов. Mollicutes можно хранить в течение длительного времени в подходящей среде для выращивания и транспортировки при температуре -80°C или в жидком азоте. Хранение при -20°C вредно для обнаружения, даже некультуральными методами.Микоплазмы человеческого происхождения можно исследовать на лабораторном столе и/или в боксе безопасности класса 2 ⁸¹ .

(ii) Методы окрашивания и культивирования

Прямое обнаружение M. genitalium в образцах с помощью различных методов окрашивания практически невозможно из-за их небольшого размера и отсутствия клеточной стенки. Однако флуорохромы ДНК, такие как Hoechst 33258 или краситель акридинового оранжевого, могут быть нанесены на жидкости организма после центрифугирования. M. genitalium медленно растет с прототипом штамма G37, образуя колонии в течение 6 недель или более ⁸² .После первоначального выделения двух штаммов M. genitalium в 1981 г. ни один последующий изолят не выделялся из половых путей до 1996 г., когда Jensen et al. возможный рост на среде Фрииса.

До разработки методов ПЦР было предпринято несколько попыток использования ДНК-зондов. Сообщалось, что конструкция радиоактивно меченых олигонуклеотидных зондов, нацеленных на 16S рРНК, имеет предел обнаружения приблизительно 1000 организмов ⁸⁶ и может быть адаптирована для обнаружения только M. genitalium . О клинических исследованиях с использованием таких зондов не сообщалось, но на самом деле информация о последовательности из этого исследования использовалась в одной из первых публикаций по ПЦР для М.пневмонии ⁸⁷ . Risi et al. ⁸⁸ использовали клонированный фрагмент из 256 п.н. с неизвестной функцией для зондирования смоделированных образцов женских половых органов и обнаружили предел обнаружения примерно в 10 000 копий генома. Полногеномный ник-транслируемый зонд с заявленным пределом обнаружения от 10 ⁴ до 10 ⁵ копий генома также использовался для изучения образцов уретры от 203 мужчин ⁸⁹ . Доказательств, указывающих на важную роль M. genitalium в остром НГУ, обнаружено не было, но мужчины с рецидивирующим НГУ чаще были положительными.Учитывая, что большая часть пациентов имеет очень низкую ДНК-нагрузку в урогенитальных образцах ⁹⁰ , удивительно, что Hooton et al ⁸⁹ в своем исследовании обнаружили 15% положительных результатов M. genitalium . . Для обнаружения M. genitalium необходимы высокочувствительные анализы с высокой клинической чувствительностью. В настоящее время только тесты амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) обладают необходимой чувствительностью, и до сих пор сообщалось только о тестах на основе ПЦР ^{5 ,82} .

Первый тест на основе ПЦР был опубликован в 1991 году ⁴³ , а вскоре после этого Палмер и его коллеги ⁶⁴ опубликовали свой метод. Оба были основаны на последовательности ДНК MgPa. В то время считалось, что ген адгезина будет достаточно консервативным, так как он играет важную роль в патогенезе инфекции. Поэтому было неожиданно, что область MgPa, окруженная праймерами MgPa-1 и MgPa-3 ⁴³ , оказалась изменчивой. Различные другие варианты последовательностей были обнаружены с помощью анализа ферментов рестрикции, а затем путем секвенирования ⁹⁰ .Это наблюдение привело к дальнейшим исследованиям генетической изменчивости M. genitalium ⁹¹ и к необходимости альтернативных ПЦР-анализов ^{92 ,93} . Анализ, разработанный Palmer et al. ⁹⁴ , представлял собой полувложенную ПЦР. Опыт работы с набором праймеров MgPa-476/MgPa-903 послужил дополнительным стимулом для разработки анализа на основе гена 16S рРНК ⁹³ . Одной из последних разработок в диагностической ПЦР является гомогенная ПЦР в реальном времени.Первый анализ ПЦР в реальном времени для M. genitalium был разработан Yoshida et al в 2002 г. ⁹⁵ . Анализ был основан на обнаружении гена 16S рРНК. Впоследствии анализ LightCycler, обнаруживающий ген P115 (MG299) с зондами LNA (закрытые нуклеиновые кислоты), был применен для обнаружения M. genitalium и для мониторинга реакции на лечение у девяти инфицированных мужчин ⁹⁶ .

Исследователи отмечают ненадежность иммунологических анализов и некоторых ПЦР-тестов, используемых для обнаружения M. genitalium ⁹⁷ , вероятно, связана с обширной антигенной рекомбинацией, характерной для геномных исследований ⁹⁸ . Некоторые тесты для тестирования мочи первого мочеиспускания (FVU) и самостоятельно взятых вагинальных мазков имеют некоторую научно обоснованную полезность (чувствительность или специфичность > 95%) для обнаружения M. genitalium , и они включают многоцелевую ПЦР в реальном времени, Gen- Probe (Gen-Probe, Сан-Диего, Калифорния, США), анализ транскрипционно-опосредованной амплификации (GPTMARA), ПЦР в реальном времени (RTPCR), MPCR Reverse Line Blot (MPCRRLB), LightCycler ПЦР в реальном времени (LCRTPCR) (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана, США) и ПЦР в реальном времени TaqMan® ⁹⁹ .При отсутствии «золотого стандарта» выбор используемого анализа может зависеть от наличия на месте. Сообщается, что вагинальные мазки обладают высокой чувствительностью для обнаружения M. genitalium ¹² . В настоящее время имеется достаточный объем информации, подтверждающей полезность MgPa, независимо от его потенциальной изменчивости, в качестве цели NAAT.

ЛЕЧЕНИЕ

Микоплазмы, включая M. genitalium , обычно чувствительны к тетрациклинам и фторхинолонам ¹⁰⁰ , но устойчивы к тем, которые действуют на компоненты клеточной стенки бактерий, e.г . β-лактамы из-за отсутствия клеточной стенки. Из-за сложности выделения M. genitalium из клинических образцов существует лишь несколько сообщений о минимальной ингибирующей концентрации (МПК) различных антибиотиков. Эти МИК были определены только для нескольких изолятов M. genitalium , которые были созданы и поддерживались в лаборатории. Профиль чувствительности таких изолятов к противомикробным препаратам может не точно подтверждать профиль нынешних клинических изолятов M. genitalium .Однако эти исследования дают некоторую полезную информацию, когда противомикробные агенты были выбраны для лечения инфекции M. genitalium . Данные этих исследований показывают, что профиль чувствительности M. genitalium к противомикробным препаратам in vitro сходен с профилем M. pneumoniae ¹⁰¹ . Тетрациклин, эритромицин и некоторые новые макролиды, такие как кларитромицин и азитромицин, высокоактивны в отношении M. genitalium ^{101 – 105} .МИК тетрациклина, включая доксициклин и миноциклин, для M. genitalium составляет от 0,01 до 0,05 мкг/мл ¹⁰¹ . Информация о резистентности к тетрациклину у M. genitalium отсутствует, но M. genitalium -положительные мужчины с НГУ и женщины с цервицитом могут лучше реагировать на азитромицин, чем на тетрациклин, возможно, из-за более низких МПК. МИК эритромицина и более новых макролидов составляет 0,01 мкг/мл или меньше ¹⁰¹ . Телитромицин, входящий в состав новейших производных макролидов, называемых кетолидами, также обладает высокой активностью в отношении 900–20 М.genitalium с МПК 0,015 мкг/мл или менее ¹⁰² . Некоторые новые хинолоны обладают высокой активностью. Например, заявленная МИК составляет от 0,06 до 0,12 мкг/мл для спарфлоксацина, от 0,06 до 0,12 мкг/мл для грепафлоксацина, 0,05 мкг/мл для гемифлоксацина и от 0,03 до 0,06 мкг/мл для тросафлоксацина Однако офлоксацин и ципрофлоксацин проявляют лишь умеренную активность при концентрациях от 0,5 до 1 и 2 мкг/мл соответственно ^{101 ,102} . До сих пор не установлены общепринятые стандарты для p H, среды, условий инкубации или продолжительности инкубации для проведения теста на чувствительность к микоплазмам.Никакие контрольные точки МИК, специфичные для этих организмов, не одобрены каким-либо регулирующим органом.

На сегодняшний день нет опубликованных руководств или рекомендаций по лечению M. genitalium положительного уретрита. Сообщалось лишь о нескольких результатах антимикробной химиотерапии у мужчин с M. genitalium положительным уретритом ^{44 ,50 ,52 ,58} . Кроме того, эти исследования имеют некоторые ограничения, такие как небольшое число пациентов и отсутствие обнаружения других потенциально важных генитальных микоплазм или других типов организмов.Поэтому невозможно сделать выводы о наилучшей стратегии лечения M. genitalium положительного негонококкового уретрита ³ . Поскольку специфический микробиологический диагноз микоплазменной инфекции ставится редко, соответствующее лечение обеспечивает защиту противомикробными препаратами от микроорганизмов, вызывающих конкретный синдром. Соответственно НГУ лечат доксициклином (100 мг перорально два раза в день в течение 7 дней) или азитромицином (1,0 г однократно перорально) для обеспечения активности против 900–20 C.trachomatis, U. urealyticum и M. genitalium ¹⁰⁶ . Gambini et al ⁵⁰ наблюдали, что лечение доксициклином приводило к облегчению симптомов и микробиологическому излечению инфекции у 94,3% пациентов с M. genitalium положительным негонококковым уретритом. В случаях НГУ персистирование M. genitalium в уретре связано с рецидивирующим НГУ. Таким образом, у пациентов с НГУ, индуцированным M. genitalium , может быть рекомендован более длительный курс лечения антибиотиками, а в случае M – курс лечения антибиотиками продолжительностью 2 или 3 недели.пневмония пневмония ³ . Медленный рост M. genitalium и его способность внедряться и размножаться в эпителиальных клетках могут объяснить его персистенцию в уретре или других местах, особенно после лечения ⁶⁰ . M. genitalium была обнаружена у некоторых пациентов с хроническим НГУ, которых первоначально лечили доксициклином (100 мг/день в течение 10 дней) и 6-недельным курсом эритромицина (500 мг QDS) ¹⁰⁷ . Другие обнаружены M. genitalium , сохраняющиеся у некоторых пациентов с острым НГУ после лечения доксициклином (200 мг, затем 100 мг в течение 13 дней) или эритромицином ¹⁰⁸ , или после лечения тетрациклином (500 мг 2 раза в день в течение 10 дней) ⁵⁸ или после лечения левофлоксацином (100 мг TDS в течение 14 дней) ⁵⁸ .В одном исследовании схема азитромицина, включающая 500 мг однократно в 1-й день с последующим приемом 250 мг 1 раз в сутки в течение 4 дней, обеспечила отличные показатели излечения ⁶⁰ . Необходимы дальнейшие исследования для определения наиболее подходящего лечения M. genitalium положительного острого и хронического НГУ и других M. genitalium -ассоциированных инфекций.

Заключение

M. genitalium является одним из самых маленьких прокариот, способных к репликации, не имеет клеточной стенки и имеет характерную форму груши/колбы с органеллой на конце. M. genitalium имеет несколько факторов вирулентности, ответственных за его патогенность. Последнее включает его способность прикрепляться к эпителиальным клеткам хозяина, используя концевую органеллу с ее адгезинами, высвобождение ферментов и способность уклоняться от иммунного ответа хозяина за счет антигенной изменчивости. M. genitalium в последнее время стала важной причиной инфекций, передающихся половым путем, и в настоящее время известна как установленная причина негонококкового уретерита (НГУ) у мужчин.Разумно заключить, что он тесно связан со слизисто-гнойным цервицитом у женщин. Доказательства в отношении M. genitalium PID и бесплодия вполне убедительны и указывают на то, что этот микроорганизм может вызывать восходящую инфекцию, но необходимы дополнительные исследования, чтобы понять взаимосвязь между M. genitalium и заболеванием репродуктивного тракта у женщин. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять динамику коинфекции ВИЧ и M. genitalium .Несмотря на то, что для диагностики инфекций M. genitalium было разработано множество внутренних ПЦР, существует потребность в высокоточных, проверенных на международном уровне и одобренных коммерческих МАНК. Все представленные данные поддерживают использование азитромицина в качестве препарата первого выбора при инфекциях, вызванных M. genitalium . В заключение, M. genitalium является важной причиной инфекций, передающихся половым путем, как у мужчин, так и у женщин, и при необходимости их следует лечить азитромицином. ¹²³

Ссылки

Mycoplasma genitalium: для адекватного лечения необходима точная диагностика | Журнал инфекционных болезней

Аннотация

История вопроса

Mycoplasma genitalium очень трудно выращивать в культуре, но с появлением исследовательских методов молекулярной амплификации ее стало легче изучать на предмет ассоциации с заболеванием.Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и другие молекулярные анализы продемонстрировали связь с неблагоприятными исходами заболеваний, такими как уретрит или негонококковый уретрит у мужчин, и неблагоприятными репродуктивными последствиями у женщин, например, цервицитом, эндометритом и воспалительными заболеваниями органов малого таза (ВЗОМТ), включая связь с риском заражения вирусом иммунодефицита человека. Отсутствие коммерчески доступных диагностических тестов ограничивает широкое распространение рутинных тестов. Растущие сообщения о высоких показателях резистентности к азитромицину, обнаруженной в научных исследованиях, повысили потребность в доступных коммерческих диагностических тестах, а также в стандартизированных методах обнаружения маркеров резистентности.В этом обзоре рассматриваются доступные молекулярные методы диагностики M. genitalium и тесты для прогнозирования чувствительности антибиотиков к азитромицину.

Методы

В PubMed (Национальная медицинская библиотека США и Национальные институты здравоохранения) был проведен поиск литературы, опубликованной в период с 2000 по 2016 год, с использованием поисковых терминов Mycoplasma genitalium, M. genitalium, диагностика и обнаружение.

Результаты

Первые диагностические ПЦР-тесты были сосредоточены на гене адгезии MPa и гене рибосомной РНК 16S.Впоследствии был разработан анализ опосредованной транскрипцией амплификации, нацеленный на рибосомы, и он широко использовался для изучения эпидемиологии M. genitalium . Получили распространение новые методы, в том числе количественная ПЦР для определения нагрузки организмом, ПЦР AmpliSens, ПЦР для гена pdhD, микрочип на основе ПЦР для множественных инфекций, передающихся половым путем, и мультиплексная ПЦР. Ни один из них еще не одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, хотя некоторые анализы имеют маркировку CE в Европе.Кроме того, многие исследовательские методы, включая ПЦР, секвенирование генов и анализ кривых плавления, были разработаны для обнаружения мутаций гена 23S рибосомной РНК, которые придают устойчивость к азитромицину. Один недавно разработанный тест может одновременно тестировать как M. genitalium , так и мутации устойчивости к азитромицину.

Выводы

Рекомендуется, чтобы больше коммерческих анализов как для диагностики этого микроорганизма, так и для определения выбора лечения, были разработаны и доступны после одобрения регулирующими органами. Необходимы исследования, чтобы установить экономическую эффективность планового тестирования M. genitalium у пациентов с симптомами и скрининга у всех лиц с высоким риском заражения и передачи инфекций, передающихся половым путем.

Mollicute Mycoplasma genitalium — прихотливая облигатная внутриклеточная бактерия и самая маленькая из прокариот, способных к саморепликации [1]. Его крошечный геном имеет длину 580 т.п.н. и содержит 482 гена, кодирующих белок [1, 2]. Хотя выращивать M.genitalium была впервые выделена Tully et al. [3] из уретральных образцов, полученных от мужчин с уретритом (негонококковым) в 1981 г. Культура ткани используется для улучшения восстановления организма, но медленный рост и громоздкие методы обнаружения препятствуют рутинному использованию этого метода. для диагностики [4]. Бактерия стала лучше изучаться на предмет ассоциации с заболеванием с появлением исследовательских методов молекулярной амплификации, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и анализы амплификации, опосредованные транскрипцией (ТМА) [5–10].

С момента появления таких молекулярных анализов микроорганизм был связан со многими неблагоприятными исходами заболеваний, такими как уретрит или негонококковый уретрит у мужчин и многими неблагоприятными репродуктивными последствиями у женщин, включая цервицит, эндометрит и ВЗОМТ [11–16]. Существует также тесная связь с риском заражения вирусом иммунодефицита человека [17]. Однако отсутствие диагностического теста, одобренного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), серьезно ограничило доступность тестирования у лиц с симптомами и без симптомов из группы высокого риска.Растущую озабоченность по поводу лечения заболеваний, вызванных M. genitalium , вызывают сообщения о росте показателей резистентности к азитромицину [18]. Возникающая роль M. genitalium в качестве возбудителя инфекции, передающейся половым путем (ИППП), была всесторонне рассмотрена Taylor-Robinson and Jensen [19] и Manhart [11]. Этот обзор посвящен новым молекулярным методам диагностики M. genitalium и анализам для прогнозирования чувствительности антибиотиков к азитромицину.

МЕТОДЫ

В PubMed (Национальной медицинской библиотеке США и Национальном институте здравоохранения) был проведен поиск литературы, опубликованной в период с 2000 по 2016 год, с использованием следующих поисковых терминов: Mycoplasma genitalium, M. genitalium, диагностика и обнаружение. Был получен список из 1003 опубликованных статей. Статьи были просмотрены и проанализированы на наличие методов диагностики амплификационными и молекулярными методами, а также на предмет диагностики маркеров резистентности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Диагностика синдромов, связанных с

Уретрит у мужчин был первым синдромом, связанным с Mycoplasma . Диагноз и причины уретрита хорошо известны и недавно были рассмотрены Bachmann et al. [20]. Этот обзор охватывал M. genitalium как возможную причину уретрита. Хотя во многих исследованиях для диагностики уретрита использовался критерий окрашивания уретры по Граму с наличием ≥5 полиморфноядерных лейкоцитов в поле зрения при большом увеличении, многие хламидии и, возможно, M.genitalium может быть пропущена по этому критерию, и в настоящее время Центры по контролю и профилактике заболеваний рекомендуют использовать в качестве диагностического порога ≥2 полиморфноядерных лейкоцитов в поле зрения [20]. Персистенция уретрита после терапии была особенно связана с M. genitalium и может быть связана с подозрением на устойчивость к антибиотикам [21–22]. Однако есть и другие возможные причины, в том числе реинфекция, несоблюдение режима лечения, лекарственная устойчивость или постинфекционная иммунологическая реакция.Диагноз инфекции Mycoplasma и других ИППП у женщин с меньшей вероятностью связан с определенными симптоматическими состояниями и часто протекает бессимптомно. Микоплазма может быть обнаружена во влагалище, шейке матки и эндометрии. За последние несколько лет накопилось много новых данных, свидетельствующих о том, что M. genitalium является важной причиной болезненных явлений у женщин [11, 12, 15]. (См. статью на эту тему в этом приложении.)

Диагностика

Хотя в настоящее время в Соединенных Штатах нет одобренных FDA анализов M. genitalium , исследовательские анализы, основанные на тестах амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), используются с начала 1990-х годов и обладают высокой чувствительностью и специфичностью для выявления многих инфекционных заболеваний. микроорганизмы, такие как хламидии, гонореи и трихомонады, а также M. genitalium [5–9]. Анализ, сформулированный Дженсеном и его коллегами [6–8], нацеленный на консервативную область гена 16S рибосомной РНК (рРНК), широко использовался в научных исследованиях (таблица 1).

для обнаружения Mycoplasma genitalium

Тип теста .	Наименование испытания .	Генная мишень .	Автор .	Маркировка CE .
PCR	NA	MGPA	MGPA	Deguchi et al [5]	№
PCR	NA	MGPA; 16S рРНК	Jensen et al [6–8]	No
ПЦР	Дуплекс ПЦР	MgPA; 16S RRNA	Hardick et al [9]	NO
APTima MG	23S RRNA	23S RRNA	Hologic 23] / Getman et et al [24]	Да
Мультиплекс PCR	STD Finder	MLPA	MUVUUNYI et al [25]	NO
Multilex PCR	Bio-Rad DX	NA	Le Roy et al [26]	№
QPCR	ПЦР в реальном времени	pdhD	Мюллер и др [27]	Нет
Multiplex КПЦР	AmpliSense	GyrB	Румянцева и др [28]	Да
ДНК-микрочипов	Multiplex Микрочип на основе ПЦР	16S рРНК	Cao et al [29]	Нет
кПЦР	Диагенод S-DiaMGTV	van Alphen et al [30]	Да
ПЦР в реальном времени сравнение	TIB MOLBIOL/ Roche and Diagenode M. Genitalium	MG219 и GAP Фрагменты генов	Le Roy et al [31]	№
MulitPlex QPCR Plexzyme	Speedx	23S RRNA; выявляет устойчивые мутации	Tabrizi et al [44]	Да

Тип теста .	Наименование испытания .	Генная мишень .	Автор .	Маркировка CE .
PCR	NA	MGPA	MGPA	Deguchi et al [5]	№
PCR	NA	MGPA; 16S рРНК	Jensen et al [6–8]	No
ПЦР	Дуплекс ПЦР	MgPA; 16S RRNA	Hardick et al [9]	NO
APTima MG	23S RRNA	23S RRNA	Hologic 23] / Getman et et al [24]	Да
Мультиплекс PCR	STD Finder	MLPA	MUVUUNYI et al [25]	NO
Multilex PCR	Bio-Rad DX	NA	Le Roy et al [26]	№
QPCR	ПЦР в реальном времени	pdhD	Мюллер и др [27]	Нет
Multiplex КПЦР	AmpliSense	GyrB	Румянцева и др [28]	Да
ДНК-микрочипов	Multiplex Микрочип на основе ПЦР	16S рРНК	Cao et al [29]	Нет
кПЦР	Диагенод S-DiaMGTV	van Alphen et al [30]	Да
ПЦР в реальном времени сравнение	TIB MOLBIOL/ Roche and Diagenode M. Genitalium	MG219 и GAP Фрагменты генов	Le Roy et al [31]	№
MulitPlex QPCR Plexzyme	Speedx	23S RRNA; обнаруживает устойчивые мутации	Tabrizi et al [44]	Да

Выбранные типы усиленных молекулярных испытаний для обнаружения MyCoplasma Genitalium

Тип теста .	Наименование испытания .	Генная мишень .	Автор .	Маркировка CE .
PCR	NA	MGPA	MGPA	Deguchi et al [5]	№
PCR	NA	MGPA; 16S рРНК	Jensen et al [6–8]	No
ПЦР	Дуплекс ПЦР	MgPA; 16S RRNA	Hardick et al [9]	NO
APTima MG	23S RRNA	23S RRNA	Hologic 23] / Getman et et al [24]	Да
Мультиплекс PCR	STD Finder	MLPA	MUVUUNYI et al [25]	NO
Multilex PCR	Bio-Rad DX	NA	Le Roy et al [26]	№
QPCR	ПЦР в реальном времени	pdhD	Мюллер и др [27]	Нет
Multiplex КПЦР	AmpliSense	GyrB	Румянцева и др [28]	Да
ДНК-микрочипов	Multiplex Микрочип на основе ПЦР	16S рРНК	Cao et al [29]	Нет
кПЦР	Диагенод S-DiaMGTV	van Alphen et al [30]	Да
ПЦР в реальном времени сравнение	TIB MOLBIOL/ Roche and Diagenode M. Genitalium	MG219 и GAP Фрагменты генов	Le Roy et al [31]	№
MulitPlex QPCR Plexzyme	Speedx	23S RRNA; выявляет устойчивые мутации	Tabrizi et al [44]	Да

Тип теста .	Наименование испытания .	Генная мишень .	Автор .	Маркировка CE .
PCR	NA	MGPA	MGPA	Deguchi et al [5]	№
PCR	NA	MGPA; 16S рРНК	Jensen et al [6–8]	No
ПЦР	Дуплекс ПЦР	MgPA; 16S RRNA	Hardick et al [9]	NO
APTima MG	23S RRNA	23S RRNA	Hologic 23] / Getman et et al [24]	Да
Мультиплекс PCR	STD Finder	MLPA	MUVUUNYI et al [25]	NO
Multilex PCR	Bio-Rad DX	NA	Le Roy et al [26]	№
QPCR	ПЦР в реальном времени	pdhD	Мюллер и др [27]	Нет
Multiplex КПЦР	AmpliSense	GyrB	Румянцева и др [28]	Да
ДНК-микрочипов	Multiplex Микрочип на основе ПЦР	16S рРНК	Cao et al [29]	Нет
кПЦР	Диагенод S-DiaMGTV	van Alphen et al [30]	Да
ПЦР в реальном времени сравнение	TIB MOLBIOL/ Roche and Diagenode M. Genitalium	MG219 и GAP Фрагменты генов	Le Roy et al [31]	№
MulitPlex QPCR Plexzyme	Speedx	23S RRNA; выявляет устойчивые мутации	Tabrizi et al [44]	Да

Процесс разработки и использования лабораторией исследовательского диагностического теста в рамках одной лаборатории требует тщательного тестирования для подтверждения его точности и известен как лабораторно-разработанный тест ( LDT ).LDT — это лабораторные тесты, которые больницы, академические и клинические лаборатории разрабатывают как службы тестирования в соответствии со своими собственными процедурами. Они часто создаются в ответ на неудовлетворенные клинические потребности и могут использоваться для точной диагностики, а также для мониторинга и руководства лечением пациентов. LDT также используются для диагностики и оценки заболеваний и расстройств, для которых в настоящее время не существует утвержденного FDA тестового набора, например, для редких заболеваний.

Чтобы лаборатории в Соединенных Штатах могли использовать исследовательские МАНК, разработанные компанией, часто называемые тестами «только для научных исследований» (RUO), для диагностики и лечения заболеваний у пациентов, наблюдаемых в клинических условиях, каждая лаборатория должна пройти внутреннюю валидацию анализ, аналогичный процедуре, необходимой для LDT.В этом процессе каждая отдельная лаборатория проводит собственное исследование для сравнения анализа RUO с другим анализом аналита или сравнивает индивидуальные результаты лаборатории с результатами, полученными другой лабораторией, во многом аналогично тому, что FDA требует для LDT. Это дорогостоящий процесс, и его нелегко осуществить.

Следующим шагом на пути к коммерциализации для компании является подача тестовых реагентов в FDA для получения статуса реагента, специфичного для аналита (ASR).Это означает, что компания может продавать реагенты, но не в виде «набора» с контролями или контролями. Лаборатории все равно придется провести валидационное исследование, аналогичное процессу разработки LDR, чтобы использовать результаты этого анализа в клинических условиях, то есть для лечения пациентов. Очень немногие лаборатории сделали это. Только 1 компания получила статус ASR в Соединенных Штатах с тестом TMA, первоначально разработанным и предлагаемым в качестве анализа RUO компанией GenProbe/Hologic Company [9, 10]. Hardick et al. сообщили об общей чувствительности и специфичности продукта RUO у 607 человек как 98.1% и 98,1% соответственно по сравнению с двумя исследовательскими анализами (100% и 97,9% в образцах мочи у мужчин, соответственно, и 98,4% в образцах вагинальных мазков) [9]. Этот анализ M. genitalium TMA ASR теперь также имеет маркировку CE в Европе [23, 24]. Он широко использовался для многих исследований Mycoplasma и для изучения эпидемиологии M. genitalium [10, 13, 14, 21, 22]. Следующим шагом будет проведение клинических испытаний FDA, что является дорогостоящим процессом.

Термин CE возник как аббревиатура от conformité Européenne, означающая европейское соответствие, но этот термин не определен как таковой в соответствующем законодательстве. Маркировка CE является символом свободной продажи в Европейском экономическом пространстве (внутреннем рынке). Знак СЕ на анализе в Европе является заявлением производителя о том, что продукт соответствует основным требованиям соответствующих европейских законов о защите. Это означает, что продукты, продаваемые в Европейском экономическом пространстве, были оценены как отвечающие высоким требованиям безопасности, здоровья и защиты окружающей среды. Он обеспечивает свободное перемещение продукта в пределах Европейского Союза. Клиническая валидация по эталонному стандарту не требуется.

К счастью, большая группа других диагностических молекулярных методов, описанных ниже, была разработана как на международном, так и на национальном уровне, и некоторые из них начинают получать маркировку СЕ. Некоторые из них имеют большие перспективы для диагностических возможностей как для исследований, так и для клинического использования. Также было разработано несколько очень новых анализов (таблица 1).

При изучении нового мультиплексного ПЦР-анализа STDFinder было сообщено, что он обладает 100% специфичностью и 100% чувствительностью при обнаружении Mycoplasma, , но было выявлено только 3 случая [25].В технологии амплификации зонда, зависящей от мультиплексного лигирования, используется один анализ, который позволяет одновременно амплифицировать до 45 различных мишеней с использованием 1 универсального набора праймеров в окончательной амплификации.

Предварительная оценка эффективности анализа Bio-Rad Dx CT/NG/MG для обнаружения Chlamydia trachomatis, M. genitalium, и Neisseria gonorrhoeae в урогенитальных образцах показала, что по сравнению с внутренним ПЦР TaqMan для М.genitalium, , новый анализ имел специфичность для обнаружения M. genitalium , составляющую 99,5% для образцов мазков и 100% для образцов мочи женщин, но было обнаружено очень мало случаев Mycoplasma [26].

Müller et al. разработали и утвердили метод количественной ПЦР (КПЦР) в режиме реального времени для определения бактериальной нагрузки M. genitalium в образцах эндоцервикального мазка на основе амплификации гена pdhD, кодирующего дигидролипоамиддегидрогеназу, с использованием Rotor-Gene платформа [27].Анализ продемонстрировал предел обнаружения 300 копий генома/мл с использованием геномной ДНК G37 M. genitalium (ASTCC 33530D). В анализе был амплифицирован фрагмент гена pdhD из 82 пар оснований M. genitalium (нуклеотиды, соответствующие последовательности с GenBank № L43967.2). Анализ был специфичен для ДНК M. genitalium и не амплифицирует ДНК других видов Mycoplasma и Ureaplasma по сравнению с коммерческим анализом (Sacace Biotechnologies).Были протестированы только образцы эндоцервикального мазка. В 119 положительных образцах эндоцервикального мазка из 1600 загрузка M. genitalium варьировалась от <300 до 3240000 копий/мл с пределом обнаружения 10 копий на реакцию (или 300 копий/мл цервикального мазка). образец суспензии). Этот предел был аналогичен тому, который был обнаружен другими в образцах мочи мужчин [8]. Этот анализ кПЦР продемонстрировал хорошее обнаружение, воспроизводимость и специфичность и полезен для качественного и количественного анализа М.genitalium в эндоцервикальных и, возможно, других генитальных образцах [27].

Новый мультиплексный анализ AmpliSens в режиме реального времени с маркировкой CE N. gonorrhoeae / C.trachomatis/M.genitalium/T.vaginalis -MULTIPRIME-FRT ПЦР был оценен и сравнен с 4 тестами Aptima: анализ COMBO 2 , анализ Trichomonas vaginalis (одобрен FDA) и 2 разных анализа APTIMA M. genitalium RUO [28], один из которых использовался для анализа расхождений. В целом для М.genitalium мультиплексный ПЦР-анализ AmpliSens продемонстрировал 100% специфичность, но субоптимальную чувствительность (81,9%; 95% доверительный интервал, 70,7–89,7%). Эти результаты согласуются с ранее оцененными характеристиками однокомпонентного ПЦР-анализа AmpliSens M. genitalium . Интересно, что для вагинальных образцов была получена более низкая чувствительность (76,5%), в отличие от результатов многих предыдущих исследований с использованием других МАНК [28].

Исследование, проведенное в 2015 году, задокументировало микроматрицу на основе ПЦР, включающую 31 специфический зонд для одновременного обнаружения разнообразной панели из 17 инфекций, связанных с ИППП, включая N.gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, M. hominis, Ureaplasma, вирус простого герпеса типов 1 и 2 и 10 типов вируса папилломы человека [29]. Микрочип был специфичным, потому что комменсальные и другие близкородственные урогенитальные микробы не реагировали перекрестно с зондами микрочипа. Он был в 10 раз более чувствительным, чем мультиплексная ПЦР. Из 158 проанализированных образцов с подозрением на вирус папилломы человека Ureaplasma было обнаружено в 21 , M. hominis в 15, C. trachomatis в 4 и N.gonorrhoeae в 1. Однако M. genitalium , по-видимому, не обнаружена. Это исследование может быть одним из первых сообщений о высокопроизводительной системе обнаружения, которая идентифицирует распространенные патогены, связанные с ИППП, из клинических образцов [29].

Достаточно новый коммерческий набор для количественной ПЦР Diagenode S-DiaMGTV позволяет качественно обнаруживать и дифференцировать M. genitalium и T. vaginalis методом количественной ПЦР в клинических образцах [30]. В небольшом исследовании, где распространенность Mycoplasma составила 3.7%, он продемонстрировал почти идеальное совпадение с эталонными анализами, и мы приветствуем проведение дополнительных исследований. В одном отчете сравнивали набор TIB MOLBIOL LightMix Kit и набор для ПЦР в реальном времени Diagenode для M. genitalium с собственным ОТ-ПЦР TaqMan, обычно используемым для диагностики M. genitalium [31]. Для анализов TIB MOLBIOL и Diagenode было обнаружено совпадение 96% и 93% соответственно по сравнению с результатами внутреннего анализа.

Обнаружение и диагностика устойчивости к антибиотикам у

Мутации, придающие устойчивость к антибиотикам макролидам для M genitalium , сосредоточены в положениях нуклеотидов 2058 и 2059 в области V гена 23S рРНК и представляют собой переходы аденина в гуанин, цитозин или тимидин [18]. Местонахождение 5 мутаций, придающих устойчивость, — A2058G, A2058C, A2058T, A2059G и A2059C. Jensen и соавт. [18, 32] впервые описали неэффективность азитромицина у пациентов с M. genitalium , связанную с индуцированной макролидной резистентностью и мутациями в области 23S гена рРНК.Опубликовано несколько опубликованных исследований, позволяющих выявить устойчивость к макролидам в образцах, о которых известно, что они положительны в отношении M. genitalium, , с использованием выявления мутаций гена 23s рРНК, связанных с устойчивостью, с помощью ПЦР и анализа кривой плавления [32–36]. Однако ни один из этих анализов не доступен на коммерческой основе. Все эти исследования резистентности подтверждают высокую распространенность мутаций, наблюдаемую в других исследованиях [24, 37].

Обычно макролидные антибиотики, такие как азитромицин, ингибируют размножение бактерий путем связывания с 50S-субъединицей рибосомы, которая включает как 5S-, так и 23S-субъединицы, для предотвращения трансляции матричной РНК и предотвращения синтеза белка. Резистентность возникает в результате мутационных изменений, препятствующих связыванию антибиотика, и, таким образом, синтез белка не предотвращается, как это происходит, когда организм чувствителен к антибиотику.

Getman et al. [24] сообщили об использовании анализа ТМА с маркировкой CE (GenProbe/Hologic) для определения распространенности инфекции M. genitalium . и коинфекции с другими микроорганизмами, передающимися половым путем, и частоту фенотипа резистентности к макролидным антибиотикам определяли в урогенитальных образцах, собранных у 946 мужчин и женщин, обратившихся за медицинской помощью в Соединенных Штатах.Ни ASR, ни анализ ТМА с маркировкой CE не обнаруживают мутации резистентности, но в исследовании Getman et al [24] для оценки резистентности к макролидам-антибиотикам среди M. genitalium – положительных субъектов [24]. Показатели распространенности M. genitalium составили 16,1% для женщин и 17,2% для мужчин. Фенотип устойчивости к макролидам был обнаружен у 50,8% женщин и 42% мужчин, что подтверждает высокую распространенность устойчивости в других исследованиях [32–37]

Необходимость обнаружения и тестирования устойчивости

При быстром появлении резистентных к макролидам штаммов M. genitalium [37–43], рекомендуется, чтобы все положительные анализы M genitalium были отражены в тесте для определения мутаций устойчивости к макролидам. Это может быть выполнено с помощью секвенирования по Сэнгеру [32], пиросеквенирования [37], анализа расплава с высоким разрешением [32] или использования зондов FRET [34, 35, 36],

Комбинированный анализ, который может быстро обнаружить организм и в то же время крайне необходимо определить маркеры молекулярной резистентности к азитромицину, стандартному антибиотику, используемому для терапии.Одним из недавно разработанных таких анализов является анализ 23S, в котором используются новые технологии PlexZyme и PlexPrime (SpeeDX) [44]. Мультиплексный анализ кПЦР для обнаружения M. genitalium и 5 мутаций, связанных с устойчивостью к макролидам, использует новую технологию PlexZyme (ранее известную как MNAzyme) и PlexPrimers, которые избирательно амплифицируют целевые последовательности, соединенные для обеспечения мультиплексирования высокого уровня для обнаружения мутантов (рис. 1).

Рисунок 1.

PlexPrimers комбинируются с PlexZymes для специфичной для мутации амплификации и обнаружения с помощью количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР).PlexPrimer содержит 3 раздела; длинная 5′-последовательность распознавания мишени (5T), короткая 3′-специфическая область мишени (3T), совпадающая с последовательностью мутации (M), и промежуточная последовательность-вставка (INS), которая не связывается с мишенью, а скорее увеличивает специфичность области 3Т для мутанта по сравнению с последовательностью дикого типа. Во время амплификации INS включается в ампликоны PlexPrimer, и их можно обнаружить в режиме реального времени с помощью PlexZymes, ферментов нуклеиновых кислот, которые образуются из составляющих их парзимов (A и B) только при наличии соответствующих ампликонов PlexPrimer.Каждый парзим содержит плечо, связывающее зонд, частичное каталитическое ядро ​​и плечо, связывающееся с мишенью, ориентированные таким образом, что парзим А связывается с ампликоном в области, содержащей INS, а парзим В связывается по соседству ниже по течению. Каталитически активные PlexZymes связывают и расщепляют репортерные зонды, разделяя флуорофор (F) и гаситель (Q), что приводит к генерации сигнала.

Рисунок 1.

PlexPrimers комбинируются с PlexZymes для специфичной для мутации амплификации и обнаружения с помощью количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР).PlexPrimer содержит 3 раздела; длинная 5′-последовательность распознавания мишени (5T), короткая 3′-специфическая область мишени (3T), совпадающая с последовательностью мутации (M), и промежуточная последовательность-вставка (INS), которая не связывается с мишенью, а скорее увеличивает специфичность области 3Т для мутанта по сравнению с последовательностью дикого типа. Во время амплификации INS включается в ампликоны PlexPrimer, и их можно обнаружить в режиме реального времени с помощью PlexZymes, ферментов нуклеиновых кислот, которые образуются из составляющих их парзимов (A и B) только при наличии соответствующих ампликонов PlexPrimer.Каждый парзим содержит плечо, связывающее зонд, частичное каталитическое ядро ​​и плечо, связывающееся с мишенью, ориентированные таким образом, что парзим А связывается с ампликоном в области, содержащей INS, а парзим В связывается по соседству ниже по течению. Каталитически активные PlexZymes связывают и расщепляют репортерные зонды, разделяя флуорофор (F) и гаситель (Q), что приводит к генерации сигнала.

Анализ был проведен на 400 образцах от 254 последовательно инфицированных участников, прошедших тесты на излечение. Из М.genitalium – положительные образцы в тесте на излечение, 56% показали мутацию резистентности к макролидам. Анализ MG 23S сравнивали с эталонным методом количественной ПЦР для обнаружения M. genitalium и анализом расплава с высоким разрешением и секвенированием для обнаружения мутаций устойчивости к макролидам; его чувствительность и специфичность составляли 99,1% и 98,5% для выявления M. genitalium и 97,4% и 100% для обнаружения устойчивости к макролидам. Недавнее использование этого анализа в наших исследованиях в США продемонстрировало аналогичную высокую распространенность моделей резистентности к макролидам: 50 % в проспективном исследовании и 36 % в ретроспективном исследовании в общей сложности с более чем 400 урогенитальными образцами от женщин (Justin Hardick, личный коммуникация). Возможность одновременной диагностики инфекций M. genitalium и генетических маркеров устойчивости к макролидам является клинически важным достижением в новой технологии диагностических тестов.

Моксифлоксин часто рекомендуется для лечения пациентов, у которых азитромицин неэффективен, но в настоящее время хорошо задокументирована резистентность к фторхинолонам [39, 43, 45–47]. Микробиологическая неудача лечения моксифлоксацином у пациентов была связана с обнаружением в их клинических образцах мутаций, связанных с устойчивостью к фторхинолонам [27].Если резистентность к моксифлоксацину возрастает до высоких уровней, может потребоваться дальнейшая разработка диагностических тестов для выявления и этих маркеров резистентности.

ВЫВОДЫ

В настоящее время лечение большинства инфекций, вызванных M. genitalium , происходит в основном в контексте синдромного лечения уретрита, цервицита и ВЗОМТ из-за отсутствия диагностических тестов в Соединенных Штатах. Тестирование доступно в Европе, но неясно, насколько широко оно используется.Значительный объем клинических исследований, основанных на диагностических тестах RUO, позволил многое узнать об эпидемиологии и связях с болезнями M. genitalium . Теперь, когда мы узнали, что этот микроорганизм в значительной степени связан с уретритом у мужчин и значительными патологическими эффектами у женщин, включая ВЗОМТ и повышенную восприимчивость к инфекции вируса иммунодефицита человека, и что лечение рекомендованными антибиотиками для распространенных синдромов ИППП часто неэффективно, пришло время для дальнейшей разработки коммерчески доступных анализов для использования в диагностике M.genitalium и принятие решений о лечении [45]. Определение экономической эффективности широко распространенной диагностики M. genitalium у симптомных и бессимптомных лиц с высоким риском срочно необходимо для продвижения этой повестки дня, как и более коммерчески доступные анализы, одобренные FDA.

Примечания

Подтверждение.  Эта работа является результатом технической консультации экспертов Mycoplasma genitalium , которая проводилась при поддержке Отдела микробиологии и инфекционных заболеваний Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, контракт HHSN272201300012I с Университетом Алабамы в Бирмингеме Инфекции, передаваемые половым путем Группа клинических испытаний.

Финансовая поддержка.  Эта работа была поддержана Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии (грант U54EB007958) и Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (грант U-01068613), Национальными институтами здравоохранения.

Дополнение к спонсорству.  Эта работа является частью приложения, спонсируемого Отделением клинических испытаний инфекций, передающихся половым путем, Университета Алабамы в Бирмингеме и Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний.

Возможные конфликты интересов.  C.A.G. получила тестовых наборов M. genitalium от компаний GenProbe//Hologic и SpeeDX для научных исследований. Автор представил форму ICMJE для раскрытия потенциальных конфликтов интересов. Выявлены конфликты, которые редакция считает относящимися к содержанию рукописи.

Каталожные номера

Фрейзер

см

Gocayne

JD

Белый

O

Минимальный набор генов Mycoplasma genitalium

Наука

1995

270

397

403

Стекло

СО

Асад-Гарсия

N

Альперович

N

Основные гены минимальной бактерии

Proc Natl Acad Sci USA

2006

103

425

30

Талли

ДжГ

Тейлор-Робинсон

D

Коул

RM

Роуз

DL

Недавно обнаруженная Mycoplasma в урогенитальном тракте человека

Ланцет

1981

1

1288

91

Хамасуна

Р

Осада

Y

Дженсен

JS

Выделение Mycoplasma genitalium из образцов первой порции мочи совместным культивированием с клетками Vero

J Clin Microbiol

2007

45

847

50

Дегучи

Т

Yoshida

T

Yokoi

S

Продольное количественное обнаружение с помощью ПЦР в реальном времени Mycoplasma genitalium в моче первого прохождения у мужчин с рецидивирующим негонококковым уретритом

J Clin Microbiol

2002

40

3854

6

Дженсен

JS

Uldum

SA

Søndergård-Andersen

J

Vuust

J

Lind

K

3 .

Полимеразная цепная реакция для обнаружения Mycoplasma genitalium в клинических образцах

J Clin Microbiol

1991

29

46

50

Дженсен

JS

Борре

МБ

Дон

Б

Обнаружение Mycoplasma genitalium с помощью ПЦР-амплификации гена 16S рРНК

J Clin Microbiol

2003

41

261

6

Дженсен

JS

Бьернелиус

E

Дон

B

Лидбринк

P

Использование TaqMan 5’ нуклеазной ПЦР в режиме реального времени для количественного определения ДНК Mycoplasma genitalium у мужчин с уретритом и без него, которые посещали клинику заболеваний, передающихся половым путем

J Clin Microbiol

2004

42

683

92

Хардик

Дж

Gile

J

Hardick

A

HSIEH

YH

Quinn

T

Gaydos

C

Эффективность исследования амплификации, опосредованной транскрипцией gen-probe [скорректированной], по сравнению с многоцелевой ПЦР в реальном времени для обнаружения Mycoplasma genitalium

J Clin Microbiol

2006

44

1236

40

Мансон

Е

Bykowski

H

Munson

KL

Клиническая лабораторная оценка опосредованной транскрипцией Mycoplasma genitalium амплификации с использованием первичных женских урогенитальных образцов

J Clin Microbiol

2016

54

432

8

Манхарт

ЛЭ

Mycoplasma genitalium : эмерджентное заболевание, передающееся половым путем?

Infect Dis Clin North Am

2013

27

779

92

Манхарт

ЛЭ

Холмс

КК

Хьюз

JP

Хьюстон

Л.С.

Mycoplasma genitalium среди молодых людей в США: новая инфекция, передающаяся половым путем

Am J Public Health

2007

97

1118

25

Гайдос

С

Maldeis

NE

Hardick

A

Hardick

J

Quinn

TC

Mycoplasma genitalium в сравнении с хламидиозом, гонореей и трихомонадой как этиологическим агентом уретрита у мужчин, посещающих клиники ЗППП

Половой переход Заражение

2009

85

438

40

Гайдос

С

Maldeis

NE

Hardick

A

Hardick

J

Quinn

TC

Mycoplasma genitalium как фактор множественной этиологии цервицита у женщин, посещающих венерологические клиники

Sex Transm Dis

2009

36

598

606

Лис

Р

Роухани-Рахбар

А

Манхарт

LE

Инфекция Mycoplasma genitalium и заболевания женских половых путей: метаанализ

Clin Infect Dis

2015

61

418

26

Макгоуин

класс

Андерсон-Смитс

C

Mycoplasma genitalium : новая причина венерических заболеваний у женщин

PLoS Pathog

2011

7

e1001324

Напьерала Маведзенге

С

Вайс

HA

Ассоциация Mycoplasma genitalium и ВИЧ-инфекции: систематический обзор и метаанализ

СПИД

2009

23

611

20

Дженсен

JS

Неэффективность лечения азитромицином у Mycoplasma genitalium -положительных пациентов с негонококковым уретритом связана с индуцированной резистентностью к макролидам

Clin Infect Dis

2008

47

1546

53

Тейлор-Робинсон

Д

Дженсен

ДЖС

Mycoplasma genitalium : от куколки до разноцветной бабочки

Clin Microbiol Rev

2011

24

498

514

Бахманн

левый

Manhart

LE

Martin

DH

Достижения в понимании и лечении мужского уретрита

Clin Infect Dis

2015

61

S763

9

Швебке

JR

Rompalo

A

Taylor

S

Переоценка лечения негонококкового уретрита: выделение новых патогенов — рандомизированное клиническое исследование

Clin Infect Dis

2011

52

163

70

Сенья

АС

Lensing

S

Rompalo

A

Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis инфекции у мужчин с негонококковым уретритом: предикторы и персистенция после терапии

J Infect Dis

2012

206

357

65

Гетман

Д

Цзян

А

О’Доннелл

М

Коэн

С

Распространенность Mycoplasma genitalium , коинфекция и частота резистентности к макролидам в когорте многоцентровых клинических исследований в США

J Clin Microbiol

2016

54

2278

83

Мувуньи

см

Dhont

N

Verhelst

R

Оценка нового мультиплексного анализа полимеразной цепной реакции STDFinder для одновременного обнаружения 7 возбудителей заболеваний, передающихся половым путем

Diagn Microbiol Infect Dis

2011

71

29

37

Ле Рой

С

Le Hen

I

Clerc

M

Первый отчет об эффективности анализа Bio-Rad Dx CT/NG/MG для одновременного обнаружения Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae и Mycoplasma genitalium в образцах мочеполовых органов

J Microbiol Methods

2012

89

193

7

Мюллер

ЕЕ

Venter

JM

MAGOAA

MP

MORRISON

C

LEWIS

DA

Mavedzenge

Sn

Разработка ПЦР-анализа в реальном времени с роторным геном для обнаружения и количественного определения Mycoplasma genitalium

J Microbiol Methods

2012

88

311

5

Румянцева

Т

Голпарян

D

Нильссон

CS

Оценка нового мультиплексного ПЦР-анализа в реальном времени AmpliSens для одновременного обнаружения Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis

АПМИС

2015

123

879

86

Цао

Б

Wang

S

Tian

Z

Определение характеристик патогенов, связанных с заболеваниями, передающимися половым путем, с помощью ДНК-микрочипов

PLoS One

2015

10

e0133927

Ле Рой

С

Перейр

S

Бебеар

C

Оценка двух коммерческих ПЦР в реальном времени для обнаружения Mycoplasma genitalium в урогенитальных образцах

J Clin Microbiol

2014

52

971

3

Дженсен

JS

Протокол обнаружения Mycoplasma genitalium с помощью ПЦР в клинических образцах и последующего обнаружения мутаций, опосредующих устойчивость к макролидам, в области V гена 23S рРНК

Методы Мол Биол

2012

903

129

39

Двойной

Дж

Jensen

JS

Bradshaw

CS

Передача и отбор устойчивых к макролидам Mycoplasma genitalium инфекций, обнаруженных с помощью экспресс-анализа расплава с высоким разрешением

PLoS One

2012

7

e35593

Туати

А

Peuchant

O

Jensen

JS

Bébéar

C

Pereyre

S

Прямое выявление устойчивости к макролидам в изолятах Mycoplasma genitalium из клинических образцов из Франции с помощью ПЦР в реальном времени и анализа кривой плавления

J Clin Microbiol

2014

52

1549

55

Мир

С

Sorthe

J

u

,

U

OLSEN

AO

Moghaddam

A

Reinton

N

Идентификация резистентной к макролидам Mycoplasma genitalium с помощью ПЦР в реальном времени

J Eur Acad Dermatol Venereol

2015

29

1616

20

Кристиансен

GQ

Лисби

JG

Шеннинг

К

Анализ 5′-нуклеазного генотипа для выявления устойчивых к макролидам Mycoplasma genitalium в клинических образцах

J Clin Microbiol

2016

54

1593

7

Саладо-Расмуссен

К

Дженсен

ДЖС

Mycoplasma genitalium Схема тестирования и резистентность к макролидам: датское общенациональное ретроспективное исследование

Clin Infect Dis

2014

59

24

30

Манхарт

ЛЭ

Диагностика и тестирование на устойчивость к Mycoplasma genitalium : что для этого потребуется?

Clin Infect Dis

2014

59

31

3

Тагг

КА

Джеффрис

Нью-Джерси

Кэдвелл

DL

Дональд

Дж.А.

Мутации, связанные с резистентностью к фторхинолонам и макролидам, у Mycoplasma genitalium

J Clin Microbiol

2013

51

2245

9

Нейхуис

РХ

Северс

ТТ

Ван дер Вегт

ДС

Ван Цвет

АА

Кустерс

JG

Высокие уровни мутаций, связанных с устойчивостью к макролидам, у Mycoplasma genitalium требуют лечения с учетом чувствительности к антибиотикам

J Antimicrob Chemother

2015

70

2515

8

Лау

А

Брэдшоу

CS

Льюис

D

Эффективность азитромицина для лечения генитальной инфекции Mycoplasma genitalium : систематический обзор и метаанализ

Clin Infect Dis

2015

61

1389

99

Уокер

Дж

Fairley

CK

Bradshaw

CS

Mycoplasma genitalium Заболеваемость, нагрузка на организм и неэффективность лечения в когорте молодых австралийских женщин

Clin Infect Dis

2013

56

1094

100

Дегучи

Т

Ясуда

М

Хори

К

Мутации, связанные с лекарственной устойчивостью, в Mycoplasma genitalium у работниц секс-индустрии, Япония

Emerg Infect Dis

2015

21

1062

4

Тебризи

серийный номер

Tan

LY

Walker

S

Мультиплексный анализ для одновременного выявления Mycoplasma genitalium и устойчивости к макролидам с использованием технологии PlexZyme и PlexPrime

PLoS One

2016

11

e0156740

Пруд

МДж

NORI

AV

AV

Witney

AA

Lopman

RC

Beetcher

PD

SADIQ

st

Высокая распространенность устойчивых к антибиотикам Mycoplasma genitalium при негонококковом уретрите: необходимость рутинного тестирования и неадекватность существующих вариантов лечения

Clin Infect Dis

2014

58

631

7

Кикучи

М

Ito

S

Yasuda

M

Значительное увеличение числа устойчивых к фторхинолонам Mycoplasma genitalium в Японии

J Antimicrob Chemother

2014

69

2376

82

Кэдвелл

ДЛ

Тагг

КА

Джеффрис

Нью-Джерси

Гилберт

ГЛ

Неэффективность лечения моксифлоксацином при инфекциях Mycoplasma genitalium из-за резистентности к макролидам и фторхинолонам

Int J STD AIDS

2013

24

822

8

Примечания автора

© Автор, 2017 г. Опубликовано Oxford University Press для Американского общества инфекционистов. Все права защищены. Для разрешений, электронная почта: [email protected]ком.

Количественная геномная ДНК из штамма Mycoplasma genitalium G37

Продукт предоставляется «КАК ЕСТЬ», и жизнеспособность продуктов ATCC ^® гарантируется в течение 30 дней с даты отгрузки при условии, что покупатель хранил и обращался с продуктом в соответствии с информацией, содержащейся в информационном листе продукта, веб-сайт и сертификат анализа. Для живых культур ATCC перечисляет состав среды и реагенты, которые оказались эффективными для продукта.В то время как другие неуказанные среды и реагенты также могут давать удовлетворительные результаты, изменение ATCC и/или протоколов, рекомендованных депозитором, может повлиять на извлечение, рост и/или функцию продукта. Если используется альтернативный состав среды или реагент, гарантия жизнеспособности ATCC больше не действует. За исключением случаев, прямо указанных в настоящем документе, не предоставляются никакие другие гарантии любого рода, явные или подразумеваемые, включая, помимо прочего, любые подразумеваемые гарантии товарного состояния, пригодности для определенной цели, производства в соответствии со стандартами cGMP, типичности, безопасности, точности. и/или отсутствие нарушений.

Этот продукт предназначен только для лабораторных исследований. Он не предназначен для терапевтического использования на животных или людях, для потребления человеком или животными или для любого диагностического использования. Любое предлагаемое коммерческое использование запрещено без лицензии ATCC.

Несмотря на то, что ATCC прилагает разумные усилия для включения точной и актуальной информации в это описание продукта, ATCC не дает никаких гарантий или заявлений относительно ее точности.Цитаты из научной литературы и патентов приводятся только в ознакомительных целях. ATCC не гарантирует, что такая информация была подтверждена как точная или полная, и клиент несет исключительную ответственность за подтверждение точности и полноты любой такой информации.

Этот продукт отправляется при условии, что покупатель несет ответственность и принимает на себя все риски и ответственность в связи с получением, обращением, хранением, утилизацией и использованием продукта ATCC, включая, помимо прочего, принятие всех соответствующих мер безопасности и манипуляций для минимизации риск для здоровья или окружающей среды.В качестве условия получения материала клиент соглашается с тем, что любая деятельность, предпринятая с продуктом ATCC, а также любым потомством или модификациями, будет осуществляться в соответствии со всеми применимыми законами, правилами и рекомендациями. Этот продукт предоставляется «КАК ЕСТЬ» без каких-либо заверений или гарантий, за исключением случаев, прямо указанных в настоящем документе, и ни при каких обстоятельствах ATCC, ее материнские компании, дочерние компании, директора, должностные лица, агенты, сотрудники, правопреемники, правопреемники и аффилированные лица не несут ответственности за косвенные , специальные, случайные или косвенные убытки любого рода в связи или в результате использования покупателем продукта.Несмотря на то, что прилагаются разумные усилия для обеспечения подлинности и надежности депонируемых материалов, ATCC не несет ответственности за ущерб, возникший в результате неправильной идентификации или искажения таких материалов.

Дополнительные сведения об использовании этого продукта см. в соглашении о передаче материала (MTA). MTA доступен на сайте www.atcc.org.

границ | Функциональная характеристика кластера генов клеточного деления бесстеночной бактерии Mycoplasma genitalium

Введение

Деление клеток играет центральную роль в жизни всех прокариотических и эукариотических организмов и требует скоординированного действия множества белков и регуляторных цепей.У бактерий большинство генов, необходимых для цитокинеза и биосинтеза стенки пептидогликана, кодируются в кластере генов деления и клеточной стенки ( dcw ). Организация и длина кластера генов dcw исключительно консервативны у филогенетически отдаленных видов. В качестве исключения, несколько генов, лежащих в кластере генов dcw грамотрицательных и грамположительных палочек, расположены в другом месте хромосомы у грамположительных кокков (Pucci et al., 1997). На основании этого наблюдения была предложена связь между структурой кластера генов dcw и морфологией клеток.Механизм, лежащий в основе этих отношений, который включает котрансляционную сборку белковых комплексов, участвующих в клеточном делении, называется геномным каналированием (Mingorance et al., 2004). В микоплазмах кластер генов dcw обычно ограничен четырьмя генами: mraZ , mraW , MG_223 и ftsZ (рис. 1А; Alarcón et al., 2007). Микоплазмы филогенетически родственны грамположительным бактериям, но они утратили гены биосинтеза пептидогликана в результате обширной редукции генома.Хотя клетки микоплазмы обычно имеют сферическую форму, наличие у некоторых видов верхушечной структуры, способствующей цитоадгезии, приводит к удлиненной колбовидной морфологии.

Рисунок 1 . Обзор организации кластера генов dcw у выбранных бактерий. Схема, изображающая кластер генов dcw трех репрезентативных видов рода Firmicutes (A) . Bacillus subtilis (17 генов, 18,9 т.п.н.), Staphylococcus aureus (девять генов, 10.7kb) и Mycoplasma genitalium (четыре гена, 3,7kb). (B) Схема кластера генов клеточного деления у различных мутантов M. genitalium , созданных в этом исследовании. Промоторная область гена mraZ (P _mraZ ) была охарактеризована в предыдущем сообщении (Benders et al., 2005). Маркеры tetM или cat (желтые) вводили для отбора предполагаемых мутантов.

Функция mraZ и mraW , первых двух генов кластера генов dcw , оставалась неясной в течение многих лет.Всестороннее исследование Escherichia coli показало, что MraZ является репрессором транскрипции, который контролирует свою собственную экспрессию и экспрессию других генов кластера генов dcw (Eraso et al., 2014). В том же исследовании авторы обнаружили, что MraZ связывается с консервативными последовательностями, обозначенными как MraZ-боксы, в восходящей области кластера генов dcw . Возможно, неожиданно, что потеря MraZ не была связана с каким-либо явным фенотипом у этой модельной бактерии. Несмотря на это, был обнаружен антагонистический эффект между MraZ и MraW.MraW представляет собой РНК-метилтрансферазу, нацеленную на 16S рибосомную РНК (Kimura and Suzuki, 2010). Характеристика мутанта mraW в E. coli продемонстрировала измененную инициацию, отличную от AUG, и сниженную точность трансляции, что позволяет предположить, что MraW может играть роль в выборе стартового кодона и распознавании классических кодонов STOP. Мутанты Staphylococcus aureus , mraW также демонстрируют аномальную точность трансляции наряду со сниженной скоростью роста и повышенной чувствительностью к окислительному стрессу (Kyuma et al., 2015). Совсем недавно было обнаружено, что белок MraW также метилирует ДНК и изменяет экспрессию генов в E. coli (Xu et al., 2019). Следует отметить, что потеря MraW увеличивает экспрессию MraZ, что поддерживает антагонистическую активность между этими двумя белками, описанную ранее (Eraso et al., 2014; Xu et al., 2019).

Напротив, функция предкового гомолога тубулина, FtsZ, установлена ​​гораздо лучше. FtsZ полимеризуется и деполимеризуется посредством гидролиза GTP и образует кольцеобразную структуру в средней клетке, известную как Z-кольцо, которая впоследствии сжимается во время разделения (Adams and Errington, 2009; Busiek and Margolin, 2015).Z-кольцо рекрутирует белки клеточного деления и ферменты, синтезирующие септальный пептидогликан, к месту деления и составляет каркас бактериальной дивисомы (Errington et al., 2003). У E. coli FtsA является первым известным белком, рекрутируемым в септальное кольцо, и он важен для стабильности FtsZ (Vicente and Rico, 2006). Следует отметить, что соотношение FtsZ и FtsA имеет решающее значение для правильного функционирования аппарата клеточного деления (Dai and Lutkenhaus, 1992; Dewar et al., 1992). Действительно, недавно было продемонстрировано, что деление клеток грамположительной бактерии Bacillus subtilis опосредуется филаментами FtsZ и FtsA, которые движутся по окружности вокруг делительного кольца, управляя движением ферментов, синтезирующих пептидогликаны (Bisson-Filho). и др., 2017).

Из-за своей ключевой роли в клеточном делении экспрессия FtsZ контролируется на множестве уровней (Robin et al., 1990). Точно так же формирование и локализация септального кольца строго регулируются (Vicente et al., 1998). Сложная регуляция, наблюдаемая в кластере генов dcw , играет фундаментальную биологическую роль, и, соответственно, диссоциация экспрессии ftsZ от его естественных регуляторных сигналов приводит к важным изменениям в физиологии клеточного деления. Однако до сих пор очень мало известно о факторах, контролирующих экспрессию, локализацию и функцию FtsZ в микоплазмах. Кластер генов клеточного деления имеет оперонную структуру у Mycoplasma genitalium и близкородственных видов Mycoplasma pneumoniae (Benders et al., 2005). С другой стороны, N-концевая область FtsZ из Mycoplasma pulmonis может функционировать для клеточного деления в супрессорных штаммах E. coli при условии замены C-концевого хвоста (Osawa and Erickson, 2006). Кроме того, у Mycoplasma hominis протофиламенты FtsZ могут образовывать спиральные структуры, сходные с Z-спиралями B. subtilis и E. coli , что также указывает на функциональную роль FtsZ в клеточном делении (Vishnyakov et al., 2009). ).Недавние данные также предполагают, что стабильность FtsZ контролируется протеазой Lon в M. pneumoniae (Burgos et al., 2020).

Примечательно, что хотя ген ftsZ необходим для большинства бактерий (Beall and Lutkenhaus, 1991; Dai and Lutkenhaus, 1991), он необязателен для производных с дефицитом клеточной стенки некоторых грамположительных и грамотрицательных бактерий, известных как L -формы (Мерсье и др., 2014). Точно так же бактерии из Planctomycetes и надфиля Chlamydiae лишены белка FtsZ (Pilhofer et al., 2008). В предыдущем исследовании наша лаборатория продемонстрировала, что ftsZ не являются существенными для роста in vitro M. genitalium (Lluch-Senar et al., 2010), поднимая важные вопросы относительно сохранения ftsZ . в микоплазмах. В соответствии с этим, другие виды, филогенетически родственные M. genitalium , такие как Mycoplasma mobile или Ureaplasma urealyticum , не кодируют гомолог гена ftsZ (Glass et al., 2000; Джаффе и др., 2004). Итак, какова роль генов клеточного деления в микоплазмах? Мы рассмотрели этот вопрос, сконструировав и охарактеризовав несколько мутантов клеточного деления у бактерии с редуцированным геномом M. genitalium .

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и культуральные условия

Все штамма M. genitalium выращивали в бульоне SP-4 при 37°C в атмосфере с 5% CO ₂ в колбах для тканевых культур. Готовили чашки SP-4, добавляя в среду 0.8% агар (BD). Для отбора мутантов добавляли хлорамфеникол (17 мкг мл ^-1 ) или тетрациклин (3 мкг мл ^-1 ). Все штамма M. genitalium , использованные в этой работе, перечислены в дополнительной таблице S1. Штамм XL-1 Blue Escherichia coli использовали для клонирования и размножения плазмиды. Штамм выращивали в чашках с агаром Luria Bertani (LB) или LB, содержащих 100 мкг мл ^-1 ампициллина, 40 мкг мл ^-1 X-Gal и 24 мкг мл ^-1 изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) при необходимости. .

Манипуляции с ДНК

получали с использованием набора 5Prime. Продукты ПЦР очищали из агарозных гелей с использованием геля Nucleospin и набора для очистки ПЦР (Macherey-Nagel) и при необходимости расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами (Fermentas). Все праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S2. Плазмиды для трансформации M. genitalium получали с использованием набора GenElute HP Midiprep (Sigma).

Создание и скрининг мутантов

Подробное объяснение методологии, включая праймеры и плазмиды, использованной для создания различных мутантов, созданных в этом исследовании, представлено в дополнительных материалах.Целостность хромосомы в мутантных штаммах, кроме предполагаемых делеций, была оценена и подтверждена секвенированием всего генома (WGS; дополнительная таблица S3). Трансформацию M. genitalium проводили, как описано ранее (Torres-Puig et al., 2015). Скрининг мутантов проводили с использованием клеточных лизатов в качестве матрицы для ПЦР или реакций секвенирования. Клеточные лизаты получали центрифугированием 1,5 мл клеточных культур, разрушением осадка с использованием 30 мкл лизирующего буфера (Tris-HCl 0.1M pH 8,5, Tween-20 0,05% и протеиназа K 0,25 мг/мл ^-1 ) и инкубация в течение 1 часа при 37°C с последующей инактивацией при 95°C в течение 10 минут.

Секвенирование ДНК

проводили с использованием набора BigDye® v3.1 Cycle Sequencing с использованием 2,5 мкл геномной ДНК или лизата M. genitalium в соответствии с инструкциями производителя. Все реакции были проанализированы на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130xl в Servei de Genòmica i Bioinformàtica (UAB).

Количественная оценка скорости роста

Скорость роста М.Genitalium определяли с использованием адаптированного колориметрического протокола, описанного Karr et al. (2012). Штаммы выращивали до средней логарифмической фазы в 25-см колбах ² с 5 мл SP4. Прикрепленные клетки соскабливали, извлекали центрифугированием при 12000 об/мин и ресуспендировали в 3 мл свежего SP4. Затем 300 мкл клеточной суспензии инокулировали в четыре разные лунки 96-луночного планшета. Каждая из этих лунок представляет собой первый образец из четырех технических повторов. Около 100 мкл первой лунки (образец 1) инокулировали в следующую лунку (образец 2), уже содержащую 200 мкл свежего SP4, тем самым разбавляя 1/3 исходной концентрации.Этот процесс повторяли еще четыре раза (образцы 3, 4, 5 и 6), достигая конечного разведения 1/243. 96-луночный планшет заклеивали прозрачной лентой, помещали в устройство для считывания микропланшетов Tecan Sunrise Absorbance (Tecan) и инкубировали при 37°C в течение 7 дней. По мере роста M. genitalium бактериальный метаболизм подкисляет культуральную среду, изменяя цвет индикатора фенолового красного с красного (рН 7,8) на желтый (рН 6), что определяли путем измерения поглощения при 550 нм. Для каждого анализа показания снимались каждые 30 минут в течение 8 дней (всего 400 показаний на лунку).Показания были сохранены в таблице данных Excel и проанализированы после завершения эксперимента, и для каждого разведения была построена кривая, и была определена точка перегиба. Затем точки перегиба были нанесены на график с использованием логарифма Напьера разведения в качестве координаты × для каждого разведения. После того, как все точки перегиба были нанесены на график, наклон ( μ , константа скорости роста) был выведен с помощью линейной регрессии, и было получено время удвоения ( g ) в соответствии с общим уравнением для экспоненциального роста бактерий [ g = ln2/(1/ μ )].

РНК-Seq

РНК-Seq был выполнен, как описано ранее (Torres-Puig et al., 2018; Martínez-Torró et al., 2020). Культуры M. genitalium в средней логарифмической фазе соскабливали в 1 мл свежей среды SP-4 и повторно засевали в две новые 25-сантиметровые колбы для тканевых культур ² со свежей средой SP-4 на 6 часов. Затем клетки лизировали и выделяли тотальную РНК с помощью набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen). Библиотеки РНК готовили с помощью набора для подготовки библиотеки полных РНК TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit (Illumina) и анализировали с использованием системы HiSeq 3000 (Illumina) в отделе геномики Центра геномной регуляции (CRG), Барселона.Кластеры кДНК иммобилизовали на дорожках секвенирования 2×50 прочтений. Обратные и комплементарные были вычислены для последовательностей, исходящих из праймера Read1. Анализ данных и выравнивание последовательностей выполняли с использованием Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012) в режиме End-to-End и парных концов вперед-вперед. Последовательности были собраны с использованием SAMtools (Li et al., 2009) без ограничения количества последовательностей в выравнивании. Подсчеты в различных ORF проводились с помощью автономной версии программы featureCounts (Liao et al., 2014) без подсчета операций чтения с несколькими сопоставлениями и отключения операций чтения с несколькими перекрытиями.

подсчитанных признаков были отправлены в пакет R/Bioconductor DESeq2 (Love et al., 2014) для статистического анализа. В анализе DESeq2 использовались параметрический тип fitType и нормальный априорный коэффициент с нулевым средним значением для непересекающихся коэффициентов. Данные были отсортированы по кратности log2, а статистическая значимость была установлена ​​на уровне общего порогового значения p <0,05. Были проанализированы три независимых биологических повтора каждого штамма или состояния.

кОТ-ПЦР

РНК экстрагировали из среднелогарифмических культур M. genitalium с использованием набора RNAqueous Kit (Thermo Fisher Scientific), а затем обрабатывали турбо-ДНКазой (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Обратную транскрипцию выполняли с помощью обратной транскриптазы iScript (Bio-Rad) и случайных праймеров, как описано ранее (Torres-Puig et al., 2015). Праймеры, используемые для количественной ПЦР, перечислены в дополнительной таблице S2 и были разработаны с использованием программного обеспечения Primer3.количественную ПЦР выполняли с использованием полимеразы iTaq (Bio-Rad) и зеленого SYBR на приборах для ПЦР CFX96 или CFX384 (Bio-Rad). Относительную экспрессию генов рассчитывали по методу Пфаффла (Pfaffl, 2001). Дифференциальную экспрессию генов оценивали на основе общего произвольного 2-кратного отсечения. Данные, представленные в рукописи, соответствуют анализу РНК, выделенных из трех независимых биологических повторов.

Количественная оценка содержания белка

Различия в относительном содержании белка оценивали с помощью мечения стабильными изотопами аминокислот в клеточной культуре (SILAC).С этой целью культуры M. genitalium выращивали до средней логарифмической фазы в 25-сантиметровых колбах ² на среде Хейфлика с 15 мМ легкого ( ¹² С) или тяжелого ( ¹³ С) лизина. После выращивания клетки разделяли (1:10) и культивировали в тех же условиях. Затем клетки промывали PBS, соскабливали и осадки хранили при -80°С. Белковые лизаты готовили, как описано ранее (Sabidó et al., 2012). Количественное определение белка проводили с использованием набора для анализа белков Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific), белковые экстракты культур на тяжелых и легких средах смешивали в соотношении 1:1.Затем образцы восстанавливали дитиотреитом (150 нмоль, 1 ч, 37°С) и алкилировали в темноте йодацетамидом (300 нмоль, 30 мин, 25°С). Полученный белковый экстракт разбавляли на 1/3 200 мМ NH ₄ HCO ₃ и расщепляли 5 мкг LysC (Wako) в течение ночи при 37°C. Наконец, смесь пептидов подкисляли муравьиной кислотой и обессоливали с помощью самодельной колонки Empore C18 (3M, Сент-Пол, Миннесота, США; Rappsilber et al., 2007). Образцы анализировали с использованием масс-спектрометра LTQ-Orbitrap Velos Pro (Thermo Fisher Scientific, Сан-Хосе, Калифорния, США), соединенного с EasyLC [Thermo Fisher Scientific (Proxeon), Оденсе, Дания].Пептиды наносили непосредственно на аналитическую 25-сантиметровую колонку с внутренним диаметром 75 мкм, заполненную частицами С18 размером 5 мкм (Nikkyo Technos Co. Ltd., Япония). Хроматографические градиенты начинались с 97% буфера А и 3% буфера В при скорости потока 250 нл/мин и постепенно увеличивались до 65% буфера А/35% буфера В в течение 360 мин. После каждого анализа колонку промывали в течение 10 минут 10% буфером А/90% буфером В. Буфер А: 0,1% муравьиной кислоты в воде. Буфер B: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле. Масс-спектрометр работал в режиме положительной ионизации с напряжением нанораспыления, равным 2.2кВ и температура источника 250°C. Ultramark 1621 для масс-анализатора FT использовался для внешней калибровки перед анализом. Кроме того, была также выполнена внутренняя калибровка с использованием сигнала фонового полисилоксанового иона при m / z 445,1200. Прибор работал в режиме сбора данных, зависящего от данных (DDA), и использовались полные МС-сканы с одним микросканированием с разрешением 60 000 в диапазоне масс 94 542 m 94 543 / 94 542 z 94 543 350–2 000 с обнаружением в орбитальной ловушке.Автоматический контроль усиления (AGC) был установлен на 10 ⁶ , и были выполнены динамическое исключение (60 с) и фильтрация состояния заряда, исключающая однозарядные пептиды. В каждом цикле DDA-анализа, после каждого сканирования обзора, 10 наиболее интенсивных ионов с несколькими заряженными ионами выше порогового количества ионов 5000 были отобраны для фрагментации при нормализованной энергии столкновения 35%. Спектры фрагментарных ионов, полученные в результате диссоциации, индуцированной столкновением (CID) , были получены в ионной ловушке, AGC была установлена ​​​​на 5e ⁴ с окном изоляции 2.0 m / z , время активации 0,1 мс и максимальное время впрыска 100 мс. Все данные были получены с помощью программного обеспечения Xcalibur v2.2. Программный пакет MaxQuant (v1.4.0.5) использовали для идентификации пептидов и количественного определения белков SILAC (Cox and Mann, 2008). Поиск данных проводился в собственной базе данных, содержащей все 94 542 белка M. genitalium 94 543.

Сканирующая электронная микроскопия

Культуры Mycoplasma genitalium выращивали до средней логарифмической фазы на покровных стеклах.Образцы фиксировали, обезвоживали и сушили до критической точки, как описано ранее (Pich et al., 2008). Затем на покровные стекла напыляли золото и исследовали в сканирующем электронном микроскопе (SEM) Merlin (Zeiss). СЭМ-микрофотографии анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ для определения частоты деления клеток. С этой целью мы определили количество терминальных органелл (ТМО) на клетку. Поскольку клетки микоплазмы дублируют структуру кончика во время клеточного деления, клетки с одной ТМО были классифицированы как неделящиеся, а клетки с двумя или более ТМО были классифицированы как делящиеся.С другой стороны, мы измерили длину одиночных клеток от кончика ТМО до противоположного полюса. Кроме того, определяли длину цитокинетических клеток, измеряя расстояние от кончика одной ТМО до кончика противоположной ТМО. Для этого анализа рассматривались только клетки с одной ТМО на каждом клеточном полюсе.

Фазово-контрастная и флуоресцентная микроскопия

Клетки Mycoplasma genitalium выращивали в фильтрованной среде SP-4 (0,22 мкм) на предметных стеклах камеры IBIDI в течение 16 часов, один раз промывали 1×PBS и визуализировали на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TE 2000-E.Для анализа неприлипающего мутанта mg191ftsZCh предметные стекла камеры IBIDI предварительно обрабатывали 0,2 мг/мл раствором гидробромида поли- L -лизина (Sigma-Aldrich), что обеспечивало прилипание к поверхности. Кроме того, клетки пропускали 10 раз через шприц 25 размера для разрушения агрегатов. При необходимости добавляли Hoechst 33342 0,01 мг/мл ^-1 . Все штаммы выращивали и визуализировали в одинаковых условиях. Фазовый контраст, усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и эпифлуоресцентные изображения TRITC были получены с помощью камеры Nikon Digital Sight DS-SMC, управляемой программным обеспечением NIS-Elements BR.Изображения анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ и подключаемого модуля GDSC.

Результаты

Делеция кластера генов всего клеточного деления

Ранее мы продемонстрировали, что ген ftsZ является несущественным у M. genitalium (Lluch-Senar et al., 2010). Основываясь на этом открытии, мы предположили, может ли весь кластер генов клеточного деления быть необязательным для этой бесстеночной бактерии. Чтобы убедиться в этом, мы заменили четыре гена кластера генов клеточного деления M.genitalium по маркеру устойчивости к хлорамфениколу (рис. 1В). Мы восстановили несколько трансформантов, устойчивых к хлорамфениколу, и подтвердили делецию всего кластера генов (3,7 т.п.н.) с помощью ПЦР и секвенирования. Мы обнаружили, что время удвоения полученного мутанта dcw было значительно больше (10,13 ± 0,33 ч), чем у штамма дикого типа (8,38 ± 0,28 ч; рис. 2А). Кроме того, анализ СЭМ выявил повышенную частоту деления клеток у мутанта dcw (30.53%) по сравнению со штаммом дикого типа (13,35%; рис. 2В).

Рисунок 2 . Анализ приспособленности клеток штамма дикого типа и нескольких мутантов M. genitalium . Темпы роста (A) и процент клеток в делении (B) различных мутантов M. genitalium кластера генов клеточного деления. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Стьюдента t и значения p значимых значений ( p <0.05) указывается над каждой точкой данных. Анализировали в среднем 900 клеток для каждого штамма (C) . График, изображающий длину одиночных или цитокинетических клеток. Измеряли в среднем 320 клеток для каждого штамма.

Характеристика мутантов клеточного деления

Чтобы проанализировать и лучше понять фенотип мутанта dcw , мы создали штаммы, дефектные по каждому гену кластера генов клеточного деления путем аллельного обмена.Во-первых, мы получили мутанты для генов MG_223 и ftsZ , используя для селекции маркер устойчивости к хлорамфениколу (рис. 1В; дополнительный материал). Наши анализы показали, что скорость роста мутанта ftsZ (8,29 ± 0,09 ч) была сравнима со скоростью роста штамма дикого типа (8,38 ± 0,28 ч; рис. 2А). Напротив, время дублирования мутанта MG_223 значительно увеличилось (9,80 ± 0,56 ч). СЭМ-анализ выявил повышенную частоту деления клеток у обоих мутантных штаммов ( ftsZ , 22.44%; MG_223, 29,15%; Рисунок 2Б).

Затем мы создали мутантов, лишенных либо mraZ , либо mraW . В этом случае, чтобы сохранить оперонную структуру кластера генов, маркер устойчивости к антибиотикам был помещен на 5′-конце UTR mraZ (рис. 1B; дополнительный материал). В целях контроля мы также создали эталонный штамм, обозначенный mraREF , несущий селектируемый маркер в том же месте хромосомы, но с интактным кластером генов клеточного деления (рис. 1В; дополнительный материал).Клетки штамма mraREF росли с такой же скоростью (8,81 ± 0,29 ч), что и клетки штамма дикого типа (8,38 ± 0,28 ч; рис. 2А). Однако время удвоения значительно увеличилось при потере MraZ (11,54 ± 0,38 ч). Клетки нулевого мутанта mraW удваивались с меньшей скоростью (9,96 ± 0,53 ч), что указывает на то, что отсутствие MraW также вредно для роста. Все полученные мутантные штаммы были исследованы с помощью ресеквенирования генома на наличие мутаций, отличных от тех, которые были введены в результате генетических манипуляций.Во всех проанализированных штаммах не было обнаружено серьезных перестроек генома, таких как крупные делеции или транслокации. Однако все штаммы показали наличие небольших вариантов, таких как SNP или INDELS, с разной частотой. Многие из этих вариантов были также идентифицированы в штамме G37. Все новые варианты были обнаружены в рекомбиногенных вариабельных повторяющихся областях, причем большинство из них находились в некодирующих участках генома, что подтверждает отсутствие дополнительных мутаций, которые могли повлиять на фенотип штаммов dcw (дополнительный материал).

Анализы с помощью сканирующей электронной микроскопии выявили небольшое увеличение частоты деления клеток у мутанта mraW (19,0%) по сравнению со штаммами дикого типа (13,35%) или штаммами mraREF (12,99%; рис. 2B). . Примечательно, что частота делящихся клеток, обнаруженная у мутанта mraZ , была заметно высокой (38,44%). Более того, мы наблюдали, что цитокинетические клетки мутанта mraZ были заметно удлинены (рис. 3А, В). Количественный анализ подтвердил, что клетки в цитокинезе мутанта mraZ были длиннее (1.651 ± 0,372 мкм, n = 96), чем у штамма дикого типа (1,118 ± 0,177 мкм, n = 24; рис. 2C). Напротив, анализ других мутантов клеточного деления, полученных в этом исследовании, не выявил морфологических изменений в цитокинетических клетках (рис. 2С).

Рисунок 3 . Характеристика клеточной морфологии мутанта mraZ . Сканирующие электронные микрофотографии штамма дикого типа (A) и мутанта mraZ (B) .Белые стрелки указывают на некоторые клетки в цитокинезе.

Транскрипционный анализ кластера генов клеточного деления в различных мутантных фонах

Предыдущие исследования E. coli показали, что MraZ является репрессором транскрипции (Eraso et al., 2014). Поэтому мы провели полногеномный анализ транскрипции M. genitalium с помощью RNA-Seq для выявления транскрипционных изменений у мутанта mraZ (таблица 1). Наши транскриптомные данные показали, что mraW , ftsZ и ген MG_223 значительно активировались в отсутствие MraZ.Напротив, транскрипция практически не изменялась как у мутанта mraW , так и у контрольного штамма mraREF . Анализы qRT-PCR подтвердили повышенную экспрессию генов клеточного деления в отсутствие MraZ (рис. 4). Чтобы подтвердить, что измененная экспрессия гена, наблюдаемая у мутанта mraZ , была связана с потерей белка MraZ, мы повторно ввели эктопическую копию гена mraZ под контролем его нативного промотора. Следует отметить, что несколько попыток комплементации с кодируемой транспозоном копией гена mraZ , отдельно или в комбинации с mraW , оказались безуспешными.Однако вставка гена mraZ в конце кластера генов клеточного деления у мутанта mraZ восстановила уровни транскрипции mraW , ftsZ и гена MG_223 (рис. 4; дополнительная фигура S1). С другой стороны, мы также оценили транскрипцию кластера генов клеточного деления в мутантном штамме, лишенном гена mg191 , который кодирует главный цитоадгезин P140 M. genitalium . Клетки мутанта mg191 являются плеоморфными и растут в суспензии в виде крупных клеточных агрегатов (Burgos et al., 2006). Этот неприлипающий мутант был проанализирован, чтобы пролить свет на связь между клеточным делением и прилипанием M. genitalium . В этом смысле в предыдущем исследовании (Lluch-Senar et al., 2010) мы показали, что, в отличие от клеток WT, мутант ftsZ не может генерировать неадгезивные варианты. Основываясь на этом наблюдении, мы предположили, что неприлипающие мутанты полагаются исключительно на кластер клеточного деления для деления. Примечательно, что анализ транскрипции мутанта mg191 выявил значительную активацию кластера генов клеточного деления (рис. 4).

Таблица 1 . Транскрипционные изменения у мутантов mraZ и mraW с помощью RNA-Seq.

Рисунок 4 . Транскрипционный анализ кластера генов клеточного деления нескольких мутантов M. genitalium с помощью qRT-PCR. Транскрипционные изменения кластера генов клеточного деления у mraREF мутанта (A) или mraZ , mraW и mg191 мутантов (B) по сравнению со штаммом дикого типа.Столбцы представляют собой среднее log2-кратное изменение по меньшей мере трех независимых биологических повторов. Статистическую значимость оценивали с использованием критерия Стьюдента t , и значение p биологически значимых значений (log2±1) указано над соответствующей полосой, если оно значимо (значение p <0,05).

Анализ протеома мутантов

Затем мы задались вопросом, сохраняются ли транскрипционные изменения, наблюдаемые у нулевого мутанта mraZ , на уровне белка.С этой целью мы определили профиль протеома мутанта mraZ с помощью SILAC (дополнительные таблицы S4 и S5). Наши анализы продемонстрировали заметное увеличение клеточных уровней MraW (в 14,3 раза) и FtsZ (в 25 раз; таблица 2). Точно так же экспрессию белка MG_223 можно было обнаружить только при отсутствии MraZ.

Таблица 2 . Сравнительный анализ обилия белков клеточного деления у штамма дикого типа и мутантов mraZ и mraW методом мечения стабильными изотопами аминокислотами в культуре клеток (SILAC).

Мы также исследовали наличие протеомных изменений у мутанта mraW (дополнительные таблицы S6 и S7). Мы обнаружили, что несколько белков, в том числе ряд ДНК- и РНК-метилтрансфераз, по-разному экспрессировались в отсутствие MraW. Поскольку эти изменения содержания белка не сопровождались изменениями уровней мРНК, мы ожидаем, что MraW может модулировать экспрессию белка на посттранскрипционном уровне. Следует отметить, что мы обнаружили, что уровни белка FtsZ были несколько выше (в 2 раза) у мутанта mraW (табл. 2).

Выражение FtsZ и динамика локализации

Предыдущие попытки в нашей лаборатории контролировать экспрессию FtsZ в M. genitalium с использованием флуоресцентных маркеров не увенчались успехом. В этих исследованиях мы охарактеризовали мутантные штаммы, несущие слияние ftsZ — mcherry в его нативном локусе, то есть на 3′-конце кластера генов клеточного деления (рис. 5). Предположительно, экспрессия FtsZ была слишком низкой, чтобы можно было обнаружить флуоресцентное слияние в одиночных клетках.Однако мы предположили, что повышенный уровень экспрессии FtsZ, наблюдаемый у мутанта mraZ , может способствовать визуализации этого белка в живых клетках. Поэтому мы оценили экспрессию FtsZ-mCherry в клетках, лишенных MraZ (дополнительный материал), и обнаружили большое количество (56,63%) флуоресцентных клеток, хотя и в разной степени (рис. 5). Присутствие нефлуоресцентных клеток предполагает, что экспрессия и сборка FtsZ находятся под контролем других факторов, помимо MraZ (Burgos et al., 2020). Отдельно мы оценили экспрессию FtsZ в отсутствие MraW и обнаружили, что небольшая часть клеток (1,58%) проявляла флуоресценцию mCherry (рис. 5). Этот результат согласуется с повышенным количеством FtsZ, идентифицированным в мутанте mraW с помощью протеомного анализа. С другой стороны, мы проверили, было ли видно слияние FtsZ-mCherry в мутанте адгезина P140. В соответствии с данными транскрипции мы заметили, что некоторые клетки демонстрируют заметную флуоресценцию, связанную с FtsZ (рис. 5).

Рисунок 5 . Анализ отдельных клеток экспрессии FtsZ у различных мутантов M. genitalium . Изображения флуоресцентной микроскопии, показывающие локализацию FtsZ-mCherry в живых клетках штамма дикого типа, мутантов mraZ , mraW и mg191 . Каждая строка содержит фазовый контраст, канал TRITC и результирующее наложение соответственно. Масштабная линейка представляет 2 мкм. Все изображения показаны с одинаковым увеличением.

Детальный анализ мутанта mraZ показал, что фокусы FtsZ имеют полярное расположение.Следует отметить, что клетки M. genitalium являются полярными, поскольку они демонстрируют ТМО, способствующую цитоадгезии. По этой причине мы хотели проверить, локализованы ли очаги FtsZ совместно с TMO этой бактерии. С этой целью мы пометили P65, белок, локализующийся на дистальном конце TMO (Burgos et al., 2008). Введение флуоресцентного маркера eYFP в нативный локус P65 (MG_217) позволило идентифицировать острые очаги P65-eYFP, предоставив способ однозначно идентифицировать клеточный полюс, содержащий ТМО (рис. 6).Мы обнаружили, что FtsZ сгруппирован на клеточном полюсе, противоположном P65, в клетках, демонстрирующих одиночный фокус P65. Это важно, потому что, поскольку клетки микоплазмы дублируют ТМО до цитокинеза (Miyata and Seto, 1999), некоторые клетки демонстрируют два отдельных фокуса P65. Кроме того, мы заметили, что интенсивность и локализация очагов FtsZ менялись в течение цикла клеточного деления. На основании локализации двух меченых белков (FtsZ и P65) и хромосомы, окрашенной Hoechst 33258, мы определили восемь различных стадий клеточного цикла (рис. 7).Неделящиеся клетки (стадия 1) имеют один фокус P65, а сигнал FtsZ слабый. Со временем FtsZ рекрутируется на клеточном полюсе, противоположном ТМО (стадия 2). Перед цитокинезом вблизи ранее существовавшего очага формируется новый очаг Р65 (стадия 3). Затем один из этих очагов Р65 мигрирует к противоположному клеточному полюсу и локализуется вблизи очага FtsZ (стадия 4). Затем, вероятно, совпадая с сегрегацией хромосом, FtsZ покидает полярное положение и перемещается в среднюю клетку, образуя диффузную полосу (стадия 5). По мере развития цитокинеза сигнал FtsZ снижается (стадия 6), а в дочерних клетках появляются небольшие фокусы FtsZ с маргинальной флуоресценцией (стадия 7).Наконец, происходит разделение дочерних клеток и исчезновение сигнала FtsZ (стадия 8), но вскоре после этого начинается накопление FtsZ в теле клетки (стадия 1).

Рисунок 6 . Анализ отдельных клеток FtsZ, P65 и локализации хромосом у мутанта mraZ . Анализ флуоресцентной микроскопии, показывающий FtsZ-mCherry, P65-eYFP и локализацию хромосом в живых клетках M. genitalium . На каждой панели показаны изображения TRITC, 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и eYFP или комбинация трех каналов и фазового контраста.Масштабная линейка представляет 2 мкм. Все изображения показаны с одинаковым увеличением.

Рисунок 7 . Динамика локализации FtsZ на протяжении клеточного цикла M. genitalium . Схема, изображающая различные стадии клеточного цикла M. genitalium , основанная на локализации очагов FtsZ относительно терминальной органеллы (ТМО) и хромосомы. В этой модели FtsZ накапливается в теле клетки (1) и кластеризуется на полюсе клетки, противоположном ТМО (2). Затем TMO дублируется (3) и один TMO перемещается к противоположному полюсу ячейки (4).Далее фокусы FtsZ перемещаются в среднюю клетку (5). Наконец, начинается цитокинез (6), и сигнал FtsZ снижается (7), пока процесс не завершится (8).

Обсуждение

Микоплазмы — бесстеночные бактерии, которые делятся бинарным делением. Пока что факторы, опосредующие и координирующие клеточное деление у этих бактерий с редуцированным геномом, плохо изучены. Как правило, кластер генов клеточного деления микоплазм включает четыре гена, в том числе ftsZ . У бактерий со стенками хорошо известно, что FtsZ управляет синтезом пептидогликана в месте деления (Bisson-Filho et al., 2017). Однако сохранение в микоплазмах FtsZ и других белков, связанных с клеточным делением, таких как MraZ или MraW, вызывает недоумение. В этом исследовании мы сконструировали и охарактеризовали несколько мутантов клеточного деления M. genitalium . Мы обнаружили, что делеция mraZ индуцирует сильную активацию других генов кластера генов клеточного деления. Следовательно, наши результаты показывают, что MraZ действует как репрессор транскрипции. Это открытие хорошо коррелирует с данными протеомики, показывающими, что белки MraW, FtsZ и MG_223 сверхэкспрессируются в отсутствие MraZ.В целом, наши результаты подтверждают репрессорную роль MraZ, ранее задокументированную Eraso et al. (2014). В отличие от E. coli , истощение MraZ в M. genitalium приводит к четкому фенотипу. Мутант mraZ демонстрирует значительную задержку роста, важные морфологические изменения и высокую частоту клеток, застрявших в цитокинезе. Эти данные показывают, что экспрессия белков клеточного деления M. genitalium на относительно высоких уровнях на протяжении клеточного цикла в значительной степени вредна.

Предыдущее исследование Mycoplasma gallisepticum показало, что сверхэкспрессия MraZ индуцирует характерное клеточное филаментирование (Fisunov et al., 2016), которое напоминает фенотип, описанный у mraZ мутанта M. genitalium . Более того, филаментация, описанная в M. gallisepticum , также была связана с повышенным уровнем FtsZ. В том же исследовании авторы определяют сайт связывания MraZ у Mollicutes, характеризующийся серией прямых повторов последовательности AAAGTG[T/G].Единственное появление этого мотива в хромосоме M. genitalium находится в промоторной области гена mraZ . Этот вывод согласуется с отсутствием транскрипционных изменений за пределами кластера генов клеточного деления у нашего мутанта mraZ . Следует отметить, что комплементация mraZ мутанта M. genitalium могла быть достигнута только в цис , т.е. повторная интродукция копии mraZ гена в эктопическом сайте внутри кластера генов клеточного деления.Этот результат показывает сложное взаимодействие между относительным расположением гена mraZ в хромосоме и активностью MraZ. В этом смысле наши результаты показывают, что репрессорная роль MraZ требует транскрипционной связи между геном mraZ , оператором MraZ и кластером генов клеточного деления.

С другой стороны, мы обнаружили, что культуры мутанта mraW росли медленнее, чем культуры штамма дикого типа. Что еще более важно, мы смогли обнаружить флуоресценцию FtsZ-mCherry в небольшой подгруппе клеток этого мутанта.Этот факт важен, поскольку мы не смогли обнаружить экспрессию FtsZ-mCherry на фоне дикого типа. Т.о., MraW может играть роль в регуляции экспрессии FtsZ у M. genitalium . Эта регуляция должна происходить на посттранскрипционном уровне, т.к. у мутанта mraW не было обнаружено транскрипционных изменений. В соответствии с этими данными наш протеомный анализ выявил небольшое повышение уровня FtsZ в отсутствие MraW. Следует отметить, что экспрессия FtsZ у мутанта mraW , как ожидается, будет низкой из-за репрессорной активности MraZ.Дифференциальная экспрессия нескольких метилтрансфераз у мутанта mraW также была заметна, что может представлять собой реакцию M. genitalium на потерю метилтрансферазной активности MraW. Существование видов с орфанными генами mraW подтверждает роль MraW, независимую от функции MraZ, в регуляции клеточного деления. Сообщалось, что MraW метилирует остаток C1402 16S рРНК (Kimura and Suzuki, 2010). Этот остаток участвует в инициации трансляции и ее мутации в E.coli приводит к увеличению времени удвоения (Jemiolo et al., 1985). Более того, потеря функции MraW напрямую связана с измененной точностью трансляции (Kyuma et al., 2015), метилированием ДНК и регуляцией экспрессии генов (Xu et al., 2019). Наши данные RNA-Seq от мутанта mraW позволяют предположить, что MraW не регулирует экспрессию генов у M. genitalium . Тем не менее, еще предстоит полностью выяснить, играет ли MraW роль в метилировании ДНК или рРНК у этой бактерии.

Повышенный уровень экспрессии FtsZ у мутанта mraZ позволил нам визуализировать этот белок в одиночных клетках и определить динамику FtsZ на протяжении клеточного цикла M. genitalium . Мы обнаружили, что FtsZ кластеризуется на клеточном полюсе, противоположном ТМО. Когда ТМО дублируются и мигрируют к противоположному клеточному полюсу, FtsZ-ассоциированные фокусы перемещаются к средней клетке. Интенсивность очагов FtsZ снижается, когда они достигают средней клетки и две хромосомы начинают разделяться.Этот паттерн убедительно свидетельствует о том, что FtsZ может играть активную роль в клеточном делении и способствует цитокинезу M. genitalium . Кроме того, локализация белка FtsZ во время клеточного цикла, по-видимому, строго регулируется. Хотя наличие системы Min (Lutkenhaus, 2007; Rowlett, Margolin, 2015) у микоплазм не описано, предполагается, что неидентифицированные регуляторные факторы ингибируют образование Z-кольца вблизи ТМО. Интересно, что M. genitalium кодирует белок, содержащий домен DivIVA (MG211), ключевой компонент системы Min B.subtilis (Эдвардс и Эррингтон, 1997). Кроме того, мы наблюдали, что фокусы FtsZ иногда располагались между двумя фокусами ДНК, указывая на то, что нуклеоидная окклюзия также имеет место в M. genitalium . В целом, отчетливая локализация белка FtsZ на протяжении клеточного цикла предполагает существование неизвестных факторов, регулирующих клеточное деление у этой бактерии с редуцированным геномом. Эти лежащие в основе регуляторные механизмы координируют процесс цитокинеза с сегрегацией хромосом (Seto and Miyata, 1999).

Результаты нашего исследования показывают, что кластер генов клеточного деления M. genitalium играет незначительную роль во время размножения in vitro клеток дикого типа. Это согласуется с предыдущими отчетами, показывающими, что подвижность, по-видимому, является основной силой, облегчающей цитокинез у M. pneumoniae , близкого родственного вида (Hasselbring et al., 2006). Несколько лет назад мы задокументировали, что делеция гена ftsZ отменила возникновение вариантов неприлипающей фазы у М.genitalium (Lluch-Senar et al., 2010). Эти неприлипающие варианты возникают с относительно высокой частотой и могут играть важную роль в уклонении от иммунного ответа во время инфекции (Burgos et al., 2018). Основываясь на этом наблюдении, мы предположили, что FtsZ может быть важен для клеточного деления в неприлипающих клетках M. genitalium . Следует отметить, что неадгезивные производные M. genitalium неподвижны, в значительной степени плеоморфны и растут в виде крупных клеточных агрегатов (Burgos et al., 2006). В текущем исследовании мы предоставляем доказательства того, что кластер генов клеточного деления активируется у неприлипающих мутантов M. genitalium . Это открытие согласуется с нашей предыдущей гипотезой, что FtsZ и образование рудиментарной дивисомы могут быть необходимы, когда скользящая подвижность невозможна. Таким образом, строгий паразитический образ жизни M. genitalium и изощренная стратегия ухода от иммунного надзора, вероятно, обусловливают сохранение кластера генов клеточного деления у этой бесстеночной бактерии.Примечательно, что большинство из видов Mycoplasma неподвижны, что также может обеспечивать сохранение генов клеточного деления. В поддержку этого представления недавний отчет продемонстрировал, что ftsZ важен для восстановления клеточной морфологии и эффективности клеточного деления в синтетических минимальных клетках (Pelletier et al., 2021).

Заявление о доступности данных

Первоначальные материалы, представленные в исследовании, общедоступны. Эти данные можно найти здесь: Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) База данных BioProject под номером доступа PRJNA750275.

Вклад авторов

CM-T, ST-P, ML-S, LS, EQ, JP и OQP способствовали разработке концепции и дизайна исследования. Эксперименты проводили CM-T, ST-P, MM-S, MH-R, CM-N, ML-S и OQP. CM-T и ST-P выполнили статистический анализ. CM-T и OQP написали первый черновик рукописи. ST-P, EQ и JP написали некоторые части рукописи. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантом BIO2017-84166-R от Ministryio de Ciencia, Innovación y Universidades.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

Благодарности

Мы благодарны сотрудникам Servei de Genòmica i Bioinformàtica (UAB), отделу геномики (CRG) и отделу протеомики (CRG) за проведение секвенирования по Сэнгеру, анализов RNA-Seq и SILAC соответственно. Кроме того, мы благодарны тезисному комитету CM-T и двум рецензентам этой рукописи за их полезные комментарии и конструктивное обсуждение. Наконец, CM-T и MM-S хотят признать стипендию PIF от UAB и стипендию FI для докторантов от Generalitat de Catalunya соответственно.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.695572/full#supplementary-material

Сокращения

СЭМ, Сканирующая электронная микроскопия, ТМО, Терминальные органеллы, WGS, Полногеномное секвенирование,

Ссылки

Аларкон, Ф., де Васконселос, А.Т.Р., Йим, Л., и Заха, А. (2007). Гены, участвующие в клеточном делении микоплазм. Жен. Мол. биол. 30, 174–181. дои: 10.1590/S1415-47572007000200003

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Билл, Б., и Луткенхаус, Дж. (1991). FtsZ в Bacillus subtilis необходим для вегетативного разделения и для асимметричного разделения во время спорообразования. Гены Дев. 5, 447–455. doi: 10.1101/gad.5.3.447

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бендерс, Г. А., Пауэлл, Б. К., и Хатчисон, К.А. (2005). Транскрипционный анализ консервативного кластера генов ftsZ у Mycoplasma genitalium и Mycoplasma pneumoniae . J. Бактериол. 187, 4542–4551. doi: 10.1128/JB.187.13.4542-4551.2005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Bisson-Filho, A.W., Hsu, Y.P., Squyres, G.R., Kuru, E., Wu, F., Jukes, C., et al. (2017). Беговая дорожка с помощью филаментов FtsZ стимулирует синтез пептидогликана и деление бактериальных клеток. Наука 355, 739–743. doi: 10.1126/science.aak9973

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бургос, Р., Пич, О. К., Феррер-Наварро, М., Бейсман, Дж. Б., Керол, Э., и Пиньоль, Дж. (2006). Mycoplasma genitalium Цитаадгезины P140 и P110 реципрокно стабилизируются и необходимы для клеточной адгезии и развития терминальных органелл. J. Бактериол. 188, 8627–8637. doi: 10.1128/JB.00978-06

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бургос, Р., Pich, O.Q., Querol, E., и Piñol, J. (2008). Делеция гена Mycoplasma genitalium MG_217 изменяет поведение клеток в плане скольжения путем изменения кривизны концевых органелл. Мол. микробиол. 69, 1029–1040. doi: 10.1111/j.1365-2958.2008.06343.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бургос Р., Вебер М., Мартинес С., Лух-Сенар М. и Серрано Л. (2020). Контроль качества белков и регулируемый протеолиз в организме с редуцированным геномом Mycoplasma pneumoniae . Мол. Сист. биол. 16:e9530. doi: 10.15252/msb.20209530

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бургос Р., Вуд Г. Э., Айверсон-Кабрал С. Л. и Тоттен П. А. (2018). Mycoplasma genitalium варианты неадгезивной фазы возникают по множеству механизмов и избегают зависимого от антител ингибирования роста. Заразить. Иммун. 86:e00866-17. doi: 10.1128/IAI.00866-17

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кокс, Дж.и Манн, М. (2008). MaxQuant обеспечивает высокую скорость идентификации пептидов, индивидуальную точность массы в диапазоне частей на миллиард и количественную оценку белков в масштабах всего протеома. Нац. Биотехнолог. 26, 1367–1372. doi: 10.1038/nbt.1511

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дай, К., и Луткенхаус, Дж. (1992). Правильное соотношение FtsZ к FtsA необходимо для деления клеток Escherichia coli . J. Бактериол. 174, 6145–6151. дои: 10.1128/jb.174.19.6145-6151.1992

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дьюар, С.Дж., Бегг, К.Дж., и Доначи, В.Д. (1992). Ингибирование инициации клеточного деления при дисбалансе соотношения FtsA и FtsZ. J. Бактериол. 174, 6314–6316. doi: 10.1128/jb.174.19.6314-6316.1992

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эдвардс, Д. Х., и Эррингтон, Дж. (1997). Белок Bacillus subtilis DivIVA нацеливается на перегородку деления и контролирует специфичность участка клеточного деления. Мол. микробиол. 24, 905–915. doi: 10.1046/j.1365-2958.1997.3811764.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Эрасо, Дж. М., Маркилли, Л. М., Митчелл, Х. Д., Тейлор, Р. К., Орр, Г., и Марголин, В. (2014). Высококонсервативный белок MraZ является регулятором транскрипции в Escherichia coli . J. Бактериол. 196, 2053–2066. doi: 10.1128/JB.01370-13

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фисунов Г.Ю., Евсютина Д.В., Семашко Т.А., Арзамасов А.А., Манувера В.А., Летаров А.В., и соавт. (2016). Сайт связывания фактора транскрипции MraZ у молликутов. Биохимия 125, 59–65. doi: 10.1016/j.biochi.2016.02.016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гласс Дж., Лефковиц Э., Гласс Дж., Хайнер С.Р., Чен Э.Ю. и Кассел Г.Х. (2000). Полная последовательность слизистого возбудителя Ureaplasma urealyticum . Природа 407, 757–762.дои: 10.1038/35037619

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хассельбринг Б.М., Джордан Дж.Л., Краузе Р.В. и Краузе Д.К. (2006). Развитие терминальных органелл у бесклеточной бактерии Mycoplasma pneumoniae . Проц. Натл. акад. науч. США 103, 16478–16483. doi: 10.1073/pnas.0608051103

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Яффе, Дж. Д., Штанге-Томанн, Н., Смит, К., ДеКаприо, Д., Фишер, С., Батлер, Дж., и соавт. (2004). Полный геном и протеом Mycoplasma mobile. Рез. генома. 14, 1447–1461. doi: 10.1101/гр.2674004

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джемиоло, Д.К., Цвиб, К., и Дальберг, А.Е. (1985). Точечные мутации в 3′ минорном домене 16S рРНК E. coli . Рез. нуклеиновых кислот. 13, 8631–8643. дои: 10.1093/нар/13.23.8631

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Карр, Дж.R., Sanghvi, J.C., MacKlin, D.N., Gutschow, M.V., Jacobs, J.M., Bolival, B., et al. (2012). Вычислительная модель цельной клетки предсказывает фенотип по генотипу. Моб. 150, 389–401. doi: 10.1016/j.cell.2012.05.044

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кимура, С., и Судзуки, Т. (2010). Тонкая настройка рибосомного центра декодирования с помощью консервативных метиловых модификаций в Escherichia coli 16S рРНК. Рез. нуклеиновых кислот. 38, 1341–1352.doi: 10.1093/nar/gkp1073

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кьюма Т., Кимура С., Ханада Ю., Судзуки Т., Секимидзу К. и Кайто К. (2015). Рибосомальные РНК-метилтрансферазы способствуют вирулентности Staphylococcus aureus . FEBS J. 282, 2570–2584. doi: 10.1111/февраль 13302

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, Х., Хэндсейкер, Б., Высокер, А., Феннелл, Т., Руан, Дж., Гомер, Н., и другие. (2009). Формат выравнивания/карты последовательностей и SAMtools. Биоинформатика 25, 2078–2079. doi: 10.1093/биоинформатика/btp352

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ляо, Ю., Смит, Г.К., и Ши, В. (2014). featureCounts: эффективная программа общего назначения для назначения чтений последовательностей геномным признакам. Биоинформатика 30, 923–930. doi: 10.1093/биоинформатика/btt656

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ллуч-Сенар, М., Керол, Э., и Пиньоль, Дж. (2010). Деление клеток у минимальной бактерии в отсутствие ftsZ. Мол. микробиол. 78, 278–289. doi: 10.1111/j.1365-2958.2010.07306.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Луткенхаус, Дж. (2007). Динамика сборки бактериальной системы MinCDE и пространственная регуляция кольца Z. Год. Преподобный Биохим. 76, 539–562. doi: 10.1146/annurev.biochem.75.103004.142652

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мартинес-Торро, К., Торрес-Пуч, С., Монж, М., Санчес-Альба, Л., Гонсалес-Мартин, М., Маркос-Сильва, М., и др. (2020). Транскрипционный ответ на голодание металлов у эмерджентного патогена Mycoplasma genitalium опосредован мех-зависимым и – независимым регуляторными путями. Аварийный. микробы заражают. 9, 5–19. дои: 10.1080/22221751.2019.1700762

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мерсье Р., Каваи Ю. и Эррингтон Дж. (2014). Общие принципы образования и размножения бесстеночного (L-формы) состояния у бактерий. eLife 3:e04629. doi: 10.7554/eLife.04629

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Осава, М., и Эриксон, Х. П. (2006). FtsZ дивергентных чужеродных бактерий может функционировать для клеточного деления Escherichia coli . J. Бактериол. 188, 7132–7140. doi: 10.1128/JB.00647-06

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пеллетье, Дж. Ф., Сан, Л., Уайз, К. С., Асад-Гарсия, Н., Карас, Б.J., Deerinck, T.J., et al. (2021). Генетические требования к клеточному делению в геномно минимальной клетке. Сотовый 184, 2430.e16–2440.e16. doi: 10.1016/J.cell.2021.03.008

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пич, О. К., Бургос, Р., Феррер-Наварро, М., Кероль, Э., и Пиньоль, Дж. (2008). Роль цитоскелетных белков Mycoplasma genitalium MG218 и MG317 в организации терминальных органелл, скользящей подвижности и цитагерентности. Микробиология 154, 3188–3198.doi: 10.1099/mic.0.2008/020636-0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Pilhofer, M., Rappl, K., Eckl, C., Bauer, A.P., Ludwig, W., Schleifer, K.H., et al. (2008). Характеристика и эволюция генов клеточного деления и синтеза клеточной стенки у бактериальных типов Verrucomicrobia, Lentisphaerae, Chlamydiae и Planctomycetes и филогенетическое сравнение с генами рРНК. J. Бактериол. 190, 3192–3202. doi: 10.1128/JB.01797-07

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пуччи, М.Дж., Танасси, Дж. А., Дискотто, Л. Ф., Кесслер, Р. Э., и Догерти, Т. Дж. (1997). Идентификация и характеристика кластеров генов деления клеточной стенки у патогенных грамположительных кокков. J. Бактериол. 179, 5632–5635. doi: 10.1128/jb.179.17.5632-5635.1997

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Раппсилбер Дж., Манн М. и Исихама Ю. (2007). Протокол микроочистки, обогащения, предварительного фракционирования и хранения пептидов для протеомики с использованием StageTips. Нац. протокол 2, 1896–1906 гг. doi: 10.1038/nprot.2007.261

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Робин, А., Жозеле-Пти, Д., и Д’Ари, Р. (1990). Транскрипция гена ftsZ и деление клеток Escherichia coli . J. Бактериол. 172, 1392–1399. doi: 10.1128/jb.172.3.1392-1399.1990

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сабидо, Э., Квенбергер, О., Шен, К., Чанг, К.Ю., Шах И., Армандо А.М. и соавт. (2012). Направленная протеомика пути биосинтеза эйкозаноидов дополняет интегрированную картину клеточного метаболизма геномика-протеомика-метаболомика. Мол. Клетка. Протеомика 11:M111.014746. doi: 10.1074/mcp.M111.014746

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сето, С., и Мията, М. (1999). Разделение, движение и расположение нуклеоидов в Mycoplasma capricolum . J. Бактериол. 181, 6073–6080. doi: 10.1128/JB.181.19.6073-6080.1999

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Торрес-Пуч С., Брото А., Керол Э., Пиньол Дж. и Пич О. К. (2015). Новый сигма-фактор обнаруживает уникальный регулон, контролирующий клеточно-специфическую рекомбинацию в Mycoplasma genitalium . Рез. нуклеиновых кислот. 43, 4923–4936. doi: 10.1093/нар/gkv422

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Торрес-Пуч, С., Мартинес-Торро, К., Гранеро-Мойя, И., Кероль, Э., Пиньоль, Дж., и Пич, О.К. (2018). Активация σ20-зависимой рекомбинации и горизонтального переноса генов у Mycoplasma genitalium . Рез. ДНК. 25, 383–393. doi: 10.1093/dnares/dsy011

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Висенте, М., Гомес, М.Дж., и Айяла, Дж.А. (1998). Регуляция транскрипции генов клеточного деления в кластере Eschericia coli dcw . Сотовый.Мол. Жизнь наук. 54, 317–324. дои: 10.1007/s000180050158

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н., Басовский Ю.И., Левицкий С.А., Лазарев В.Н., Снигиревская Е.С. и др. (2009). Локализация белка деления FtsZ у Mycoplasma hominis . Сотовый тисс. биол. 3, 254–262. дои: 10.1134/S19X0