Ngs клиника: Клиника NGC — лечение бесплодия и ЭКО в СПб

Содержание

Клиника репродукции «NGC» — 17 врачей, 133 отзыва | Москва

Телефон для записи

ул. Верхняя Красносельская д. 3/3

Красносельская (736 м)Комсомольская (1,2 км)Сокольники (1,2 км)

Официальное название

ООО «ЭН ДЖИ СИ»

Руководитель

Аристархова Мария Сергеевна

Гостевая парковка

наличные, банковская карта.

Лицензия

Описание

Клиника репродукции «NGC» находится в Центральном административном округе города Москвы. Она специализируется на предоставлении высококачественных услуг в сфере лечения женского и мужского бесплодия. Деятельность компании лицензирована. Разрешительные документы выданы 11сентября 2017 года.

Клинику репродукции «NGC» представляют высококлассные врачи с многолетним опытом работы. Численность персонала составляет 21 человек. Работу коллектива возглавляет главный врач Казарян Л. М.

Услуги

Клиникой репродукции «NGC» оказываются услуги по следующим направлениям: генетика, диагностика, наблюдение беременности, лечение бесплодия, донорство, криобанк, гинекология, урология, репродуктология, эмбриология и суррогатное материнство. Специалистами медцентра проводятся такие процедуры, как кольпоскопия, цитологические и генетические исследования, УЗИ диагностика, экстракорпоральное оплодотворение, контролируемая овариальная стимуляция, индукция овуляции, ПИКСИ, культивирование эмбрионов и криоконсервация эмбрионов.

Проезд

Клиника репродукции «NGC» находится в пешей доступности от метро (5-7 минут), станция «Красносельская». Из стеклянных дверей повернуть направо и идти вниз по Верхней Красносельской (по уменьшению нумерации домов), ориентир БЦ Красносельский. Клиника NGC располагается в отдельно стоящем здании, с заметной вывеской. Точный адрес Верхняя Красносельская 3/3.

Парковка

Собственной парковки нет.

Метод NGS в клинике ISIDA Киев — Клиника ISIDA Киев, Украина

Метод NGS увеличивает возможности ЭКО

В 2016 году, клиника ISIDA одной из первых в Украине внедрила метод NGS, позволяющий еще до имплантации эмбриона в матку с точностью до 99,9% диагностировать у него хромосомные аномалии или моногенные заболевания.

Метод NGS используется при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО), значительно повышает вероятность наступления беременности в программе ЭКО, а также существенно снижает вероятность появления на свет малышей с генетическими патологиями.

Суть метода NGS

Метод NGS (Next Generation Sequencing) является частью программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и применяется с целью преимплантационной генетической диагностики или скрининга (ПГД или ПГС) эмбрионов. Этот метод представляет собой современную технологию, с помощью которой расшифровывается геном эмбриона. Тест NGS дает очень низкий процент ошибочных результатов.

Зачем нужна преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов?

Научные исследования показывают, что матка является очень чутким биосенсором, который распознает эмбрионы, имеющие хромосомные аномалии, и «отказывает» им в имплантации. Считается, что не менее 50% не состоявшихся после ЭКО беременностей связано именно с генетической «неполноценностью» эмбрионов.

Задача преимплантационной диагностики – до того, как эмбрион имплантируется в матку, выявить у него хромосомные патологии.

До появления метода NGS во многих клиниках, специализирующихся на вспомогательных репродуктивных технологиях, преимплантационная диагностика эмбрионов осуществлялась с помощью других методик, в частности, с помощью метода FISH, который имеет ограниченные возможности диагностики, тестируя лишь небольшое количество хромосом.

Кроме того, так называемые мозаичные эмбрионы, имеющие различный потенциал для имплантации в зависимости от степени мозаичности, не могут быть выявлены при помощи метода FISH. Поэтому клиника ISIDA внедрила у себя высокочувствительный метод NGS.

Этапы NGS-диагностики

Метод NGS является частью программы ЭКО с преимплантационной диагностикой. Обследования и подготовка супругов к экстракорпоральному оплодотворению с применением метода NGS или без его применения ничем не отличаются: врач назначает будущим родителям обследования, основываясь на данных их семейного анамнеза.

Первым этапом ЭКО (не считая предшествующие диагностические исследования) является стимуляция овуляции – введение в организм женщины гормональных препаратов, под влиянием которых в одном менструальном цикле созревает не одна, как обычно, а несколько яйцеклеток. При помощи пункции их извлекают из организма женщины и оплодотворяют спермой будущего папы методом ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) в лабораторных условиях.

На пятые сутки после оплодотворения клетки эмбриона начинают дифференцироваться, разделяясь на «внутриклеточную массу», из которой сформируется будущий ребенок и на клетки внешнего слоя – трофектодермы, которые примут участие в имплантации эмбриона в полость матки и сформируют плаценту.

Для NGS-анализа берут клетки трофектодермы. Используя высокоточные микроинструменты, врач берет для анализа всего несколько клеток, минимизируя таким образом возможность повреждения эмбриона.

Генетическая диагностика. Взятые для анализа клетки передаются в молекулярно-диагностическую лабораторию, в которой с помощью метода NGS проводится анализ эмбриона на наличие хромосомных или генных аномалий. Точность проверки на хромосомные или моногенные заболевания при этом составляет около 99,9%. Процесс диагностики полностью автоматизирован, что является одной из гарантий высокой точности результата.

Криоцикл для эмбриона. В лабораторных условиях развитие эмбриона ограничено во времени – не более 5-6 дней.

Учитывая тот факт, что анализ требует времени, а клетки трофектодермы можно получить только на 5-6 сутки развития эмбриона, после биопсии («отщипывания» небольшого количества клеточек для анализа), эмбрион замораживают современным и эффективным методом витрификации. После получения результатов анализа женщина проходит дополнительную подготовку к криоциклу.

Перенос эмбриона. Перенос эмбрионов, которые после получения результатов анализа NGS признаются нормальными, осуществляется в следующем, запланированном вместе с врачем-репродуктологом, цикле – в периоде, наиболее подходящем для имплантации эмбриона. В ожидании этого времени врачи еще раз проверяют, а при необходимости – стабилизируют гормональный фон будущей мамы, убеждаются в готовности эндометрия к имплантации.

После размораживания эмбрионы с помощью абсолютно безболезненной манипуляции под контролем УЗИ переносят в полость матки. Дальнейшее течение беременности и родоразрешение не отличаются от такового после естественного зачатия.

Кому показан метод NGS

Метод NGS рекомендуется в следующих случаях:

Если супруги уже проходили несколько попыток ЭКО и беременность не состоялась, либо имелись множественные замершие беременности, выкидыши на ранних сроках беременности. Большая часть случаев ненаступления беременности связана с наличием у эмбриона хромосомных нарушений. В этом случае возникает довольно высокий риск гибели эмбриона еще до его имплантации и ненаступление в связи с этим беременности. Иногда гибель эмбриона происходит после имплантации – это приводит к выкидышам на ранних сроках беременности или рождению ребенка с хромосомными или генными патологиями.

Проведение преимплантационной диагностики с применением NGS позволяет с высокой вероятностью отобрать генетически здоровый эмбрион и значительно уменьшить таким образом вышеперечисленные риски.

Если супруги знают о наличие в семейном анамнезе генетических заболеваний. В случае, если ближайшие родственники супругов страдают тяжелыми наследственными заболеваниями, выходом может быть метод NGS.

Возраст также является одним из показаний к проведению анализа NGS. Ведь с течением времени вероятность развития хромосомных аномалий, особенно у женщин, значительно увеличивается.

«Одна из самых важных причин ненаступления беременности у женщин в возрасте старше 38 лет – это возрастающая доля наличия хромосомных аномалий в яйцеклетках, – говорит Кременска Юлия Валерьевна, биолог, эмбриолог, молекулярный генетик. – Нужно отметить, что риск появления хромосомных мутаций (анеуплоидий) в яйцеклетке не зависит от способа зачатия. Кроме того, повышенный риск зачатия плода с хромосомными и генетическими мутациями появляется в случае диагностированного носительства генетических заболеваний, наличия в семье генетических заболеваний.

Чтобы не допустить аномалий у ребенка и исключить риск необходимости прерывания беременности по медицинским показаниям, ЭКО с преимплантационной диагностикой рекомендовано в таких случаях даже тем парам, которые могут зачать ребенка самостоятельно».

Эффективность ЭКО с NGS

Метод NGS значительно повышает эффективность программы ЭКО. Высокая точность определения хромосомных аномалий (99,9%) позволяет не только избежать риска появления на свет ребенка с тяжелыми наследственными заболеваниями, но и значительно повысить успешность имплантации эмбрионов. Кроме того, метод NGS значительно снижает риск возникновение угрозы выкидыша на ранних сроках беременности. Это состояние, согласно данным доказательной медицины, примерно в половине случаев возникает как следствие наличия генетических аномалий у плода: в действие вступает суровый закон естественного отбора.

К успеху приводит работа команды

Метод NGS является одним из самых ярких проявлений командной работы клиники ISIDA, которая уже 25 лет специализируется на лечении бесплодия и применении методик ВРТ (вспомогательных репродуктивных технологий). Более 10 лет в клинике ISIDA практикуются методы преимплантационной диагностики эмбрионов. Внедрение метода NGS стало возможным благодаря постоянной нацеленности клиники на внедрение в свою практику инновационных методов.

С этой целью репродуктологи, эмбриологи, биологи, генетики клиники регулярно участвуют в работе отечественных и зарубежных научно-практических конференций, семинаров, конгрессов, проходят стажировку в ведущих клиниках мира. Все это дает возможность всегда быть в курсе достижений современной медицины, внедрять у себя последние медицинские инновации, такие как метод NGS.

Для успешной реализации метода NGS необходимо участие гинекологов и репродуктологов, которые определяют необходимость использования этого метода, проводят гормональную стимуляцию овуляции, определяют готовность организма женщины к имплантации, проводят манипуляцию подсадки эмбрионов.

Особая ответственность возлагается на биологов и эмбриологов, которые в лабораторных условиях осуществляют оплодотворение яйцеклетки, культивирование эмбрионов, проводят процедуру биопсии эмбриона, а также реализуют метод витрификации. Работа с гаметами и эмбрионами требует не только высокого профессионализма, но и чуткого к чужим мечтам и надеждам сердца. 25 лет работы и более 20 000 появившихся на свет, несмотря на самые сложные диагнозы малышей – таковы вехи слаженной командной работы специалистов клиники ISIDA.

Хотите, чтобы Ваши мечты о материнстве стали счастливой реальностью? Доверьте свое счастье профессионалам: позвоните по телефонам 0 800 60 80 80, +38 (044) 455 88 11 и запишитесь на прием к врачу, который поддержит Вас на пути к Вашей мечте. Счастливого Вам материнства!

NGS-лабораторию Русфонда и КФУ в Казани задействуют для диагностики COVID-19 у врачей

7.04.2020

Фото: Казанский федеральный университет

Лаборатория по первичному типированию потенциальных доноров костного мозга, созданная Русфондом и Казанским (Приволжским) федеральным университетом (КФУ), будет при необходимости частично задействована для диагностики врачей университетской клиники на коронавирусную инфекцию. Об этом 6 апреля Русфонду соообщил Андрей Киясов, проректор по биомедицинскому направлению КФУ, директор Института фундаментальной медицины и биологии, на базе которого и организована лаборатория.

«У нас есть университетская клиника на 840 коек, в которой оказывается также круглосуточная неотложная помощь – по хирургии, терапии, – рассказал Киясов. – Если у больного, который поступил к нам в отделение неотложной помощи, например, с аппендицитом или сердечно-сосудистой патологией, есть подозрение на COVID-19, то маршрутизация достаточно четкая. Но в этой ситуации мы хотим обезопасить и наших врачей. Может быть, такого случая и не возникнет, но если да, то мы будем во всеоружии».

Киясов отметил, что если у пациента, находившегося в медучреждении, впоследствии выявляется коронавирусная инфекция, то за всеми врачами, которые с ним контактировали, устанавливается обязательный контроль.

Анализы пациентов на COVID-19 по-прежнему будет перенаправляться в уполномоченные для этого лаборатории ГНЦ «Вектор» и Роспотребнадзора. Для исследования биоматериалов врачей в КФУ, по словам Киясова, будут применять тест-системы компании «Литех».

«Наша совместная с Русфондом лаборатория располагается в одном из зданий клиники университета рядом с двумя ПЦР-лабораториями. Если нам не будет хватать мощностей, в лаборатории для типирования, где исследования потенциальных доноров временно не проводятся из-за карантина, есть все необходимое. Русфонд дал согласие на это, и это очень хорошо», – отметил Киясов.

«Да, мы в Русфонде поддержали КФУ, – рассказал, в свою очередь, президент Русфонда Лев Амбиндер. – На дворе коронавирус, это форс-мажор для всей страны. Нештатные ситуации для всех, и Русфонд не исключение. Это не только проверка на прочность, на профессионализм, но и на нашу солидарность, верно? Успехов нашим коллегам в КФУ в этой общей борьбе!»

Лаборатория для первичного типирования потенциальных доноров костного мозга – исследования генов тканевой совместимости методом NGS (next-generation sequencing, секвенирование нового поколения) была открыта в Казани в сентябре 2018 года. Ее мощность позволяет типировать 25 тыс. доноров в год.


цена в клинике профессора Феськова

После процедуры ЭКО беременность наступает, в среднем, в 45% случаев: даже при тщательном отборе эмбрионов, не все приживаются. Иногда причиной становится наличие генетических заболеваний. Как увеличить шансы на успех? С помощью программы ЭКО с ПГД — преимплантационной генетической диагностикой. В нашем медицинском центре доступна самая современная и эффективная методика выявления малейших хромосомных аномалий еще до подсадки эмбриона. Расскажем о том, зачем нужна такая диагностика, как проводится и чем отличается от подобных методов.

Предимплантационная генетическая диагностика при ЭКО

«Генетический паспорт» человека в норме включает 23 пары хромосом. Однако при стечении различных факторов кариотип человека может нести определенные хромосомные изменения. Эти изменения могут быть количественными (когда меняется количество хромосом в кариотипе) и структурными (внутренние хромосомные и межхромосомные перестройки, при которых количество хромосом не меняется, но меняется их строение). Следует отметить, что у будущих родителей эти хромосомные изменения сбалансированные, но при этом есть определенные хромосоные нарушения в части половых клеток (яйцеклетках и сперматозоидах). Именно поэтому взрослый здоровый человек может и не догадываться, что является носителем сбалансированного изменения в кариотипе, пока не сталкивается с проблемой замирания / ненаступления беременности из-за формирования эмбрионов с хромосомными нарушениями. ПГД — это метод, который позволяет выявлять такие аномалии в развитии эмбрионов на этапе их культивирования. Использование диагностики повышает вероятность вынашивания и рождения здорового ребенка при ЭКО до 70%.

Процедура с таким анализом проходит в четыре этапа:

  • стимуляция созревания нескольких ооцитов за один цикл у будущей матери;
  • забор яйцеклеток, получение спермы и оплодотворение;
  • созревание эмбрионов до стадии бластоциты. На этом этапе часть клеток формируют клетки трофэктодермы, а часть клеток (внутриклеточная масса)— плод. Эмбриолог проводит биопсию трофэктордермы, забирая несколько клеток (3-5), при этом будущий плод не затрагивается. Эмбрион замораживается, а генетики проводят исследование полученных клеток;
  • благодаря диагностике женщине подсаживаются только здоровые эмбрионы.

Метод прямого анализа генома эмбриона (NEXT GENERATION SEQUENCING, NGS)

Более ранними способами диагностики были FISH (флуоресцентная гибридизация in situ), при котором можно было исследовать ограниченное количество хромосом, и aCGH (сравнительная гибридизация геномов), обеспечивающий анализ по всем хромосомам, но не фиксирующий небольшие нарушения, а также не позволяющий установить момент возможного мозаицизма в эмбрионе.

Инновационный метод Next Generation Sequencing (секвенирование нового поколения или NGS) позволяет получить наиболее точный комплексный анализ полного кариотипа эмбриона с выявлением мутаций и хромосомных аномалий. NGS эффективно фиксирует мозаицизм, транслокации, инверсии, делеции и другие нарушения.

Для чего нужен генетический анализ эмбриона

Включение в программу ЭКО этого этапа позволяет повысить эффективность лечения бесплодия.

Проведение ПГД эмбриона дает возможность:

  • увеличить вероятность наступления беременности;
  • снизить риски невынашивания, связанные с генетическими заболеваниями;
  • исключить вероятность рождения ребенка с хромосомными аномалиями.

Цена анализа ПГД уже включена в пакеты услуг — ваш доктор сообщит все подробности во время первичной консультации.

В каких случаях эмбрионы могут иметь аномалию

Встречаются две разновидности патологий: на уровне отдельных генов или на уровне хромосом. У одного эмбриона может одновременно развиться оба типа аномалий. Хромосомные патологии могут возникать спонтанно во время деления клеток либо передаваться от одного из родителей, а генные нарушения чаще являются наследственными.

Показания к ПГД

Скрининг рекомендован в случаях:

  • множественных неудачных ЭКО;
  • прерывание либо замираниях беременности;
  • наличия хотя бы у одного родителя в семейном анамнезе хромосомных или генетических заболеваний;
  • когда возраст будущей мамы 38+ лет.

Почему стоит провести NGS диагностику в медцентре профессора Феськова А.М.

Генетическая лаборатория нашего центра в числе первых в Украине начала проводить ПГД, для пациентов клиник в Киеве и Харькове были проанализированы более 1 тыс. эмбрионов. Наши специалисты одними из первых в стране начали внедрять инновационный метод NGS. Благодаря пакетным решениям, мы предлагаем обоснованную стоимость ПГД при ЭКО и программы, которые обеспечат не только наступление долгожданной беременности, но и высокую вероятность рождения здорового ребенка.

Преимущества клиники

Мы уже помогли тысячам семей со всего мира стать родителями. Сегодня более чем в 52-х странах живут дети, родившиеся в результате наших успешных программ ЭКО. Это возможно благодаря сплоченной профессиональной команде, беспрерывному совершенствованию технологий, применяемых в клинике. Мы специализируемся на программах с генетической диагностикой эмбриона ради рождения здорового ребенка в каждой семье, которая к нам обратилась. А более чем 25-ти летний опыт привел к созданию программы «Гарантированное ЭКО», в которой клиника берет на себя ответственность за результат.

В каждом менструальном цикле при идеальных условиях вероятность забеременеть естественным путем около 25%. Технология ЭКО повышает эти шансы. Процент успешного лечения методом ЭКО с первой попытки в Клинике профессора Феськова А.М. — около 45%, после криопротоколов он достигает 70%. Данные подкреплены ежегодным отчетом отделения ЭКО клиники. Эти показатели соответствуют мировым стандартам. Результат ЭКО зависит в первую очередь от индивидуальной истории и возраста пациентов и потом от правильно подобранной программы. Поэтому персональный прогноз может отличаться от этих данных как в большую, так и в меньшую сторону. Получить его можно после обследования и формирования тактики лечения.

Двух одинаковых программ ЭКО не бывает. Анализируя медицинскую историю женщины или супружеской пары, которая планирует ЭКО, врач составляет программу таким образом, чтобы достичь положительного результата с первой попытки ЭКО. Важно все: возраст, причины ненаступления беременности, результаты обследований, предыдущий опыт лечения. Применяя накопленные за 25-ть лет знания, навыки и современные репродуктивные технологии мы достигаем положительных результатов.

Мы используем безопасное передовое оборудование. Автономная система энергообеспечения делает независимыми и неуязвимыми все лаборатории и эмбриологический бокс от внешних факторов и ситуаций. Это значит, что ваши эмбрионы находятся в безопасности при любых внештатных ситуациях.

ЭКО

Центр вспомогательных репродуктивных технологий был открыт в 2011 году в Сибирском государственном медицинском университете и входит в состав многопрофильных университетских клиник. Центр является базой кафедры акушерства и гинекологии Сибирского государственного медицинского университета.

Центр занимается вопросами репродукции и генетики, проводит диагностику и применяет эффективные передовые технологии в лечении всех видов женского и мужского бесплодия.

В центре есть все, чтобы помочь появиться на свет Вашему ребенку: собственная современная лаборатория, SP-room для сбора биологического материала, криохранилище, современная операционная, комфортабельные пред- и послеоперационные палаты. И, конечно же, наша гордость — врачи и медицинские сестры — настоящие профессионалы своего дела с многолетним опытом работы, которые шаг за шагом приведут вас к нашей общей цели. Кроме того, при необходимости Вы сможете обратиться к врачам университетских клиник смежных специальностей (эндокринологам, урологам, андрологам и другим), которые являются признанными специалистами в своей сфере. Такая возможность невероятно важна, ведь репродукция — сложная область, в которой может потребоваться помощь врачей различных специальностей.

Наша цель — РОЖДЕНИЕ ЗДОРОВОГО РЕБЕНКА.

Почему Вам следует обратиться именно Центр вспомогательных репродуктивных технологий СибГМУ ?

В центре применяются передовые методы борьбы с женским и мужским бесплодием. Центр вспомогательных репродуктивных технологий Сибирского государственного медицинского университета оснащен современным оборудованием от ведущих мировых производителей. Наши специалисты — профессионалы своего дела, врачи с многолетним опытом, которые постоянно совершенствуют свои знания и навыки, в том числе, проходя стажировки и участвуя в конференциях по всей России и за рубежом. Среди наших специалистов — кандидаты и доктора медицинских наук, врачи высшей категории, члены Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) и Американского общества репродуктивной медицины (ASRM).

Если Вы подозреваете у себя или партнера проблемы с зачатием, Вы можете смело обратиться в наш Центр вспомогательных репродуктивных технологий. Вместе мы найдем решение Вашей проблемы и поможем Вам стать родителями здорового ребенка.

Секвенирование нового поколения (NGS) теперь выполняется в клинике ИГР (Киев)

Как известно, молекула ДНК — основа жизнедеятельности всех живых организмов. Последовательность составляющих её оснований обеспечивает хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования организма. С помощью более ранних методов секвенирования было выявлено, что человеческий геном содержит 20—25 тыс. активных генов, то есть только 1,5 % всего генетического материала. Гены неравномерно распределены по хромосомам. Каждая хромосома содержит богатые и бедные генами участки. Эти участки коррелируют с хромосомными бэндами (полосы поперёк хромосомы, которые видно в микроскоп и исследуются при анализе кариотипа человека). Поэтому с применением секвенирования нового поколения (NGS) возможно проведение анализа как на генном, так и на хромосомном уровне.

Именно это свойство современного метода NGS позволяет специалистам МЦ ИГР исследовать полный хромосомный набор эмбрионов до их переноса в матку (пример представлен на рисунке 1). Это предоставляет возможность выявить не только более распространенные хромосомные аномалии (например, трисомия 21 – синдром Дауна), а и редкие нарушения в наборе хромосом (как представлено на рисунке 2), вплоть до мелких удвоений (дупликаций) или потерь (делеций) в структуре хромосом.

Рис.1. Нормальный набор хромосом, комбинация половых хромосом соответствует мужскому полу.

 

Рис.2. Аномальний набор хромосом с моносомиями (недостатком хромосом) 6 и 18, комбинация половых хромосом соответствует женскому полу

 

В мировой медицинской практике давно известно, что нарушения хромосомного набора и/или структуры хромосомы являются самыми частыми причинными самопроизвольных прерываний беременности. Поэтому МЦ ИГР предоставляет возможность провести анализ полного хромосомного набора абортивного материала с применением секвенирования нового поколения(NGS).

Другой, не менее важной сферой исследований, в которой важно использование метода NGS, — это инвазивная пренатальная диагностика. Развитие пороков развития у плода часто связано с аномалиями хромосом. Это могут быть как количественные, так и структурные особенности (микроделеции, микродупликации). С помощью современного метода секвенирования нового поколения NGS, который предоставляет Вам МЦ ИГР, стало возможным выполнить исследование клеток плодового происхождения, аспирированых при инвазивной процедуре (например, амниоцентезе), получив информацию о хромосомном наборе плода с учетом даже микроструктурных нарушений.

За более детальной информацией о секвенировании нового поколения, стоимости, сроках выполнения исследования и другим интересующих Вас вопросам обращайтесь по телефонам (044) 220-00-03,(096) 220-00-03,(095) 220-00-03,(093) 220-00-03 или по адресу  г. Киев, проспект Победы, 121-Б.

Обратившись в «Медицинский центр ИГР», Вы получите целый комплекс услуг и консультаций специалистов, которые помогут Вам достигнуть поставленной цели и обрести счастье быть родителем здорового малыша.

Исследования и разработки в области молекулярной генетики ≡ Лаборатория DIAGEN

занимается исследованиями и научными разработками в области молекулярной генетики и диагностики. Наша миссия — создание и внедрение в клиническую практику инструментов персонализированной медицины

Сезонное предложение

сделай тест
на COVID-19
методом ПЦР
со скидкой 15% Акционная цена:

638 грн

750 грн

  • г. Киев,
    бул. Леси Украинки, 11,
    м. Печерская
  • г. Киев,
    ул. Белорусская, 15-А,
    м. Лукьяновская

Предложение действительно до 28.02.2022

Наша лаборатория первой в Украине
начинает тестирование на мутации характерные

для коронавируса
SARS-Cov-2 Омикрон

Начиная с 22.12.2021 тест можно сделать
в одном из трех медицинских центров лаборатории DIAGEN

16 декабря 2021 года
впервые в Украине специалисты генетической лаборатории DIAGEN обнаружили вариант вируса, с комбинацией мутаций характерной для варианта SARS-CoV-2 Omicron

Акционное предложение
только для медицинского центра в г. Вишневое*

-20%

на все
виды услуг

Специальное предложение действительно
с 17.12.2021 по 30.04.2022
*Скидки не суммируются с другими акционными предложениями

Новая услуга

уже в наличии

Получите
COVID-сертификат
на основании отрицательного
ПЦР теста
в приложении «Дія»

Срок действия сертификата – 72 часа
с момента сдачи биоматериала на исследование

специальная цена
антиген-тест на COVID-19
(код 30558) при наличии билета на
поезд / самолёт / автобус / метроВакцина
Ваксигрип® Тетра

для профилактики гриппа

Делаем прививки:
  • бул. Леси Украинки, 11
  • на выезде

Защитите себя и родных!

Цена
на выезд медсестры
снижена!
  • В пределах Киева — 300 грн
  • 5 км от Киева — 350 грн
  • 30 км от Киева — 400 грн

Если чек на анализы
свыше 2 000 грн,
выезд медсестры в пределах
Киева БЕСПЛАТНО

Заказывайте выезд
медсестры домой
или в офис
+38 066 872 77 87

Новая услуга

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ТЕСТ
НА АНТИТЕЛА IgG
К S-БЕЛКУ
КОРОНАВИРУСА

Цена:

410 ГРН

Рекомендуется проводить исследования через 14 дней
после полного курса вакцинации
, или через 14 дней
с первого дня заболевания

где сдать

срочный ПЦР-тест
на коронавирус?

Исследования:

  • Срочное за 12 часов — 930 грн
  • Обычное за 24 часа — 750 грн

Одни из первых начали проводить тестирование на
определение COVID-19

Тест на коронавирус
  • Метод ПЦР
  • Материал для исследования — мазок из ротоглотки

проводится определение трех опасных вариантов
коронавируса: британского, южноафриканского и
бразильского штаммов.

  • Метод пиросеквенирования
  • Материал для исследования — кровь

наша лаборатория использует метод
пиросеквенирования. Этот метод
позволяет определять сложные мутации
и проводить количественный анализ.

Наши методы

Метод ПЦР

Метод ПЦР и ПЦР в реальном времени используется для определения точечных мутаций и идентификации патогенов. За открытие данного метода в 1993 году Кэри Муллис получил Нобелевскую премию.

Метод пиросеквенирования

Несмотря на широкую востребованность этого метода в мире, только недавно мы стали первой лабораторией в Украине, использующей этот метод. Этот метод позволяет определять сложные мутации и проводить количественный анализ. Этим методом, например, мы исследуем генетические полиморфизмы при синдроме Жильбера и эпигенетические изменения.

Метод NGS секвенирования

Самый современный метод молекулярно-генетического анализа. При помощи технологий компании Illumina метод позволяет определять одновременно большое количество генетических маркеров, полностью читать митохондриальный геном и геномы вирусов и бактерий.

Анализ кала с использованием AI

Даже для проведения таких простых тестов как копрограмма, мы используем автоматические системы, которые проводят анализ, используя силы искусственного интеллекта. Приготовление препаратов проводит специальная машина без участия человеческого фактора, а полученные изображения анализирует обученное программное обеспечение.

Цитологический анализ с использованием AI

Мы очень серьезно подходим к цитологическим исследованием, так как они широко используются для выявления рака. Чтобы просмотреть большее число клеток, чем способен любой специалист, мы используем возможности искусственного интеллекта. С помощью программы, обученной десятью заграничными цитологами, мы анализируем тысячи клеток и среди них выявляем аномальные клетки. После этого наш специалист повторно проверяет отобранные клетки, проводит их цитологическое описание.

ЛАБОРАТОРИЯ DIAGEN ПРЕДОСТАВЛЯЕТ САМЫЙ ШИРОКИЙ СПЕКТР ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ, 
А ТАКЖЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЗДОРОВЬЯ.


Отзывы


Завжди дуже швидке та якісне обслуговування. Приємний персонал

Дуже уважний та приємний персонал. 18.08.2021

Очень внимательный и приветливый персонал, сделали все очень быстро и качественно! Спасибо вам! 02.08.2021

Спасибо большое за оперативность! Нет очередей огромных как во всех клиниках и толп людей! Все организовано. Если цените свое время Вам сюда. Администратор Юлия со скоростью ракеты внесла мои данные)) спасибо!! Сдала анализ за 2 минуты ☺️☺️ Теперь только к Вам))) 02.08.2021

После посещения данной лаборатории остались только позитивные позитивные эмоции. Спасибо за работу администратоу Алине и мед сестре Веронике. 29.07.2021

Здавала швидкий аналіз ( для виїзду на відпочинок ) Дівчатка швидко зареєстрували й відправили на забір матеріалу. Приємно здивувала ціна. Персонал привітний ,ввічливий. Рекомендую. 16.07.2021

Делала тест ПЦР 02.07.21, результат пришел намного быстрее, чем заявлено, сотрудники вежливые, высокопрофессиональные, работают идеально! Всем советую и буду обращаться только в Diagen! 3 июля

01. 07.2021 скористалися послугами лабораторії на Білоруській 15- А ,як приємно, коли працюють такі професіонали! Висока якість обслуговання! Молодчини, залишайтесь такими завжди! Дякуємо!!!

Оставить отзыв

Статьи

08.04.2021

Определение штаммов коронавируса SARS-CoV-2

На данный момент в мире существует более 100 разновидностей SARS-CoV-2, многие из которых отличаются по своей скорости распространения, заразности и тяжести вызываемых симптомов. CDC выделяет всего 5 штаммов вируса, которые на данный момент имеют доказанную повышенную скорость передачи, приводят к более тяжелому течению заболевания или…

05.04.2021

Сезон охоты на людей: Как уберечься от клещевых инфекций

Весна — это не только пора свежей молодой травы и первых цветов. Это еще и начало сезона распространения клещевых инфекций. Период активности этих насекомых начинается обычно в середине апреля, когда температура воздуха перестает опускаться ниже 5-7°С и заканчивается в октябре с понижением температуры.

24.03.2021

Пройди диагностику на туберкулез и вздохни спокойно!

Во всем мире 24 марта считается днем борьбы с туберкулезом. Именно поэтому медицинская лаборатория Diagen напоминает о том, что туберкулез излечим. И чем раньше его диагностировать, тем скорее человек сможет вернуться к привычному ритму жизни….

Все статьи

 

Новости

17.12.2021

В образце коронавируса в Киеве впервые выявлены мутации характерные для варианта Omicron

16 декабря 2021 года впервые в Украине специалисты генетической лаборатории «DIAGEN» выявили вариант вируса, с комбинацией мутаций характерной для варианта SARS-CoV-2 Omicron. Положительный результат диагностирован методом ПЦР у жительници Киева которая вернулась из Дубаи. Специалисты лаборатории «DIAGEN» использовали современные методы молекулярного анализа которые позволили заподозрить…

07.12.2021

В декабре заборные пункты будут работать по следующему графику:

25 декабря: г. Киев, ул. Леси Украинки, 11 будет работать с 07:30 до 16:00…

16.11.2021

Растет количество поддельных бланков — тестируйтесь в лицензированных лабораториях

Дорогие наши клиенты и партнеры, обращаем ваше внимание на то, что с введением карантинных ограничений снова растет количество поддельных бланков с отрицательными результатами ПЦР-тестов/антиген-тестов на COVID-19. …

Все новости

 

Секвенирование следующего поколения и его клиническое применение

Секвенирование следующего поколения (NGS) — это новая технология, используемая для секвенирования ДНК и РНК и обнаружения вариантов/мутаций. NGS может секвенировать сотни и тысячи генов или весь геном за короткий промежуток времени. Варианты/мутации последовательности, обнаруженные с помощью NGS, широко используются для диагностики заболеваний, прогнозирования, принятия терапевтических решений и последующего наблюдения за пациентами. Возможности массивного параллельного секвенирования открывают новые возможности для персонализированной точной медицины.

 Введение

NGS 1-4 — это новая технология секвенирования ДНК и РНК и обнаружения вариантов/мутаций. Эта технология сочетает в себе преимущества уникальной химии секвенирования, различных матриц секвенирования и технологии биоинформатики. Такая комбинация позволяет проводить массовое параллельное секвенирование последовательностей ДНК или РНК различной длины или даже всего генома за относительно короткий период времени. Это революционная технология секвенирования после секвенирования Сэнгера 5 .

NGS включает в себя несколько основных этапов секвенирования. Например, NGS ДНК включает в себя фрагментацию ДНК, подготовку библиотеки, массовое параллельное секвенирование, биоинформатический анализ, а также аннотацию и интерпретацию вариантов/мутаций.

Фрагментация ДНК

Фрагментация ДНК используется для разрыва ДНК-мишени на множество коротких сегментов, обычно длиной 100–300 п.н. Для достижения этого можно использовать разные методы. ДНК можно фрагментировать с помощью механических методов, ферментативного расщепления 6 или других методов.Например, ультразвуком можно разбить ДНК на короткие сегменты. Короткие сегменты, относящиеся к целевым последовательностям ДНК, выделяются с помощью специфических комплементарных зондов различной конструкции 7,8 . Этот метод обычно называют анализом гибридизационного захвата. Другой метод включает амплификацию полимеразной цепной реакции (ПЦР). В этом методе используется множество пар праймеров для амплификации целевых сегментов ДНК с помощью ПЦР. Продукты ПЦР служат короткими сегментами ДНК-мишеней.Этот метод обычно называют анализом ампликона 9,10 . Сегменты ДНК затем используются для подготовки библиотеки.

Подготовка библиотеки

Подготовка библиотеки — это процесс, при котором сегменты ДНК модифицируются таким образом, чтобы каждый образец ДНК мог иметь индекс, специфичный для образца, например, идентификацию образца, который помогает идентифицировать пациента, у которого было выполнено секвенирование ДНК. Этот процесс также позволяет добавлять адаптеры секвенирования к сегментам ДНК. Такая модификация позволяет праймерам для секвенирования связываться со всеми сегментами ДНК, а позднее позволяет проводить массивное параллельное секвенирование.

Секвенирование

Массовое параллельное секвенирование выполняется с использованием секвенатора NGS. Библиотека загружается на матрицу секвенирования в определенном секвенсоре. Разные секвенсоры имеют разные матрицы секвенирования. Например, секвенатор Illumina NGS использует проточные ячейки, а секвенатор Ion Torrent NGS использует микросхемы секвенирования. Тем не менее, его цель та же самая, которая состоит в том, чтобы позволить массовое параллельное секвенирование всех сегментов ДНК в одно и то же время. Информация о последовательности, полученная в результате такого массивного параллельного секвенирования, анализируется с использованием программного обеспечения для биоинформатики.

Биоинформатический анализ и интерпретация данных

Биоинформатический анализ — это процесс, включающий базовый вызов, выравнивание чтения, идентификацию вариантов и аннотацию вариантов 11 . Во время этого процесса информация о последовательности сравнивается с эталонной последовательностью генома человека, чтобы определить, есть ли какие-либо варианты/мутации в целевых последовательностях. Вся информация из каждого секвенированного сегмента собирается вместе для получения окончательных результатов секвенирования полной длины целевой ДНК.Окончательные результаты секвенирования отправляются обратно пользователю для интерпретации.

Процессы аннотирования и интерпретации установлены для идентификации каждого варианта и их возможного биологического/клинического значения.

 Клиническое применение NGS

Необходимость технологии NGS

Одним из преимуществ NGS является одновременный опрос многих целей в масштабе сотен и тысяч или даже миллионов целей. Такая способность дает NGS огромное потенциальное применение в клинических условиях.Например, при лечении онкологических больных любая опухоль может иметь множественные мутации. Если в таких клинических условиях используются традиционные молекулярные анализы, может потребоваться проведение нескольких анализов для множественных мутаций. Для этих множественных анализов может потребоваться большее количество ткани. Используя технологию NGS, эти цели можно опросить за один тест. Следовательно, требуется меньше ткани, а результаты десятков и сотен ДНК-мишеней получаются за один тест. В последние годы научные исследования выявили все большее количество мутаций при различных заболеваниях.Например, разные мутации были обнаружены при разных гемопоэтических лейкозах. Мутации в NPM1 и CEBPA RUNX1 были обнаружены при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ), связанном с различными подтипами ОМЛ 12 . При миелодиспластическом синдроме было обнаружено множество мутаций, связанных с различными клиническими проявлениями. Гены, содержащие эти мутации, включают, помимо прочего, TET2, DNMT3a, ASXL1, EZh3, SF3B1, SRSF2, U2AF1, ZRSR2, TP53, STAG2, NRAS, CBL, JAK2, NF1, RUNX1, ETV6, IDh2, IDh3, SETBP1, PHF6. , BCOR, STAT3 и PPM1D 13 .

Считается, что в образце пациента лейкозные клетки, несущие одну и ту же мутацию, происходят из одного клона. Образец пациента со многими мутациями может содержать более одного клона лейкемических клеток. Лейкемическое заболевание может иметь не только более одного клона лейкозных клеток, но и клоны могут меняться в течение болезни. Такое явление называется клональной эволюцией 14-18 . Подобное явление наблюдалось и в солидных опухолях 17,19 .Это наблюдение изменило старую концепцию «одна опухоль — одна мутация». Солидная опухоль может иметь множественные мутации. Эти мутации могут происходить из одного клона или нескольких клонов. Это называется гетерогенностью опухолевых мутаций 20 . Поэтому при лечении онкологических больных необходимо очень часто тестировать множественные генные мутации. Из-за клональной эволюции во время последующего наблюдения необходимо проверить множество различных генных мутаций. Кроме того, не только солидные опухоли могут иметь множественные мутации, но и метастатические опухоли могут также иметь мутации, отличные от мутаций первичной опухоли 21,22 . Такие результаты также указывают на то, что множественные мутации необходимо проверять с помощью диагностических и последующих молекулярных тестов. С появлением иммунотерапии количество опухолевых мутаций стало важным параметром для тестирования 23 . Для этого снова необходимо исследовать многочисленные мутации в образце опухоли. Традиционные методы молекулярного тестирования не подходят для таких нужд. Поэтому технология NGS становится необходимой для таких задач в уходе за пациентами. Более того, в современной медицинской практике, хотя образцы биопсии становятся все меньше и меньше, из небольших образцов биопсии необходимо извлечь больше информации, связанной с мутацией.Во многих случаях традиционные молекулярные тесты не могут удовлетворить такие потребности. NGS развился, чтобы удовлетворить такие потребности. Благодаря массовому параллельному секвенированию технология NGS может одновременно тестировать несколько образцов и несколько целей. Следовательно, это увеличивает время выполнения молекулярных тестов. Стало ясно, что технология NGS является важным инструментом персонализированной точной медицины. Он предоставляет информацию для диагностической классификации заболеваний, выбора терапевтических средств и прогностической оценки.Однако применение NGS в клинических условиях сопряжено с трудностями.

Объем технологии NGS

Для надлежащего клинического применения NGS необходимо соблюдать ряд необходимых мер. Руководства и рекомендации по использованию технологии NGS для клинических испытаний были опубликованы Колледжем американской патологии (CAP) 24 , Ассоциацией молекулярной патологии (AMP) 25 и другими агентствами 26 .

NGS может выполняться на разных уровнях.Его можно использовать для полногеномного секвенирования. На этом уровне исследуются почти все нуклеотиды генома, включая хромосомную ДНК и митохондриальную ДНК. Полногеномное секвенирование чаще используется в исследованиях и реже в клинических условиях. При использовании в клинических условиях он чаще используется для конституциональных генетических заболеваний, а не для соматических мутаций рака. Это особенно полезно для диагностики некоторых редких генетических заболеваний. Например, когда подозревается генетическое заболевание, но другие молекулярные тесты не выявили специфической мутации.В таких случаях секвенирование всего генома может предоставить дополнительную информацию о мутациях, связанных с заболеванием. Полногеномное секвенирование используется реже для соматической мутации рака, поскольку средняя глубина полногеномного секвенирования ограничена. В определенной опухоли частота аллельных мутаций может различаться, а также процентное содержание опухолевых клеток в разных образцах. Обнаружение различных мутаций с различной частотой аллелей в таких условиях часто требует глубокого секвенирования, что очень сложно для метода полногеномного секвенирования.Анализ

NGS можно использовать для секвенирования всего экзома. Можно секвенировать всю кодирующую область всех аксонов организма, включая любые типы клеток. У человека это около 1% генома человека и чаще используется в исследованиях.

NGS также может выполняться на уровне транскриптома, который включает полную сборку транскриптов РНК в данном типе клеток, включая мРНК, рРНК, тРНК, микро-РНК и некодирующую РНК. В отличие от секвенирования ДНК, это называется секвенированием РНК. Специально разработанное секвенирование мРНК также часто используется для обнаружения слитых генов.

Наиболее часто используемый анализ NGS для онкологических больных представляет собой целевое панельное секвенирование, которое обычно исследует десятки или сотни целевых генов. Такие целевые анализы NGS обычно разрабатываются для заболевания или категории заболеваний, например, панель предназначена для миелоидного лейкоза или панель предназначена для карциномы. По сравнению с секвенированием всего генома, такая целевая панель имеет лишь ограниченное количество целей. Следовательно, это позволяет гораздо глубже секвенировать, что необходимо для охвата различных мутаций с разной частотой аллельных мутаций.

Определение генов-мишеней для клинического применения NGS

Клиническое применение тестирования NGS включает несколько аспектов работы. Первым шагом является определение того, какие генетические мутации необходимо изучить. Обычно это зависит от того, для какого заболевания или заболеваний предназначено конкретное тестирование NGS. Взяв в качестве примера больного раком, первое, что необходимо сделать, это проверить текущие рекомендации по заболеванию или заболеваниям, чтобы определить целевые генные мутации, которые включены в рекомендации в качестве стандарта лечения.Например, при немелкоклеточном раке легкого в рекомендациях указано, что мутации EGFR, KRAS, BRAF, MET, RET и Her2, а также транслокации ALK и ROS1 являются клинически значимыми и нуждаются в тестировании 27 . Исследования мутаций рака являются очень активной областью, и каждый день делаются новые открытия. Поэтому необходимо просмотреть литературу, чтобы выявить другие потенциальные мутации, которые еще не включены в руководство, но потенциально значимы в клинических условиях. Например, мутации PIK3CA, NRAS, AKT1, MAP2K1, NTRK и DDR2 могут иметь потенциальное клиническое значение у небольшой части пациентов с немелкоклеточной карциномой 28-31 , и поэтому необходимо рассмотреть возможность их включения. Лабораториям также будет полезно общаться с клиницистами каждой специальности, чтобы получить их отзывы. Таким образом, может быть сгенерирован список мутаций, которые необходимо исследовать. Анализ NGS, разработанный для такой группы генных мутаций, обычно называют панелью NGS.

Определение метода NGS для клинического применения

Следующим шагом является определение подходящего метода NGS для панели NGS. Доступны различные методы NGS. Для четко определенной генной панели можно использовать анализ ампликона 9,32,33 .Однако, если некоторые целевые гены трудно поддаются анализу ампликона, можно использовать другой метод, например анализ гибридизационного захвата 34 . Например, если мы разрабатываем панель для пациентов с ОМЛ, мутации CEBPA и мутации FLT3 должны быть включены в эту панель. Хорошо известно, что ген CEBPA имеет высокое содержание GC, что создает проблемы для анализа ампликона 35 . Мутации FLT3 обычно состоят из внутренних тандемных дубликатов разного размера. Это также сложно для анализа ампликонов, который обычно секвенирует ампликоны фиксированного размера.В таком случае анализ захвата гибридизации может работать лучше. После выбора метода NGS для клинического применения необходимо решить, какой тип образца будет тестироваться 25 . Будет ли это свежая ткань или ткань, фиксированная формалином и залитая парафином (FFPE)? Если анализ NGS предназначен для гематологических злокачественных новообразований, он с большей вероятностью будет тестировать образцы свежих тканей. С другой стороны, если анализ NGS предназначен для солидной опухоли, он с большей вероятностью будет тестировать образцы FFPE. Образцы FFPE обычно предоставляются в виде неокрашенных предметных стекол с предметным стеклом, окрашенным гематоксилином и эозином, что обычно включает в себя микроскопию и микро/макродиссекцию образцов перед выделением ДНК.Иногда панель может быть разработана как для свежей ткани, так и для ткани FFPE в зависимости от ее применения. Следующим шагом является установление стандартной операционной процедуры (СОП). Это включает в себя написание СОП и выполнение предварительных тестов для точной настройки СОП. СОП должна включать процедуры влажной лаборатории и процедуры сухой лаборатории (биоинформатический конвейер).

Валидация теста NGS для клинического применения

После принятия решения о методе анализа NGS анализ должен пройти валидацию в лаборатории, сертифицированной CLIA.Валидация состоит из нескольких аспектов работы, в том числе обеспечения точности анализа, прецизионности, регистрируемого диапазона, референтного диапазона, аналитической чувствительности и специфичности 25 . Необходимо разработать план проверки. План валидации обычно определяет, какие положительные и отрицательные контрольные образцы будут использоваться. Положительные и отрицательные образцы также можно смешивать в различных соотношениях, чтобы получить положительные контроли с различной частотой аллельных мутаций. Такие контроли будут использоваться для проверки чувствительности анализа. В идеале положительные контроли должны включать различные типы мутаций, например, однонуклеотидные мутации, делеции и вставки. Что касается удалений и вставок, следует учитывать размеры удаления и вставки. Как правило, чем больше делеция и вставка, тем сложнее анализу NGS выполнить опрос. В плане валидации также необходимо определить, сколько образцов необходимо протестировать. Обычно это образцы пациентов, которые были протестированы в другой лаборатории, сертифицированной CLIA.Количество образцов, которые необходимо протестировать, зависит от множества факторов. Одним из них является вариация результатов испытаний. Большее разнообразие результатов испытаний требует большего количества образцов. Вообще говоря, руководящие принципы указывают, что если мы хотим быть уверенными в 95% при надежности по крайней мере 95%, минимальное необходимое количество образцов составляет 59 25 .

В процессе валидации оцениваются аналитическая чувствительность, специфичность, достоверность, прецизионность, предел обнаружения, глубина секвенирования и отсечение частоты аллелей.

Аналитическая чувствительность — это параметр, отражающий процент положительных образцов, идентифицированных как истинно положительные в ходе валидированного анализа. Другим важным параметром является предел обнаружения (LOD). LOD можно дополнительно определить как нижний предел обнаружения (LLOD), который отражает самую низкую частоту вариантного аллеля (VAF) определенной мутации, при которой 95% образцов с такой VAF будут надежно обнаружены 25,36 . Обычно, чем ниже LLOD, тем выше чувствительность.Аналитическая специфичность — это параметр, отражающий процент отрицательных образцов, идентифицированных как истинно отрицательные в ходе валидированного анализа. Точность — это параметр, отражающий соответствие обнаруженных мутаций и ожидаемых мутаций. Точность — это параметр, отражающий тенденцию достижения одинаковых результатов у разных пользователей и разных прогонов 25,36-38 . Глубина секвенирования определяется как количество прочтений определенной целевой последовательности. В анализе NGS глубина секвенирования для разных мишеней может различаться.Поэтому при описании глубины секвенирования вводятся два разных термина, а именно средняя глубина и минимальная глубина. Средняя глубина отражает общую глубину секвенирования для определенного анализа. Минимальная глубина указывает на наименьшую глубину секвенирования, необходимую для получения надежных результатов для всех намеченных целей. Отсечка аллельной частоты получается в процессе валидации, что должно позволить обнаружить настоящие варианты и исключить ложные «варианты» из-за зашумленного фона.AMP выпустила руководство для такого процесса проверки 25 .

План валидации обычно выполняется в лаборатории, сертифицированной CLIA. Образцы должны быть проверены по крайней мере двумя разными технологами и должны быть протестированы в разных циклах для оценки повторяемости/воспроизводимости. Данные будут анализироваться через определенный конвейер биоинформатики. Результаты анализа данных используются для определения контрольного диапазона отчета и предела обнаружения. Во время валидации также необходимо определить матрицу контроля качества.Например, будут определены качество и количество нуклеиновой кислоты, необходимой для анализа. Количественный анализ и квалификация библиотеки также будут определены. Также будут определены другие матрицы контроля качества, включая глубину охвата (средняя глубина и минимальная глубина), однородность покрытия, плотность кластеров и скорость прохождения выравнивания, показатели качества базовых вызовов, качество отображения, коэффициент дублирования и смещение цепочки. Обсуждение деталей этих матриц выходит за рамки данной статьи.Эти матрицы контроля качества обеспечат качество результатов испытаний 25,36-38 . Данные матрицы контроля качества должны быть включены в валидационный документ. Руководство обычно рекомендует включать в документацию следующие компоненты: цель клинического испытания, приемлемые типы клинических образцов, обоснование включения конкретных генов, методологический подход, типы и источники реагентов и испытательного оборудования, используемое программное обеспечение для биоинформатического анализа. для обработки и анализа данных, подробную пошаговую процедуру тестирования (SOP), описание валидационной пробы, результаты оптимизации и ознакомления, результаты валидации, рабочие характеристики, критерии приемлемости и отклонения анализа, ограничения анализа, матрицу контроля качества/обеспечения и другую информацию, необходимую медицинский директор считает необходимым 25 .

Интерпретация результатов тестирования NGS является сложной задачей. Тестирование NGS может выявить множество вариантов. Клиническая значимость этих вариантов может варьироваться. Для некоторых вариантов клиническое значение хорошо известно. Однако для некоторых других вариантов клиническая значимость неизвестна или не определена, поскольку об этих вариантах раньше не сообщалось или о них сообщалось очень редко. Горячей темой обсуждения является метод интерпретации результатов NGS. Разумный подход может состоять из нескольких шагов.Первый шаг — следовать текущим рекомендациям. Например, в случае NGS-тестирования опухолей для интерпретации можно использовать рекомендации Национальной комплексной онкологической сети (NCCN). Можно также использовать другие соответствующие руководящие принципы. В руководствах обычно приводится список генов и мутаций, которые могут быть клинически значимыми для диагностики, прогноза, молекулярной таргетной терапии и иммунотерапии. Второй шаг — быть в курсе последних научных открытий. Поскольку при обнаружении вариантов гена часто появляются новые открытия, необходимо просмотреть текущую литературу при оценке клинической значимости вариантов/мутаций, обнаруженных в тесте NGS.Есть и другие ресурсы, например базы данных, часто находящиеся в свободном доступе в Интернете (http://www.cbioportal.org/, http://www.uniprot.org/, https://www.ncbi. nlm.nih.gov/SNP/, http://evs.gs.washington.edu/EVS/, http://exac.broadinstitute.org/gene/ENSG00000171456, http://cancer.sanger.ac.uk/ cosmic/, https://civicdb.org/home, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ и др.). Эти базы данных содержат огромное количество данных, связанных с особенностями и биологическим/клиническим значением вариантов/мутаций. Эти базы данных часто предоставляют ссылки для ссылок между базами данных. Поскольку ни одна база данных не идеальна, необходимо соблюдать осторожность при использовании информации из любых баз данных.

После начала анализа NGS в лаборатории следует постоянно контролировать матрицу качества. Результаты испытаний также следует постоянно контролировать в контексте клинических условий и проводить проверки квалификации два раза в год, чтобы обеспечить надежность результатов испытаний.

Другое клиническое применение NGS

Клиническое применение NGS не ограничивается диагностикой.Он также широко используется для определения целей мутации для таргетной терапии и для выявления групп населения с высоким риском некоторых наследственных видов рака. За последние несколько лет было разработано множество препаратов для молекулярного нацеливания, и их число еще не исчерпано 39 . Например, гены, связанные с терапией меланомы, могут включать, помимо прочего, BRAF, KIT, NRAS, NF1, GNAQ, CDK4, MITF и PD-1 40 . Гены, связанные с терапией рака легкого, могут включать, помимо прочего, EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, PIK3ca, ROS1, MEK, VEGFA, ALK, MET, ERBB2 и ERBB4 27,41 .Следовательно, существует необходимость в идентификации различных мишеней мутаций для таргетной терапии. Анализ NGS хорошо подходит для таких задач. Анализ NGS имеет важное применение в диагностике наследственного рака или оценке популяции риска. Поскольку частота вариантов аллелей наследственного рака обычно составляет около 50% или 100%, для обнаружения таких генетических изменений требуется меньшая глубина секвенирования по сравнению с таковыми при раке. Следовательно, в панель определенного размера можно включить больше целевых генов. Это особенно полезно при оценке населения с высоким риском наследственного рака 42,43 , например, BRCA1, BRCA2, CDh2, PTEN, TP53, STK11, PALB2, ATM, CHEK2, MUTYH, BARD1, MRE11A, NBN, RAD50, RAD51C , RAD51D и NF1 используются для лечения рака молочной железы 42 .

Клиническое применение NGS также включает тесты на нагрузку опухолевых мутаций и микросателлитную нестабильность, а также варианты/мутации бесклеточной циркулирующей ДНК. Бесклеточную циркулирующую ДНК иногда называют «жидкой биопсией» 44-49 . Известно, что многие солидные опухоли выделяют свою ДНК, которая может попасть в кровоток или другие жидкости организма. В определенной степени такая ДНК может служить репрезентативным образцом для первичных опухолей. Тестирование такой ДНК может дать информацию о мутациях, подобную той, что получена при биопсии тканей.Поэтому забор бесклеточной ДНК иногда называют «жидкой биопсией». Образцы «жидкой биопсии» обычно представляют собой плазму или другие биологические жидкости, которые обычно легко доступны. Это особенно полезно для тех опухолей, биопсия которых затруднена или невозможна. Однако «жидкая биопсия» не лишена проблем. Разные опухоли выделяют ДНК по-разному. Определенная опухоль на разных стадиях может выделять ДНК по-разному. Многочисленные исследования «жидкой биопсии» были проведены для различных опухолей 50-57 .Анализ NGS использовался для тестирования жидкой биопсии. Для анализа NGS в «жидкой биопсии» ключевым вопросом является чувствительность теста. Для повышения чувствительности NGS можно использовать различные методы. Одним из них является уменьшение шумового фона. Например, молекулярный штрих-код можно использовать для маркировки исходных молекул-мишеней. Такую метку можно использовать в дальнейшем для устранения шумного фона с целью повышения чувствительности. NGS-тестирование «жидкая биопсия» также может использоваться в неинвазивном пренатальном тестировании 58-60 .Нет никаких сомнений в том, что NGS-тестирование — это мощная и революционная технология, которая вносит большой вклад в персонализированную и точную медицину.

Технология секвенирования следующего поколения в клинике и ее проблемы

Рак (Базель). 2021 апрель; 13(8): 1751.

Claus K.

Høgdall

2 Центр Джулианы Мари, отделение гинекологии, Rigshospitalet, Университет Копенгагена, DK-2100 Копенгаген, Дания; [email protected]

Катя Нонес, академический редактор

2 Центр Джулианы Мари, отделение гинекологии, Rigshospitalet, Университет Копенгагена, DK-2100 Копенгаген, Дания; кд[email protected]

Поступила в редакцию 9 марта 2021 г.; Принято 5 апреля 2021 г.

Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

Abstract

Simple Summary

Точная идентификация и аннотация мутаций имеют первостепенное значение в клинической онкологии. Понимание последовательности ДНК может дать значимые знания для разгадки лежащей в основе генетики болезни. Следовательно, адаптация персонализированной медицины часто зависит от специфического изменения генома для повышения эффективности лечения.Цель этого обзора — подчеркнуть, что секвенирование включает в себя гораздо больше, чем просто четыре нуклеотида. Более того, постепенный переход от технологий секвенирования первого ко второму поколению привел к осознанию выбора наиболее подходящих инструментов биоинформатического анализа в зависимости от цели, качества и потребности для конкретной цели. Таким образом, одни и те же необработанные данные могут привести к различным результатам, отражающим внутренние особенности различных конвейеров интеллектуального анализа данных.

Abstract

Анализ данных стал важнейшим аспектом в клинической онкологии для интерпретации результатов тестирования на основе секвенирования нового поколения.Способность NGS обрабатывать миллиарды реакций секвенирования за несколько дней, следовательно, увеличила потребность в инструментах для обработки и анализа таких больших наборов данных. С момента появления NGS было разработано множество инструментов со своими особенностями. Поэтому повышенная осведомленность при интерпретации изменений в геноме имеет первостепенное значение, поскольку одни и те же данные с использованием разных инструментов могут давать разные результаты. Следовательно, крайне важно оценивать и проверять биоинформационные конвейеры в клинических условиях.Более того, персонализированная медицина подразумевает лечение, направленное на эффективность биологических препаратов при определенных геномных изменениях. Здесь мы сосредоточились на различных технологиях секвенирования, функциях, лежащих в основе сложности генома, и биоинформационных инструментах, которые могут повлиять на окончательную аннотацию. Кроме того, мы обсуждаем клиническую потребность и дизайн внедрения NGS.

Ключевые слова: биоинформационный конвейер, рак, секвенирование нового поколения, выравнивание, определение вариантов, клиническое применение

1.Введение

Понимание последовательности ДНК может дать значимые знания для понимания генетики болезней. Этот подход вывел стратегии диагностики и лечения на новый уровень, где персонализированная медицина постепенно внедряется в клинику. Появление технологий секвенирования второго поколения, также известных как секвенирование следующего поколения (NGS), в значительной степени способствовало увеличению спроса на более экономичные и быстрые технологии секвенирования. NGS выполняет массовое параллельное секвенирование и неуклонно заменяет своего предшественника, традиционное секвенирование по Сэнгеру (Sanger et al., 1977) [1]. Его технологии позволили разрешить миллиарды реакций секвенирования за несколько дней от подготовки библиотеки до получения конечных результатов. Тем не менее, обработка такого значительного объема данных создает текущие проблемы в отношении их интерпретации клинически значимым способом. Следовательно, за этим спросом вскоре последовала разработка множества разработанных биоинформационных инструментов NGS, каждый из которых служит своей цели. Большинство вычислительных инструментов, таких как Bowtie2 [2], Burrows-Wheeler Aligner (BWA) [3], Mutect2 [4] и Strelka2 [5], свободно доступны для обработки данных NGS в рамках (i) картирования последовательностей, (ii) базовый вызов и (iii) вариантный вызов.Было показано, что применение различных инструментов различается по последовательности [6,7], что подчеркивает необходимость осторожности и опыта, поскольку результат может привести к неправильному диагнозу, прогнозу и персонализированному лечению в клинических условиях. В этом обзоре мы сосредоточились на многих факторах, влияющих на интерпретацию данных и их применение в онкологии. Это охватывает технологии секвенирования, выходные данные секвенирования, подводные камни и проблемы биоинформатики. Наконец, мы обсудили растущий клинический спрос на внедрение NGS.

2. Технологии секвенирования

Секвенирование – это процесс определения последовательности адениновых (А), гуаниновых (Г), цитозиновых (Ц) и тиминовых (Т) оснований, составляющих первичную структуру ДНК. Первые две методологии секвенирования ДНК известны как секвенирование Максама-Гилберта — химический подход [8] — и секвенирование по Сэнгеру — подход обрыва цепи [9]. Клиническая полезность секвенирования Максама-Гилберта неизвестна; следовательно, последний будет далее рассматриваться здесь. Секвенирование по Сэнгеру легло в основу проекта «Геном человека» [10] благодаря его точности, надежности и простоте [11].Вкратце, метод основан на 4 полимеразных цепных реакциях (ПЦР), где в каждую реакцию один из нуклеотидов встраивается с помощью специфического флуоресцентного дидезоксинуклеотида, обрывающего цепь (ddNTP). Включение ddNTP во время репликации ДНК in vitro происходит случайно, образуя фрагменты различной длины. Последующее разделение по размерам с помощью гель-электрофореза выявляет расположение нуклеотидов в зависимости от того, где фрагмент был терминирован [9]. Специфическая флуоресценция, встроенная в каждый ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP), позволяет читать и аннотировать последовательность.Несмотря на то, что это очень надежный и точный метод, секвенирование по Сэнгеру может выполняться только для одной цели за раз. Следовательно, оценка даже небольшой группы целей делает этот подход неэффективным с точки зрения затрат и времени.

Применение более быстрого и дешевого секвенирования было представлено технологиями NGS. Такие платформы, как Illumina и Ion Torrent, преимущественно используются в клинических условиях. Эти две платформы отличаются лежащей в их основе химией определения базовых последовательностей.На платформах Illumina сначала подготавливается библиотека (шаблоны ДНК с прикрепленными штрих-кодами и адаптерами), после чего следует денатурация до отдельных цепей и иммобилизация на проточной кювете. Затем матрицы амплифицируют с образованием кластеров клональных фрагментов путем мостиковой амплификации [1]. Этот шаг важен для получения достаточного сигнала для обнаружения во время секвенирования. Методология секвенирования Illumina основана на циклическом обратимом обрыве цепи красителя, в котором ddNTP содержит различную расщепляемую флуоресценцию и обратимую блокирующую группу.Для каждого раунда секвенирования (1) в проточную ячейку добавляется нуклеотид; (2) флуоресцентные сигналы улавливаются и преобразуются в A, T, C или G; (3) удаляются блокирующие группы; и (4) процесс повторяется с новым циклом включения нуклеотидов до тех пор, пока нити не будут синтезированы. Технология секвенирования Ion Torrent основана на включении шаблона ДНК из подготовленной библиотеки вместе с одной гранулой в каплю, называемую эмульсией гранул. Каждая реакционная единица позволяет проводить эмульсионную ПЦР для клональной амплификации матрицы до тех пор, пока она не покроет всю поверхность соответствующего шарика. Этот шаг аналогичен проточной ячейке Illumina, он дает достаточный сигнал во время секвенирования. Покрытые гранулы загружаются на чип, состоящий из миллионов микроячеек, в каждой из которых находится одна гранула. Процесс секвенирования основан на рН. Каждый раз, когда нуклеотид добавляется к синтезирующей матрице, высвобождается H + (ион водорода), который определяется как изменение pH, чип заполняется одним нуклеотидом за раз, и процесс повторяется сотни раз.

В течение последних нескольких лет разрабатывались методы секвенирования нового поколения.В отличие от технологий NGS, генерирующих короткие чтения, секвенирование третьего поколения (TGS) направлено на создание длинных чтений длиной до 30 000 оснований (30 кб) в режиме реального времени [12]. MinION от Oxford Nanopore Technologies (ONT) и технология одномолекулярного реального времени (SMRT) от Pacific Bioscience (PacBio) представляют собой два типа технологии TGS. TGS обходит необходимое условие для амплификации ДНК, лежащее в основе технологий NGS [11]. Следовательно, избегая унаследованных ошибок на этапе амплификации и создавая быстрый переход от сбора образцов к секвенированию.Тем не менее, частота ошибок секвенирования по-прежнему высока, 10-15% для SMRT [13] и 5-20% для MinION [13], что ставит под сомнение его полезность в клинических условиях. Краткое сравнение технологий представлено в .

Таблица 1

Платформы для секвенирования и сравнение.

1
S5XL
Платформа Immobilization Усиление Sequencing
Технология
Ограничения
& Ошибка
Длина чтения (BP *) RUN Time
(H **)
Выход
(GB ** *)
1-го поколения Technologies
Sanger N / A ПЦР с DNTPS и DDNTPS Необратимая цепочка
Терминал
0. 001% ≤900 ~ 4 ~ 4 ~ 4 ≤0.002
Maxam-Gilbert N / A N / A N / A Химическое прекращение
из 32 P с мечественной SSDNA
0,001% ≤ 900 N / A N / A ≤0. 002 ≤0.002
2-й Генерация Технологии
ГисК2000 Расходовольственная клетка Усиление моста Мостовая амплификация Циклическая обратимая цепная цепь на красителю ГХГ-богатые области
0.2%
≤125 ≤125 7-144 ≤1600
Усиление моста Усиление моста Циклическая обратимая цепная цепь красителя ГК-богатые области
0,2%
≤300 ≤300 ≤300 ≤300 ≤300 ≤300 4-55 ≤15 ≤15
Ион Torrent
PGM
Эмульсия из бисера Эмульсия Эмульсия
PCR
Синтез зависит от H + Обнаружение Homo-Polymers
1% Indel
2-400 2- 7. 5 ≤2 ≤2 ≤2
Эмульсия из бисера Эмульсия Эмульсия
PCR
Синтез в зависимости от H + Обнаружение Homo-Polymers
1% Indel
≤600 2,5-4 ≤25
302200 3RD General Technologies

Minion
N / A N / A Мониторинг тока нуклеотида в SSDNA 5-20% 10 000-30 000 Real Время ≤25 ≤25
PACBio
SMRT
ДНК насадка на дно каждого нулевого режима волновод N / A Обнаружение включения флуоресцентных нуклеотидов во время синтеза в реальном времени 10-15% 10-15% 10 000 –30 000 В режиме реального времени ≤4

3.

Расширение секвенирования

Геном человека состоит примерно из 3 миллиардов нуклеотидов, из которых около 1% кодирует гены, кодирующие белок [14]. Мутации, введенные в эти гены, могут иметь последствия в виде неправильного функционирования (потеря функции) или нарушения регуляции (приобретение функции) белков, имеющих решающее значение для гомеостаза, что приводит к раку. Мутации определяются как драйверные мутации при приобретении клеточного фенотипа, который способствует пролиферации и/или выживанию [15].Помимо драйверных мутаций, геном содержит тысячи мутаций, которые случайным образом разбросаны по всему геному. Они называются мутациями-пассажирами и не проявляют немедленного фенотипа и/или полезного преимущества [16]. В 80% случаев рак является многофакторным и неменделевским заболеванием, при котором в ассоциированных генах обнаруживаются соматические мутации [17]. В остальных 20% выявляют герминальные мутации [17]. Идентификация редких событий в генах, способствующих онкогенезу, важна для постоянного понимания рака [18]. NGS привел к открытию многочисленных кандидатов, связанных с раком [19]. Примечательно, что обнаружение вариантов с помощью биоинформационных методов может отдавать приоритет только новым открытиям мутаций и генов для функционального тестирования. Следовательно, только мутации могут быть драйверами онкогенеза, что требует проверки в экспериментальных условиях [20]. Таким образом, биоинформационные инструменты следует воспринимать скорее как предсказатель, чем как валидатор.

NGS позволяет генерировать данные из полного генома (полное секвенирование генома, WGS) за несколько рабочих дней.Также стали доступны секвенирование кодирующих белок генов (секвенирование полного экзома, WES) и экзомное секвенирование выбранных генов отдельно или в сочетании с областями «горячих точек» (целевое секвенирование экзома, TES и панельное секвенирование, PS). В клинической онкологии последний подход широко используется из-за его способности нацеливаться на панели генов, связанных с раком, с быстрым временем отклика. Широкие возможности WGS и WES демонстрируют некоторые проблемы, которые необходимо внедрить в клиническую практику (обсуждается позже).Таким образом, чтобы предоставить информацию о диагностической классификации, направить терапевтические решения и/или уточнить прогноз опухоли в более короткие сроки, оценка генных панелей является информативным подходом.

4. Таргетная лекарственная терапия

Некоторые методы лечения рака полагаются на определенный геномный профиль для достижения эффективности лечения. Поэтому точное обнаружение мутаций имеет решающее значение. Секвенирование по Сэнгеру до недавнего времени использовалось в диагностике, несмотря на то, что оно ограничивалось несколькими генами. Следовательно, предоставление онкологам ограниченной информации о мутационном профиле опухоли приводит к более универсальному типу терапии [21].Однако, учитывая огромное количество информации, NGS способствовала созданию основы для борьбы с болезнями на основе индивидуального геномного профиля, называемой персонализированной медициной или прецизионной медициной (PM). Эта концепция дает возможность выработать точную и эффективную стратегию лечения [22].

Точная аннотация мутаций необходима для преобразования ошеломляющего количества данных секвенирования в клинически значимые варианты с высокой достоверностью. Отсюда выдвигается оптимальная адаптация терапевтического курса.Например, препараты, ингибирующие поли(АДФ-рибозо)полимеразу (PARP), используются при лечении больных раком яичников [23] и раком молочной железы [24] в случаях патогенных мутаций генов BRCA-1/2 — .

Кроме того, иматиниб, малая молекула, которая конкурентно связывается с активным участком тирозинкиназы, используется для лечения желудочно-кишечных стромальных опухолей в случаях мутаций гена c- KIT [25]. Более того, конкурентные ингибиторы киназы направлены на повышение активности BRAF , индуцированное специфическим изменением (V600E/K) в гене BRAF у пациентов с диагнозом злокачественная меланома [26]. Мутации KRAS наблюдаются в 15–25% всех случаев рака, при этом 30–40% колоректального рака содержат по крайней мере одну мутацию в этом гене [27]. С другой стороны, ингибитор рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), нацеленный на EGFR на поверхности клетки, используется в случаях колоректального рака без мутаций в генах RAS- [28]. Подборка специфических генетических изменений для руководства лечением представлена ​​в .

Таблица 2

Примеры генетических аберраций при раке для руководства персонализированной медициной.Список составлен на основе информации, полученной от COSMIC, ClinVar и OncoKB.

Ген Аберрация Целевое лекарство Тип рака
BRCA-1/2 Потеря функции PARP-ингибитор Рак молочной железы,
Рак яичников,
Рак предстательной железы
ERBB2/HER2 Амплификация Ингибитор димеризации HER2-HER3 Рак молочной железы
ПИК3КА Приобретение функции Ингибитор киназы PIK3 Рак молочной железы
БКЛ2 Приобретение функции
(делеция 17 п. н.)
Блокатор Bcl-2 Хронический лимфолейкоз
РАН Дикий тип Ингибитор EGFR Колоректальный рак
c-КОМПЛЕКТ Приобретение функции
(экзоны 9, 11, 13 и 17)
Ингибиторы тирозинкиназы Гастроинтестинальная стромальная опухоль
ЭГФР Приобретение функции (делеция экзона 19 и/или L858R) Ингибиторы тирозинкиназы Рак легкого,
Рак головного мозга
БРАФ Приобретение функции (V600E/K) Ингибитор киназы Меланома
CDK12 Потеря функции Ингибитор PARP Рак предстательной железы

Дополнительный инструмент аннотации — базы данных лекарственных средств

Многие варианты имеют хорошо установленную клиническую значимость в отношении мишеней для молекулярной терапии. Тем не менее, принятие решений о лечении новых или редких соматических мутаций может оказаться сложной задачей. В связи с этим растущие базы данных вариантов и предположительно полезного молекулярного нацеливания лекарств находятся в постоянном развитии и могут быть полезными инструментами для помощи в руководстве, например, Каталог соматических мутаций при раке (COSMIC) [29,30], ClinVar [31,32 ] и базу знаний Precision Oncology (OncoKB) [33]. Содержание этих баз данных получено из проверочных исследований in vitro и/или in vivo и экспертных групп по клиническим исследованиям.С внедрением NGS в клинику такие базы данных неуклонно растут и совершенствуются как средство помощи в лечении будущих пациентов.

5. Меры предосторожности при выводе данных при секвенировании

Общая потребность в секвенировании заключается в аннотировании точных мутаций, таких как однонуклеотидные варианты (SNV), вставки/делеции (indels), вариации числа копий (CNV) и структурные вариации (SV). ). В идеале это должно быть получено с высокой чувствительностью (истинно положительные) и специфичностью (истинно отрицательные).Общий принцип секвенирования заключается в том, что чем шире охват, тем меньше глубина чтения. WGS в среднем секвенируется до глубины 30–50x [34], что делает его более ориентированным на исследования, но достаточно эффективным для выявления большинства мутаций зародышевой линии, включая SNV и indels. Это также позволяет проводить всестороннее крупномасштабное геномное обнаружение соответствующих вариантов, таких как большой SV или CNV, по всему геному [35]. Однако WGS может быть недостаточным для обнаружения редких соматических мутаций, несущих раковый геном.

Терапевтические средства, доступные сегодня, направлены исключительно против патогенных изменений в кодирующем геноме. Таким образом, знания о мутациях в интронных областях менее информативны в клинической онкологии. В этом отношении для этой цели больше подходят WES или большие генные панели, где регионы могут достигать среднего охвата 200x [34]. Однако целевое секвенирование фокусируется на секвенировании выбранных областей, часто генных панелях, связанных с раком в определенных органах с клиническим эффектом. Сужая область до выбранной панели, гены и области горячих точек могут быть секвенированы на глубину с более чем 1000-кратным охватом [34].Это влечет за собой его способность достигать глубины, способной обнаруживать уникальные низкочастотные аллельные соматические мутации.

NGS — это многофакторная технология, поэтому при интерпретации результатов важно соблюдать осторожность. Факторы, которые могут повлиять на результаты, включают в себя; тип биологического образца; преаналитическое лечение; псевдогены и повторяющиеся области; биоинформационные проблемы, связанные с выравниванием и вызовом вариантов.

5.1. Тип биологического образца

Биологические образцы различаются в зависимости от того, был ли материал собран в исследовательском центре или в клинических условиях.Исследовательские учреждения чаще всего имеют дело с культивируемыми клетками и/или моделями ксенотрансплантатов, оставляя ДНК высокого качества для секвенирования. Когда человеческая ткань берется из биопсии или радикальной хирургии в клинических условиях, она обычно подвергается фиксации формалином и заливается в парафиновые блоки (FFPE) или оптимально может быть собрана в виде свежезамороженной (FF) ткани.

5.1.1. FF и FFPE Tissue

В отделениях патологии ткани обычно готовят с помощью FFPE, который хранится при комнатной температуре и обеспечивает большую гибкость в применении.Образцы FFPE используются при гистопатологическом исследовании, иммуногистохимии и/или гибридизации in situ. Таким образом, что позволяет провести дальнейшую молекулярную характеристику опухоли. Однако химическая процедура, лежащая в основе образцов FFPE, способствует значительной фрагментации и химически искусственным модификациям нуклеиновых кислот, изменяя последовательность ДНК [36]. Фиксация формалином является основной причиной фрагментации, деградации и включения изменений, вызванных дезаминированием, что приводит к переходам C:G > T:A [37].Следовательно, эти модификации могут ввести в заблуждение при интерпретации результатов NGS и потенциально привести к неточному терапевтическому курсу в клинических условиях. Недавнее исследование, проведенное Гао и его коллегами, сообщает о высокой мутационной согласованности, сравнивающей FF и FFPE в мультигенной панели NGS [38]. Однако некоторые мутации вносятся из-за более высокого уровня ложноположительных вариантов. Керик и его сотрудники также сообщили, что одной из стратегий борьбы с артефактами FFPE является увеличение глубины секвенирования [39]. Следовательно, приращение глубины уменьшает количество ложных срабатываний и ложных отрицаний.Еще одним вариантом является более строгая фильтрация выравнивания, обеспечивающая удаление предполагаемых ложноположительных вызовов с более низкими показателями качества, но, с другой стороны, этот подход снижает глубину чтения.

5.1.2. Жидкая биопсия

Жидкая биопсия — еще один препарат, используемый для клинического NGS. Сбор цельной крови является неинвазивной процедурой и используется для поддержки диагностики и/или мониторинга циркулирующих биомаркеров. Например; раковый антиген 125 (CA-125) для рака яичников [40]; СА-11-19 для колоректального рака [41], СА-19-9 для рака легкого [42] и СА-15-3 для рака молочной железы [43] хорошо зарекомендовали себя в клинической практике. Циркулирующая опухолевая ДНК (цтДНК), бесклеточная ДНК, полученная из опухоли, может быть многообещающей в диагностике рака и/или мониторинге рецидива или прогрессирования [44]. Следовательно, также применимо для руководства лечением и мониторингом у пациентов с известным раком. Повышенный уровень цДНК присутствует в плазме онкологических больных [45]. Тем не менее, это количество по-прежнему составляет лишь небольшую часть пула циркулирующей внеклеточной ДНК, что ставит под сомнение текущую полезность цтДНК в качестве биомаркера. Примечательно, что обнаружение соматических мутаций в ctDNA для применения в диагностике рака, вспомогательном руководстве для оптимальной стратегии лечения и для наблюдения за прогрессированием или рецидивом широко исследуется [45].цДНК попадает в плазму за счет апоптоза и/или некроза. Отличительной чертой апоптоза является расщепление ДНК, управляемое активированной активностью каспазы. Исследование Mouliere и соавторов показало, что размер фрагмента в 18 типах рака показал обогащение ctDNA длиной менее 167 п. н. и заметное обогащение в диапазоне от фрагмента размером от 250 п.н. до 320 п.н. [46]. Анализ цДНК требует высокочувствительных методов для ее обнаружения и обогащения из-за относительно низкой доли опухолевой ДНК, рассеянной в пределах фоновых уровней нормальной циркулирующей свободной ДНК [47].Исследование ctDNA из жидкой биопсии может быть альтернативой в лечении метастатического рака, когда невозможно получить опухолевую ткань.

5.2. Гомополимеры, повторяющиеся области и псевдогены

В геноме есть области, которые трудно интерпретировать из-за присутствия гомополимеров, областей, богатых G/C, повторяющихся областей и псевдогенов [48]. Это приводит к существенным различиям в отношении глубины секвенирования и однородности охвата секвенирования, что делает эти регионы трудными для выравнивания и определения вариантов [49].Например, гомополимерные области являются проблемой для платформы секвенирования Ion Torrent, и она вносит систематические ошибки из-за потери разрешения выше 6 нуклеотидов, что может привести к неправильному выравниванию [21]. Области с повышенным содержанием G/C могут быть потеряны и впоследствии часто наблюдаются как более высокий фон из-за их способности образовывать вторичные структуры [48], что влияет на однородность охвата секвенирования в этих областях. Повторяющиеся участки широко распространены в геноме и кодируют тандемно повторяющиеся или близко идентичные последовательности переменной длины, часто расположенные в участках интронов [50].Таким образом, это горячая точка для геномной перестройки. Проблема с повторяющимися областями заключается в том, чтобы иметь дело с неопределенностями выравнивания из-за считываний, которые впоследствии выравниваются по нескольким областям, а не по уникальному местоположению. Чтения множественного выравнивания являются препятствием, которое может повлиять на вызов вариантов, поскольку они могут исходить из нескольких сайтов. Другой тип структурных особенностей, встроенных в геном, — это псевдогены, полученные в результате дупликации генов. Псевдогены — это последовательности, которые очень похожи на свои аналоги, кодирующие белок. Однако они нефункциональны из-за повреждающих мутаций [51]. Несмотря на то, что они нефункциональны, некоторые псевдогены транскрипционно активны и регулируют свой родительский ген, кодирующий белок, посредством пути микроРНК [52,53]. Чтения из желаемой интересующей области могли иметь сниженное качество картирования из-за присутствия гомолога псевдогена, вызывающего неправильное выравнивание ридов с псевдогенами или наоборот. Некоторые клинически значимые гены могут встречаться с псевдогенами, например, KRAS [53] для колоректального рака и BRCA1 [54] для рака яичников и рака молочной железы.Поэтому требуется целевая стратегия, чтобы избежать помех со стороны их псевдогенов, которые могут поставить под сомнение интерпретацию во время анализа NGS.

5.3. Биоинформатика

В последние годы стало доступно большое количество биоинформационных инструментов с целью навигации и обработки большого количества необработанных данных, генерируемых технологией NGS [55].

Необработанные операции чтения с платформ NGS подвергаются нескольким биоинформационным процессам, включая базовый вызов; проверка качества; обрезка адаптера; выравнивание чтения и постобработка; вариант вызова; и, наконец, вариантная аннотация для функциональной интерпретации результатов.Общий биоинформационный конвейер, доступный для анализа NGS, показан на рис. Двумя наиболее важными биоинформационными процессами, которые могут повлиять на окончательную интерпретацию, являются инструменты, используемые для выравнивания и определения вариантов [6,7]. Оба они многочисленны и разнообразны по своим базовым алгоритмам, поскольку их первоначальный дизайн часто может быть зарезервирован для конкретной цели, такой как WGS, WES или TES/hot-spot [56]. Проблемы, связанные с артефактами используемого материала, подготовкой библиотеки, технологиями секвенирования и регионами, выбранными для секвенирования, подчеркивают важность выбора подходящих контрольных инструментов для конкретных целей. Различные структурные особенности четырех групп геномных изменений (SNV, indels, CNV, SV) исключают возможность использования одного универсального инструмента для идентификации всех вариантов внутри четырех групп [48]. Неправильное выравнивание с эталонным геномом может в значительной степени означать обнаружение ложноположительных результатов и/или исключение вариантов, имеющих отношение к заболеванию, в последующем анализе. За прошедшие годы идентификация несоответствия между выровненными чтениями и эталонным геномом значительно улучшилась из-за прогрессии вызывающих вариантов и их способности обрабатывать большие объемы данных [57].Однако вызов SNV все еще остается проблемой, поскольку различные инструменты могут привести к разным результатам [6].

Схематическое представление общих этапов рабочего процесса анализа NGS.

5.3.1. Согласование

Биоинформационные подходы основаны на выравнивании. Варианты относятся к выявлению отклонений от неракового нормального эталонного генома. Выравнивание по эталонному геному является необходимым условием для оптимального анализа данных NGS. В связи с этим для генома человека в настоящее время используются по существу две основные эталонные сборки: (a) сборка 37 человеческого консорциума по эталонным геномам (GRCh47 или hg19), опубликованная в 2009 г.; и (б) ГРЧ48 (hg38), выпущенный в 2013 г.Последний построен на данных от многих доноров, с последующим изменением 8000 SNV, исправлением неправильно собранной труднодоступной области, заполнением пробелов и добавлением последовательностей для центромер [58]. Pan et al. сообщили об улучшениях GRCh48 по сравнению с GRCh47 для получения более точных результатов геномного анализа [59]. Дополнительные исследования Guo et al. и Kumaran et al. изучили 30 наборов данных WES, изучив данные WES из NA12878 [6,58] соответственно. В обоих исследованиях они пришли к выводу о большей точности и производительности, используя hg38 в качестве эталонного генома.Сообщалось, что элайнеры могут влиять на выбор варианта при работе с базовыми баллами низкого качества [57,60].

Список инструментов выравнивания представлен в . Инструменты выравнивания Bowtie2 [2] и BWA [3] известны как два наиболее эффективных выравнивателя на сегодняшний день, при этом в большинстве исследований в качестве предпочтительного инструмента выравнивания используется BWA-MEM (максимальное точное совпадение) [6, 57, 59, 61, 62]. ,63,64,65,66,67]. В исследовании, проведенном Ю и его сотрудниками, были изучены три выравнивателя полнотекстового индекса в минутном пространстве (FM) (Bowtie2, BWA-MEM, SOAPv2) и один выравниватель алгоритма хеш-таблицы (Novoalign) [60].Предварительные условия с относительно хорошим базовым качеством показали аналогичную производительность при выравнивании [60]. Однако удаление базы низкого качества улучшило эффективность выравнивания Новолайн [60]. Качество вызванных баз может значительно повлиять на производительность выравнивателей, где оценка Phred может помочь в выборе наиболее подходящего инструмента выравнивания (алгоритм на основе FM-индекса или хеш-таблицы).

Таблица 3

Инструменты для выравнивания коротких считываний.

9 9 9
Инструменты для центровки Модель Последняя версия Ref.
Bowtie2 FM-Index V2.4.2 [2] [2]
BWA-MEM FM-index V0. 7.17 [3]
Cushaw3 FM-Index V3.0.3 [72] [72] [72] [72]
GSNAP Hash-Table N / A [73]
ISAAC FM-index 74]
MOSAIK Хеш-таблица v2. 6.0 [75]
NovoAlign 0 Hash-Table Hash-Table V4.03.01 http://www.novocraft.com/ *
SOAPV2 FM-index V2.20 [76]

Вкратце, инструменты выравнивания FM-индекса получены из преобразования Берроуза-Уилера [68] — метода достаточного сжатия больших объемов данных и поиска приблизительных совпадений последовательностей в эталонном геноме [69]. ]. Выравниватели на основе хеш-таблиц используют метод начального и расширенного выравнивания в сочетании с дополнительными алгоритмами выравнивания [68,70,71].

До сих пор инструменты выравнивания коротких ридов обычно сталкиваются с трудностями при обнаружении ридов, которые сопоставляются с несколькими местоположениями в эталонном геноме [50]. Следовательно, предлагаются 3 стратегии для работы с множественными чтениями [50]. Во-первых, отбросить все множественные чтения, оставив для обработки только уникальные сопоставленные чтения. Однако эта стратегия, следовательно, не учитывала чтения с повторяющимися областями и семействами генов, предположительно имеющими важное значение. Во-вторых, это лучшая стратегия сопоставления, сообщающая о чтении в расположение (я) с наименьшим количеством несоответствий.Третий заключается в том, чтобы сообщать обо всех чтениях и их местонахождении до желаемого порога.

5.3.2. Variant Calling for SNV and Small Indels

Аналогичным образом было разработано множество инструментов для обнаружения SNV. Список поддерживаемых инструментов вызова вариантов представлен в . Следовательно, лежащий в их основе алгоритм моделей ошибок и допущения для выявления мутаций приводят к вызову разнообразных вариантов в разных инструментах [67]. Следовательно, методы, используемые для вызова вариантов, являются важным фактором, влияющим на вызов мутаций при стремлении к высокой чувствительности и специфичности.Исследования выборки NA12878 [6, 57, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67] показывают, что вызывающий гаплотип GATK (GATK-HC), Mutect2, SAMtools и Strelka2 являются одними из самых эффективных вызывающих вариантов. для выявления SNV и малых вставок [6,57,59,61,62,63,64,65,66,67]. Исследование Chen et al. дополнительно показало, что Strelka2 показал лучший вызов вариантов и чувствительность с частотой мутаций ≥20%, тогда как Mutect2 показал лучшие результаты при ≤10% [62]. Strelka2 была разработана для быстрого и точного вызова соматических вариаций [5].Важным аспектом при использовании в клинической онкологии является быстрое время разрешения. Strelka2 показала себя в 18–22 раза быстрее Mutect2 при обработке 100–800-кратных выборок WES [62]. Тем не менее, всестороннее сравнение GATK-HC, Mutect2, SAMtools и Strelka2 друг с другом еще предстоит выяснить. Обзор инструментов и их комбинации в этих исследованиях показан на .

Таблица 4

N / A N / A 0
Средства вызова вариантов Обнаружение вариантов Последняя версия Ref.
ATLAS2 Suite SNV, Indels V1.4.1 [77] [77]
CNV, SV V2. 0.8 [78]
CNVнатор CNV, SV V0.4 [79] [79]
CRVEX 0 CNV, SV N / A [80] [80]
SNV, Indels V1. 0 [81]
ДЕЛЛИ CNV, SV v0.8.7 [82] 9 [82]
Exomecnv CNV, SV [83] [83] [83] [83] [83]
Freebayes SNV, Indels V1. 3.4 [84]
Gatk Haplotype Raller
(Gatk-HC)
SNV, Indels V4.1.9.0 [85,86]
GLFSingle SNV, Indels N / A
ISAAC Variant Caller (IVC) SNV, вставки V2.0.13 [74] 9 [74]
Cumby CNV, SV V0. 3.1 [87] [87]
Magnolya CNV, SV V0.15 [88]
Metuct SNV, Indels V1.1.5 [89] [89]
SNV, Indels V4. 1.9.0 [4]
Pinkel CNV, SV N / A [90] [90]
Platypus SNV, Indels, SV N / A [91]
Samtools SNV, Indels v1. 11 [92] [92]
Snpsvm SNV N / A [93] [93] [93] [93]
Snv SNV V1.0.5.0 [94]
SpeedSeq SNV, Indels V0. 1.2 [95] 9 [95]
SNV, Indels N / A [96]
STRELKA2 SNV, Indels V2.9.10 [5]
SVMerge CNV, SV v1. 2 [97] [97]
Torrent Variant Raller (TVC) SNV, Indels, SV V5.12.0 N / A
Ulyssses CNV, SV V1.0 [98]
Varscan2 SNV, Indel v2. 4.4 [99]

Таблица 5

Обзор инструментов выравнивания и вариантов вызова инструментов в научно-исследовательских работ подвергающих образца NA12878.

9022 et. 2015 [64] 2019 [63] Pan
Исследовательская работа Испытуемый образец Эталонный геном Инструмент выравнивания Инструмент вызова вариантов
0 Chenetal.2019 [61] NA12878 WES
WGS
BWA-MEM GATK-HC
SAMtools
Стрелка2
VarScan2
6 1 1 1 2020 [62] WES BWA-MEM Mutect2
Стрелка2
Cornish et al. 2015 [57] WES Bowtie2
BWA_MEM
CUSHAW3
MOSAIK
Novoalign
SAMtools
SNPSVM
WES
WGS
Bowtie2
BWA-MEM
Novoalign
FreeBayes
GATK-HC
SAMtools
TVC
Wes
WGS
Bowtie2
BWA-МЕМ
GSNAP
ИСААК
Novoalign
SOAP2
Atlas2
FreeBayes
GATK-HC
glfSingle
НПВ
Платипус
SAMtools
люкс
VarScan2
Кумаран и другие. 2019 [6] WES WES Bowtie2
BWA-MEM
Mosaik
Novoalign
MOSAIK
GATK-HC
Глубоковарный
FreePayes
Samtools
Meng et al.2018 [65] TES
WES
WGS
BWA-MEM DeepVariant
Ланцет
Стрелка2
VarScan2
2019 [59] WGS Bowtie2
BWA-MEM
ISAAC
Novoalign
FreeBayes
GATK-HC
IVC
SAMtools
902 2018 [66] WES
WGS
BWA-MEM DeepVariant
GATK-HC
SpeedSeq
Xu et al. 2014 [67] WES BWA-MEM Mutect
SomaticSniper
Стрелка
VarScan2
5.3.3. Вариант, требующий CNV и SV

Как CNV, так и SV обычно связаны с заболеваемостью раком [100], [101]. CNV охватывает соматические структурные изменения амплификации и/или делеции участков ДНК в хромосомном регионе [48]. ERBB2 (HER2) является примером гена, часто связанного с повышенным числом копий при раке молочной железы и клинической значимостью для обнаружения [102], в то время как варианты TP53 часто наблюдаются как потеря аллеля дикого типа [103].SV охватывает структурные изменения с точки зрения крупных транслокаций и хромосомных перестроек [48]. Создание известных и новых онкогенных слитых белков, а также установление близости регуляторных элементов для транскрипции мРНК может косвенно влиять на функцию клеток, способствующую развитию рака [104].

Инструменты для идентификации SNV и небольших вставок не подходят для вызова вариантов CNV и SV. Существует ряд инструментов для вызова CNV и SV, как показано на рис. Однако этим хромосомным изменениям свойственны определенные проблемы.Более того, технологических ограничений коротких прочтений, генерируемых NGS (~150 п.н.), недостаточно для разрешения длинных вставок и дублированных областей [105]. Таким образом, продолжающееся развитие технологий TGS будет способствовать более точному распутыванию CNV и SV. Внедрение частоты вариантного аллеля может быть полезно для получения намеков на CNV и SV, поскольку частота вариантного аллеля будет увеличиваться или уменьшаться с количеством копий [106].

Вариант, требующий CNV и SV, содержит различные стратегии для идентификации модификаций, включая сопряжение чтения, глубину чтения, раздельное чтение и чтение-сборку.Спаривание чтения — это обнаружение того, какие пары чтения выровнены с увеличенным или уменьшенным расстоянием и/или ориентацией [105]. Этот метод во многом зависит от размера вставки, так как алгоритм может игнорировать или пропускать небольшие вставки [107].

Метод глубины считывания предполагает распределение Пуассона по глубине выровненных чтений и исследует распределение чтений для выявления дубликатов и/или удалений. Таким образом, дублированные области показывают увеличенную глубину чтения, тогда как удаленные области показывают уменьшенную глубину чтения по сравнению с нормальными диплоидными областями [108].Картированные чтения с низкой достоверностью в областях повторяющейся ДНК ставят под сомнение точность статуса количества копий и могут привести к смещенным выводам [107].

Подход с раздельным чтением использует пары чтения для определения контрольных точек структурных вариантов. Концепция метода основана на считываниях, которые с высокой достоверностью согласуются со ссылкой. Следовательно, невыровненное чтение может потенциально определить точку разрыва вставки [109]. Однако подход с разделенными чтениями имеет ограничения, поскольку чтения ниже 1000 оснований влияют как на чувствительность, так и на специфичность [109]. Наконец, метод чтения-сборки теоретически является наиболее универсальным подходом для идентификации вариантов. Как предполагает метод, он основан на сборке базового каркасного генома считывания, который впоследствии сравнивается с эталонным геномом для выявления вариантов [109]. Тем не менее, этот метод требует значительных вычислительных ресурсов и чтений большей длины, поэтому его пока нецелесообразно использовать для обнаружения CNV и SV.

6. Клинический спрос

Помощь NGS для диагностики, прогнозирования и улучшения точной медицины постепенно внедряется в клинику.Кроме того, геномные исследования стали областью влияния для определения приоритетности мутаций для функционального тестирования. Таким образом, способствуя раскрытию механизмов и лучшему пониманию рака, можно разрабатывать новые таргетные препараты. В клинической онкологии внимание к конкретным генам/горячим точкам используется для принятия решения о лечении. Стратегия обогащения на основе ампликонов ПЦР, лежащая в основе генных панелей, имеет несколько преимуществ для клинического применения. Здесь можно отметить его низкую потребность во входной ДНК, быстрое время разрешения, применение к FFPE и способность достигать большей глубины секвенирования [62,67,110].Кроме того, эта стратегия может обрабатывать несколько образцов (пациентов) в одном рабочем процессе. Кроме того, предположение о гомогенности первичной опухоли малообещающе, поскольку было показано, что первичная опухоль часто содержит субклоны гетерогенного и/или эволюционного происхождения [111]. Поэтому тесное сотрудничество с патологоанатомом важно для получения правильной ткани для анализа NGS. Достижение большей глубины секвенирования позволяет потенциально исследовать редко встречающиеся мутации в низкой клеточности опухоли и/или в субклонах.Эта идентификация может способствовать уточнению диагноза, клинического ведения и/или прогноза благодаря знанию лекарственной устойчивости до начальной терапии [112]. Важнейшим элементом обнаружения вариантов является точность и воспроизводимость названных идентифицированных вариантов. Следовательно, оценка и проверка инструментов/конвейеров должны сравниваться с четкими вариантами из ранее четко определенных образцов [106].

Уровень ложноположительных результатов можно контролировать как с помощью исследуемого образца, так и с помощью фильтров, применяемых во время биоинформатического анализа, сводя к минимуму их влияние.Образцы FFPE содержат тысячи артефактов [113], которые могут удалять низкочастотные истинные варианты во время фильтрации. Поэтому крайне важно учитывать тип образца, чтобы использовать более точные фильтры и важность проверки конвейера. Многие исследования сравнивали элайнеры и варианты вызывающих устройств с точки зрения их эффективности, делая вывод об ограниченной согласованности [6,57]. Фильтры, встроенные в выравниватели, фокусирующиеся на несоответствиях, можно настроить, чтобы разрешить или исключить меньшее или большее количество несоответствий во время выравнивания.При большем количестве несовпадений это также увеличивает вероятность того, что фрагмент ДНК выровняется со сходными областями. Таким образом, приращение ложноположительных результатов при вызове вариантов. С другой стороны, сужение фильтров выравнивания до нескольких несоответствий может привести к тому, что истинно положительные варианты с большим количеством несоответствий будут исключены. Жесткие фильтры можно настроить в большинстве инструментов выравнивания и вызова вариантов для работы со сложными областями (гомополимерными и повторяющимися областями).Это решается либо полным отбрасыванием вариантов в этих областях, либо применением ручных эмпирических фильтров, таких как пороги охвата, Phred-оценка и p -значений [114]. Важно отметить, что увеличение или уменьшение фильтров, идентифицирующих меньшее количество или дополнительные варианты в клинических условиях, не обязательно полезно для пациента. Если идентифицированные дополнительные варианты являются артефактами в соответствующих генах, то это потенциально может привести к неправильному терапевтическому курсу. Кроме того, дополнительной проблемой в клинических условиях является обработка мутаций зародышевой линии. Образцы опухоли обычно исследуют без аналога зародышевой линии (т. е. нормальной ткани). Следовательно, применение нормального образца у одного и того же пациента может помочь уменьшить количество вариантов зародышевой линии.

Следует соблюдать особую осторожность при настройке и интерпретации NGS-анализа на основе клинических данных, поскольку на результат могут влиять многие факторы. Многие ответы могут быть интригующими, но правильный ответ — тот, который полезен для пациента. Следовательно, критическая проверка конвейеров для клинической полезности имеет первостепенное значение.

7. Выводы

Появление NGS значительно улучшило изучение генетики, а также диагностику и лечение генетических заболеваний. Однако возможность упорядочивать миллиарды реакций за короткий период времени создает потребность в аналитических инструментах для обработки этих больших наборов данных. Надежные конвейеры для анализа NGS пользуются постоянным спросом, поэтому инструменты выравнивания и инструменты вызова вариантов все еще совершенствуются и являются активной областью исследований. Из литературы сообщалось, что комбинация инструментов выравнивания и инструментов вызова вариантов имеет тенденцию различаться по последовательности.Интересно, что мы обнаружили, что из 10 исследований с участием образца NA12878, BWA-MEM или Bowtie2 в сочетании со Strelka2 или Mutect2 являются одними из наиболее эффективных конвейеров для обнаружения SNV. Обнаружение CNV и SV затруднено из-за дупликаций/делеций областей внутри гена и/или транслокации. Подход «чтение-сборка» перспективен для обнаружения CNV/SV. Тем не менее, для идеального функционирования требуются более длительные интервалы чтения, чем в настоящее время обеспечивается существующей технологией NGS, и обширные вычислительные ресурсы.Текущие улучшения для снижения высокой частоты ошибок, лежащие в основе технологий TGS до сих пор, предпочтительно решат проблему с более длинными чтениями.

Технологии NGS все чаще внедряются в рутинные диагностические процедуры наряду с разнообразными биоинформатиками. Различные образцы подвергаются секвенированию в зависимости от их назначения и происхождения. Для обеспечения оптимального ответа на течение болезни пациента обязательна точная аннотация мутаций. Следовательно, предварительным условием оценки и проверки биоинформационных конвейеров, используемых для анализа.Лаборатории, проводящие NGS, должны, как минимум, участвовать в испытаниях качества в качестве документации для подтверждения практической компетентности в проведении анализа NGS. Кроме того, следует принимать во внимание соображения, касающиеся использования NGS в отношении времени лечения.

Биологическое лечение, основанное на фактических данных, может быть оптимально поддержано с помощью панельного секвенирования (TES и/или hot-spot), обеспечивающего высокую производительность, целенаправленный сбор данных и высокую чувствительность и специфичность. В отличие от WES, его можно использовать для изучения и приоритизации новых релевантных мишеней для лекарств при различных заболеваниях, используемых для экспериментального лечения пациентов.Однако, наоборот, WGS вносит вклад в большие объемы данных, тогда как 99% — это информация о некодирующих областях. Из-за большого объема данных в WGS результаты могут быть представлены с низкой глубиной секвенирования. Следовательно, есть риск не определить соответствующие практические клинические цели. Хотя WGS по-прежнему полезен для получения новых знаний из научных исследований, это может принести пользу будущему пациенту.

Вклад авторов

Л.К.В. участвовал в концептуализации и написании (первоначальный проект и подготовка рисунков, рецензирование и редактирование), Д.НПО способствовал концептуализации и написанию (обзор и редактирование) C.K.H. способствовал концептуализации и написанию (обзор и редактирование), E.V.H. способствовал концептуализации и написанию (обзор и редактирование). Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование не получило внешнего финансирования.

Заявление Институционального контрольного совета

Неприменимо.

Заявление об информированном согласии

Неприменимо.

Заявление о доступности данных

Неприменимо.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сноски

Примечание издателя: MDPI остается нейтральным в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Литература

1. Мецкер М.Л. Технологии секвенирования — следующее поколение. Нац. Преподобный Жене. 2010;11:31–46. doi: 10.1038/nrg2626. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3.Ли Х., Дурбин Р. Быстрое и точное выравнивание коротких считываний с преобразованием Берроуза-Уилера. Биоинформатика. 2009; 25:1754–1760. doi: 10.1093/биоинформатика/btp324. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Бенджамин Д., Сато Т., Цибульскис К., Гетц Г., Стюарт К., Лихтенштейн Л. Вызов соматических SNV и Indels с помощью Mutect2. bioRxiv. 2019:861054. дои: 10.1101/861054. [Перекрестная ссылка] [Академия Google]5. Ким С., Шеффлер К., Халперн А. Л., Бекрицкий М.А., Но Э., Келлберг М., Чен С., Ким Ю., Бейтер Д., Круще П. и др. Стрелка2: Быстрый и точный вызов зародышевых и соматических вариантов. Нац. Методы. 2018;15:591–594. doi: 10.1038/s41592-018-0051-x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Кумаран М., Субраманиан У., Девараджан Б. Оценка производительности конвейеров вызова вариантов с использованием секвенирования всего экзома человека и смоделированных данных. БМК Биоинформ. 2019;20:342. doi: 10.1186/s12859-019-2928-9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7. Лю С., Хань С., Ван З., Гелернтер Дж., Ян Б.Z. Вызывающие варианты для данных секвенирования следующего поколения: сравнительное исследование. ПЛОС ОДИН. 2013;8:e75619. doi: 10.1371/journal.pone.0075619. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9. Сэнгер Ф., Никлен С., Коулсон А.Р. Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи. проц. Натл. акад. науч. США. 1977; 74: 5463–5467. doi: 10.1073/pnas.74.12.5463. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]14. Пертеа М., Шумате А., Пертеа Г., Варабёу А., Брайтвизер Ф.П., Чанг Ю., Мадугунду А.К., Пандей А., Зальцберг Л.С. ШАХМАТЫ: Новый каталог генов человека, созданный на основе тысяч крупномасштабных экспериментов по секвенированию РНК, обнаруживает обширный транскрипционный шум. Геном биол. 2018;19:208. doi: 10.1186/s13059-018-1590-2. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]15. Пон Дж. Р., Марра М. А. Мутации водителя и пассажира при раке. Анну. Преподобный Патол. мех. Дис. 2015;10:25–50. doi: 10.1146/annurev-pathol-012414-040312. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. МакФарланд С.Д., Мирный Л.А., Королев К.С. Перетягивание каната между мутациями водителя и пассажира при раке и других адаптивных процессах. проц. Натл. акад. науч. США. 2014;111:15138–15143. doi: 10.1073/pnas.1404341111. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]17. Футреал П.А., Коин Л., Маршалл М., Даун Т., Хаббард Т., Вустер Р., Рахман Н., Стрэттон М.Р. Перепись генов рака человека. Нац. Преподобный Рак. 2004; 4: 177–183. doi: 10.1038/nrc1299. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Дитлайн Ф., Вегхорн Д., Тейлор-Вайнер А., Рихтерс А., Рирдон Б., Лю Д., Ландер Э.С., Ван Аллен Э.М., Сюняев С.Р. Идентификация генов-драйверов рака на основе нуклеотидного контекста. Нац. Жене. 2020; 52: 208–218. doi: 10.1038/s41588-019-0572-y. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Бейли М.Х., Токхейм К., Порта-Пардо Э., Сенгупта С., Бертран Д., Вирасинг А., Колаприко А., Вендл М.К., Ким Дж., Рирдон Б. и др. Всесторонняя характеристика генов и мутаций, вызывающих рак. Клетка. 2018;173:371–385.doi: 10.1016/j.cell.2018.02.060. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Гонсалес-Перес А., Мустонен В., Рева Б., Ричи Г.Р.С., Крейкселл П., Карчин Р., Васкес М., Финк Дж.Л., Кассан К.С., Пирсон Дж.В. и др. Вычислительные подходы к идентификации функциональных генетических вариантов в геномах рака. Нац. Методы. 2013;10:723–729. doi: 10.1038/nmeth.2562. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]21. Кумар К.Р., Коули М.Дж., Дэвис Р.Л. Секвенирование следующего поколения и новые технологии.Семин. тромб. Хемост. 2019;45:661–673. doi: 10.1055/s-0039-1688446. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Кортес А.Дж., Тудрей П., Куява К.А., Лисовска К.М. Достижения в терапии рака яичников. Рак Чемотер. Фармакол. 2018;81:17–38. doi: 10.1007/s00280-017-3501-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24. Колфилд С.Э., Дэвис К.С., Байерс К.Ф. Олапариб: новая терапия метастатического рака молочной железы у пациентов с мутацией BRCA1/2. Дж. Адв. Практика. Онкол. 2019;10:167–174.doi: 10.6004/jadpro.2019.10.2.6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]25. ДеМаттео Р.П., Баллман К.В., Антонеску Ч.Р., Маке Р.Г., Пистерс П.В.Т., Деметри Г.Д., Блэкштейн М.Е., Бланке К.Д., Фон Мерен М., Бреннан М.Ф. и др. Адъювантный мезилат иматиниба после резекции локализованной первичной стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта: рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование. Ланцет. 2009; 373:1097–1104. doi: 10.1016/S0140-6736(09)60500-6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]26.Чепмен П.Б., Хаушильд А., Роберт К., Хаанен Дж.Б., Асьерто П., Ларкин Дж., Даммер Р., Гарбе К., Тестори А., Майо М. и др. Улучшение выживаемости при применении вемурафениба при меланоме с мутацией BRAF V600E. Н. англ. Дж. Мед. 2011; 364:2507–2516. doi: 10.1056/NEJMoa1103782. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Дину Д., Добре М., Панайтеску Э., Бирла Р., Иосиф К., Хоара П., Карагуи А., Боэриу М., Константиною С., Арделяну К. Прогностическое значение мутаций гена KRAS при колоректальном раке — предварительные данные изучать.Дж. Мед. Жизнь. 2014;7:581–587. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]28. Маус М.К.Х., Гриммингер П.П., Мак П.К., Астроу С.Х., Стивенс С., Зегер Г., Сян Дж., Брабендер Дж., Фридрих М., Алакус Х. и др. Мутации KRAS при немелкоклеточном раке легкого и колоректальном раке: значение для терапии, нацеленной на EGFR. Рак легких. 2014; 83: 163–167. doi: 10.1016/j.lungcan.2013.11.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Форбс С.А., Беар Д., Бутселакис Х., Бамфорд С., Биндал Н., Тейт Дж., Коул К.Г., Уорд С., Доусон Э., Понтинг Л. и др. COSMIC: Генетика соматического рака в высоком разрешении. Нуклеиновые Кислоты Res. 2017; 45:777–783. doi: 10.1093/nar/gkw1121. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]30. Тейт Дж.Г., Бамфорд С., Джубб Х.К., Сондка З., Беар Д.М., Биндал Н., Бутселакис Х., Коул К.Г., Креатор К., Доусон Э. и др. КОСМИЧЕСКИЙ: Каталог соматических мутаций при раке. Нуклеиновые Кислоты Res. 2019; 47: 941–947. doi: 10.1093/nar/gky1015. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31.Ландрам М.Дж., Ли Дж.М., Райли Г.Р., Джанг В., Рубинштейн В.С., Черч Д.М., Маглотт Д.Р. ClinVar: общедоступный архив взаимосвязей между вариациями последовательности и фенотипом человека. Нуклеиновые Кислоты Res. 2014;42:980–985. doi: 10.1093/nar/gkt1113. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]32. Ландрам М.Дж., Ли Дж.М., Бенсон М., Браун Г.Р., Чао К., Читипиралла С., Гу Б., Харт Дж., Хоффман Д., Джанг В. и др. ClinVar: Улучшение доступа к различным интерпретациям и подтверждающим доказательствам. Нуклеиновые Кислоты Res.2018;46:1062–1067. doi: 10.1093/nar/gkx1153. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33. Чакраварти Д., Гао Дж., Филлипс С., Кундра Р., Чжан Х., Ван Дж., Рудольф Дж. Э., Ягер Р., Соумераи Т., Ниссан М. Х. и др. OncoKB: База знаний по прецизионной онкологии. JCO Precis. Онкол. 2017; 1:1–16. doi: 10.1200/PO.17.00011. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]34. Бевик-Копли Ф., Арджун Кумар Э., Палладино Г., Корфи К., Ван Дж. Применение и анализ целевого секвенирования генома в исследованиях рака.вычисл. Структура Биотехнолог. Дж. 2019; 17:1348–1359. doi: 10.1016/j.csbj.2019.10.004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]35. Гриффит М., Миллер К.А., Гриффит О.Л., Крысяк К., Скидмор З.Л., Раму А., Уокер Дж. Р., Данг Х.Х., Трани Л., Ларсон Д.Е. и др. Оптимизация секвенирования и анализа генома рака. Сотовая система 2015;1:210–223. doi: 10.1016/j.cels.2015.08.015. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]36. Уильямс К., Понтен Ф., Моберг К., Седерквист П., Улен М., Pontén J., Sitbon G., Lundeberg J. Высокая частота изменений последовательности связана с фиксацией архивных образцов формалином. Являюсь. Дж. Патол. 1999; 155:1467–1471. doi: 10.1016/S0002-9440(10)65461-2. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]37. Ким С., Пак С., Джи Ю., Ким Д.Г., Бэ Х., Вранкен М., Ким Д., Ким К. Эффекты дезаминирования в фиксированных формалином и залитых парафином образцах тканей в эпоху прецизионной медицины. Дж. Мол. Диагн. 2017;19:137–146. doi: 10.1016/j.jmoldx.2016.09.006.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Gao XH, Li J., Gong HF, Yu GY, Liu P., Hao LQ, Liu LJ, Bai CG, Zhang W. Сравнение свежезамороженной ткани с фиксированной формалином тканью, залитой парафином, для анализа мутаций с использованием мультигена Группа пациентов с колоректальным раком. Передний. Онкол. 2020; 10:1–8. doi: 10.3389/fonc.2020.00310. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]39. Керик М., Исау М., Тиммерманн Б., Зюльтманн Х., Хервиг Р., Кробитш С., Шефер Г., Вердорфер И., Bartsch G., Klocker H., et al. Направленное высокопроизводительное секвенирование при клиническом раке. Параметры: опухолевые ткани, залитые формальдегидом в фиксированный парафин (FFPE), количество вводимых данных и гетерогенность опухоли. БМС Мед. Геном. 2011; 4:1–13. дои: 10.1186/1755-8794-4-68. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40. Баст Р.К., Фини М., Лазарус Х., Надлер Л.М., Колвин Р.Б., Кнапп Р.К. Реактивность моноклонального антитела с карциномой яичников человека. Дж. Клин. расследование 1981; 68: 1331–1337. doi: 10.1172/JCI110380.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]41. Локтионов А. Биомаркеры для неинвазивного выявления колоректального рака: ДНК, РНК или белки. Мир J. Гастроинтест. Онкол. 2020;12:124–128. doi: 10. 4251/wjgo.v12.i2.124. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42. Мамдани Х., Ахмед С., Армстронг С., Мок Т., Джалал С.И. Опухолевые биомаркеры на основе крови при раке легких для обнаружения и лечения. Перевод Рак легких Res. 2017; 6: 648–660. doi: 10.21037/tlcr.2017.09.03. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43.Олооми М., Моаззези Н., Бузари С. Сравнение экспрессии биомаркеров крови и тканей у пациентов с раком молочной железы. Гелион. 2020;6:1–7. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e03728. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Дагого-Джек И., Шоу А.Т. Гетерогенность опухоли и резистентность к терапии рака. Нац. Преподобный Клин. Онкол. 2018;15:81–94. doi: 10.1038/nrclinonc.2017.166. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Келлер Л., Беллум Ю., Викман Х., Пантел К. Клиническая значимость анализа цДНК крови: обнаружение мутаций и не только.бр. Дж. Рак. 2020; 6:1–14. doi: 10.1038/s41416-020-01047-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Мульер Ф., Чандрананда Д., Пискорц А.М., Мур Э.К., Моррис Дж., Альборн Л.Б., Майр Р., Горанова Т., Марасс Ф., Хайдер К. и др. Расширенное обнаружение циркулирующей опухолевой ДНК с помощью анализа размера фрагмента. науч. Перевод Мед. 2018; 10:1–14. doi: 10.1126/scitranslmed.aat4921. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Игнатиадис М., Доусон С.Дж. Циркулирующие опухолевые клетки и циркулирующая опухолевая ДНК для прецизионной медицины: мечта или реальность? Анна.Онкол. 2014;25:2304–2313. doi: 10.1093/annonc/mdu480. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48. Дженнингс Л.Дж., Арсила М.Е., Корлесс К., Камел-Рейд С., Лубин И.М., Пфайфер Дж., Темпл-Смолкин Р.Л., Фелькердинг К.В., Никифорова М.Н. Руководство по валидации онкологических панелей на основе секвенирования следующего поколения: совместная согласованная рекомендация Ассоциации молекулярной патологии и Колледжа американских патологов. Дж. Мол. Диагн. 2017;19:341–365. doi: 10.1016/j.jmoldx.2017.01.011. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49. Сюй С. Обзор алгоритмов вызова соматических однонуклеотидных вариантов для данных секвенирования следующего поколения. вычисл. Структура Биотехнолог. Ж. 2018; 16:15–24. doi: 10.1016/j.csbj.2018.01.003. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Треанген Т.Дж., Зальцберг С.Л. Повторяющаяся ДНК и секвенирование следующего поколения: вычислительные проблемы и решения. Нац. Преподобный Жене. 2012; 13:36–46. doi: 10.1038/nrg3117. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Ли С.Ю., Йен Х.Ю., Чжун А.В., Гао Х. Устранение помех несоосности для клинической диагностики на основе NGS. Гум. Жене. 2020; 9:1–16. doi: 10.1007/s00439-020-02216-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]52. Pink R.C., Wicks K., Caley D.P., Punch E.K., Jacobs L., Carter D.R.F. Псевдогены: псевдофункциональные или ключевые регуляторы здоровья и болезней? РНК. 2011; 11: 792–798. doi: 10.1261/РНК.2658311. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Хань Л., Юань Ю., Чжэн С. , Ян Ю., Ли Дж., Эдгертон М.Э., Дяо Л., Сюй Ю., Verhaak R.G.W., Liang H. Pan-Cancer анализ экспрессии псевдогена выявляет биологически и клинически значимые подтипы опухолей. Нац. коммун. 2014;5:1–9. doi: 10.1038/ncomms4963. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]54. Пьюджет Н., Гад С., Перрин-Видоз Л., Синильникова О.М., Стоппа-Лионне Д., Ленуар Г.М., Мазойер С. Отчетливые перестройки BRCA1 с участием псевдогена BRCA1 предполагают существование горячей точки рекомбинации. Являюсь. Дж. Хам. Жене. 2002; 70: 858–865. дои: 10.1086/339434.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Перейра Р., Оливейра Дж., Соуза М. Биоинформатика и вычислительные инструменты для анализа секвенирования следующего поколения в клинической генетике. Дж. Клин. Мед. 2020;9:132. doi: 10.3390/jcm32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]56. Мейнерт А.М., Ансари М., ФитцПатрик Д.Р., Тейлор М.С. Чувствительность обнаружения вариантов и погрешности при секвенировании всего генома и экзома. БМК Биоинформ. 2014; 15:1–11. дои: 10.1186/1471-2105-15-247. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]57.Корниш А., Гуда К. Сравнение конвейеров вызова вариантов с использованием генома в бутылке в качестве эталона. Биомед Рез. Междунар. 2015; 456479:1–11. doi: 10.1155/2015/456479. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]58. Guo Y., Dai Y., Yu H., Zhao S., Samuels D.C., Shyr Y. Усовершенствования и влияние человеческого эталона GRCh48 на высокопроизводительный анализ данных секвенирования. Геномика. 2017;109:83–90. doi: 10.1016/j.ygeno.2017.01.005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]59. Пан Б., Куско Р., Сяо В., Чжэн Ю., Liu Z., Xiao C., Sakkiah S., Guo W., Gong P., Zhang C., et al. Сходства и различия между вариантами, названными эталонными геномами человека HG19 или HG38. БМК Биоинформ. 2019;20:17–29. doi: 10.1186/s12859-019-2620-0. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]60. Yu X., Guda K., Willis J., Veigl M., Wang Z., Markowitz S. , Adams MD, Sun S. Как программы выравнивания работают с данными секвенирования с разным качеством и из повторяющихся областей? Биоданные Мин. 2012; 5:1–12. дои: 10.1186/1756-0381-5-6.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]61. Chen J., Li X., Zhong H., Meng Y., Du H. Систематическое сравнение конвейеров вызова вариантов зародышевой линии через несколько секвенаторов следующего поколения. науч. Отчет 2019; 9: 1–13. doi: 10.1038/s41598-019-45835-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]62. Chen Z., Yuan Y., Chen X., Chen J., Lin S., Li X., Du H. Систематическое сравнение производительности вызова соматических вариантов при различной глубине секвенирования и частоте мутаций. науч. Респ.2020; 10:1–9. doi: 10.1038/s41598-020-60559-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]63. Хван К.Б., Ли И., Ли Х., Вон Д., Эрнандес-Феррер К., Негрон Дж.А., Конг С.В. Сравнительный анализ конвейеров полногеномного секвенирования для минимизации ложноотрицательных результатов. науч. Отчет 2019; 9: 1–10. doi: 10.1038/s41598-019-39108-2. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]64. Хван С., Ким Э., Ли И., Маркотт Э. М. Систематическое сравнение конвейеров вызова вариантов с использованием вариантов персонального экзома золотого стандарта.науч. Отчет 2015; 5: 1–8. doi: 10.1038/srep17875. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]65. Мэн Дж., Чен Ю.П.П. База данных смоделированных геномов опухолей для точного обнаружения малых соматических вариантов рака. ПЛОС ОДИН. 2018;13:e202982. doi: 10.1371/journal.pone.0202982. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]66. Супернат А., Видарссон О.В., Стин В.М., Стокови Т. Сравнение трех вызывающих вариантов для секвенирования всего генома человека. науч. Отчет 2018; 8: 1–6. дои: 10.1038/s41598-018-36177-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]67. Сюй Х., ДиКарло Дж., Сатья Р.В., Пэн К., Ван Ю. Сравнение методов вызова соматических мутаций в данных о последовательности ампликона и всего экзома. БМС Геном. 2014; 15:1–10. дои: 10.1186/1471-2164-15-244. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]68. Mielczarek M., Szyda J. Обзор алгоритмов выравнивания и вызова SNP для данных секвенирования следующего поколения. Дж. Заявл. Жене. 2016;57:71–79. doi: 10.1007/s13353-015-0292-7.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]69. Kuhnle A., Mun T., Boucher C., Gagie T., Langmead B., Manzini G. Эффективное построение полного индекса для пангеномного выравнивания чтения. Дж. Вычисл. биол. 2020;27:500–513. doi: 10.1089/cmb.2019.0309. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]70. Линднер Р., Фридель К.К. Комплексная оценка алгоритмов выравнивания в контексте RNA-Seq. ПЛОС ОДИН. 2012;7:e52403. doi: 10.1371/journal.pone.0052403. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]71.Чжан Х., Чан Ю., Фан К., Шмидт Б., Лю В. Быстрое и эффективное сопоставление коротких чтений на основе краткого хэш-индекса. БМК Биоинформ. 2018;19:1–14. doi: 10.1186/s12859-018-2094-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]72. Лю Ю., Попп Б., Шмидт Б. CUSHAW3: Чувствительное и точное краткосрочное выравнивание базового пространства и цветового пространства с гибридным заполнением. ПЛОС ОДИН. 2014;9:e86869. doi: 10.1371/journal.pone.0086869. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]73. Ву Т.Д., Нука С.Быстрое и устойчивое к SNP обнаружение сложных вариантов и сплайсинг в коротких чтениях. Биоинформатика. 2010; 26: 873–881. doi: 10.1093/биоинформатика/btq057. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]74. Раци С., Петровски Р., Сондерс С.Т., Чорный И., Кругляк С., Маргулис Э.Х., Чуанг Х., Келлберг М., Кумар С.А., Ляо А. и др. Исаак: Сверхбыстрый вторичный анализ всего генома на платформах секвенирования Illumina. Биоинформатика. 2013;29:2041–2043. doi: 10.1093/биоинформатика/btt314. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]75.Ли В.П., Стромберг М.П., ​​Уорд А., Стюарт С., Гаррисон Э.П., Март Г.Т. MOSAIK: Алгоритм на основе хэшей для точного картирования коротких прочтений секвенирования нового поколения. ПЛОС ОДИН. 2014;9:e
. doi: 10.1371/journal.pone.00
. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]76. Ли Р., Ю С., Ли Ю., Лам Т., Ю С., Кристиансен К., Ван Дж. SOAP2: улучшенный сверхбыстрый инструмент для выравнивания коротких чтений. Биоинформатика. 2009; 25:1966–1967. doi: 10.1093/биоинформатика/btp336. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]77.Чаллис Д., Ю Дж., Эвани У.С., Джексон А.Р., Пайтанкар С., Коарфа С., Милосавлевич А., Гиббс Р.А., Ю Ф. Набор для комплексного анализа вариантов данных секвенирования следующего поколения всего экзома. БМК Биоинформ. 2012; 8:1–12. дои: 10.1186/1471-2105-13-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]78. Ли Дж., Лупат Р., Амарасингхе К.С., Томпсон Э.Р., Дойл М.А., Райланд Г.Л., Тотхилл Р.В., Халгамуг С.К., Кэмпбелл И.Г., Горриндж К.Л. ПРОТИВ: анализ числа копий для целевого изменения последовательности. Биоинформатика.2012; 28:1307–1313. doi: 10.1093/биоинформатика/bts146. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]79. Абызов А., Урбан А.Е., Снайдер М., Герштейн М. CNVnator: Подход к обнаружению, генотипированию и характеристике типичных и атипичных CNV с помощью секвенирования семейного и популяционного генома. Геном Res. 2011;21:974–984. doi: 10.1101/gr.114876.110. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]80. Амарасингхе К.С., Ли Дж., Халгамуге С.К. Исправление к CoNVEX: оценка вариации числа копий в данных секвенирования экзома с использованием HMM.БМК Биоинформ. 2013; 14:1–9. doi: 10.1186/1471-2105-14-S2-S26. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]81. Поплин Р., Чанг П., Александр Д., Шварц С., Колтерст Т., Ку А., Ньюбургер Д., Диджамко Дж., Нгуен Н., Афшар П.Т. и др. Универсальный вызывающий модуль snp и small-indel, использующий глубокие нейронные сети. Нац. Биотехнолог. 2018; 36: 983–987. doi: 10.1038/nbt.4235. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]82. Рауш Т., Цихнер Т., Шлаттль А., Штютц А.М., Бенеш В., Корбель Й.О. DELLY: обнаружение структурных вариантов с помощью интегрированного анализа парных концов и раздельного чтения. Биоинформатика. 2012; 28: 333–339. doi: 10.1093/биоинформатика/bts378. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]83. Сатирапонгсасути Дж.Ф., Ли Х., Хорст Б.А.Дж., Бруннер Г., Кокран А.Дж., Биндер С., Квакенбуш Дж., Нельсон С.Ф. Изменение количества копий на основе секвенирования экзома и обнаружение потери гетерозиготности: ExomeCNV. Биоинформатика. 2011;27:2648–2654. doi: 10.1093/биоинформатика/btr462. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]84. Гаррисон Э., Март Г. Обнаружение вариантов на основе гаплотипов при секвенировании с коротким считыванием.архив 20121207.3907 [Google Scholar]85. Маккенна А., Ханна М., Бэнкс Э., Сиваченко А., Цибульскис К., Керницкий А., Гаримелла К., Альтшулер Д., Габриэль С., Дали М. и др. Набор инструментов для анализа генома: платформа MapReduce для анализа данных секвенирования ДНК нового поколения. Геном Res. 2009;20:1297–1303. doi: 10.1101/gr.107524.110. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]86. Рен С., Бертельс К., Аль Арс З. Эффективное ускорение алгоритма пересылки пар-HMM для GATK HaplotypeCaller на графических процессорах.Эвол. Биоинформ. 2018; 14:1–12. doi: 10.1177/1176934318760543. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]87. Слой Р. М., Чианг С., Куинлан А. Р., Холл И. М. LUMPY: вероятностная структура для обнаружения структурных вариантов. Геном биол. 2014; 15:1–19. doi: 10.1186/gb-2014-15-6-r84. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]88. Нейкамп Дж. Ф., Ван Ден Брук М. А., Гертман Дж. М. А., Рейндерс М. Дж. Т., Даран Дж. М. Г., Де Риддер Д. Обнаружение изменения числа копий de novo путем совместной сборки.Биоинформатика. 2012;28:3195–3202. doi: 10.1093/биоинформатика/bts601. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]89. Цибульскис К., Лоуренс М.С., Картер С.Л., Сиваченко А., Джаффе Д., Сугнез С., Габриэль С., Мейерсон М., Ландер Э.С., Гетц Г. Чувствительное обнаружение соматических точечных мутаций в неочищенных и гетерогенных образцах рака. Нац. Биотехнолог. 2013;31:213–219. doi: 10.1038/nbt.2514. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]90. Ye K., Schulz M.H., Long Q., Apweiler R., Ning Z. Pindel: Подход к росту паттерна для обнаружения точек разрыва больших делеций и вставок среднего размера из коротких ридов с парными концами.Биоинформатика. 2009; 25: 2865–2871. doi: 10.1093/биоинформатика/btp394. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]91. Риммер А., Фан Х., Мэтисон И., Икбал З., Твигг С.Р.Ф., Уилки А.О.М., Маквин Г., Лунтер Г. Интеграция подходов на основе картирования, сборки и гаплотипов для вызова вариантов в приложениях для клинического секвенирования. Нац. Жене. 2014;46:912–918. doi: 10.1038/ng.3036. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]92. Ли Х., Хэндсейкер Б., Высокер А., Феннелл Т., Руан Дж., Гомер Н., Март Г., Абекасис Г., Дурбин Р. Формат Sequence Alignment/Map и SAMtools. Биоинформатика. 2009;25:2078–2079. doi: 10.1093/биоинформатика/btp352. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]93. О’Фаллон Б.Д., Вудерчак-Донахью В., Крокетт Д.К. Машина опорных векторов для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов по данным секвенирования следующего поколения. Биоинформатика. 2013;29:1361–1366. doi: 10.1093/биоинформатика/btt172. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]94.Ларсон Д.Э., Харрис К.С., Чен К., Кобольдт Д.К., Эбботт Т.Е., Дулинг Д.Дж., Лей Т.Дж., Мардис Э.Р., Уилсон Р.К., Дин Л. Somaticsniper: Идентификация соматических точечных мутаций в данных секвенирования всего генома. Биоинформатика. 2012; 28:311–317. doi: 10.1093/биоинформатика/btr665. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]95. Чан С., Лайер Р. М., Фауст Г. Г., Линдберг М. Р., Роуз Д. Б., Гаррисон Э. П., Март Г. Т., Куинлан А. Р., Холл И. М. SpeedSeq: сверхбыстрый анализ и интерпретация личного генома.Нац. Методы. 2015;12:966–968. doi: 10.1038/nmeth.3505. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]96. Сондерс К.Т., Вонг В.С.В., Свами С., Бек Дж., Мюррей Л.Дж., Читам Р.К. Стрелка: Точный вызов соматических малых вариантов из секвенированных пар опухолевых и нормальных образцов. Биоинформатика. 2012; 28:1811–1817. doi: 10.1093/биоинформатика/bts271. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]97. Вонг К., Кин Т.М., Сталкер Дж., Адамс Д.Дж. Усовершенствованный структурный вариант и обнаружение точек останова с помощью SVMerge за счет интеграции нескольких методов обнаружения и локальной сборки.Геном биол. 2010; 11:1–9. doi: 10.1186/gb-2010-11-12-r128. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]98. Gillet-Markowska A., Richard H., Fischer G., Lafontaine I. Ulysses: точное обнаружение низкочастотных структурных вариаций в больших библиотеках секвенирования размером со вставку. Биоинформатика. 2015; 31:801–808. doi: 10.1093/биоинформатика/btu730. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]99. Кобольдт Д.К., Чжан К., Ларсон Д.Э., Шен Д., Маклеллан М.Д., Лин Л., Миллер К.А., Мардис Э.Р., Дин Л., Уилсон Р.K. VarScan 2: обнаружение соматических мутаций и изменений числа копий при раке путем секвенирования экзома. Геном Res. 2012; 22: 568–576. doi: 10.1101/gr.129684. 111. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]100. Берухим Р., Мермель Ч. Х., Портер Д., Вей Г., Райчаудхури С., Донован Дж., Барретина Дж., Бем Дж. С., Добсон Дж., Урасима М. и др. Ландшафт соматического изменения числа копий при раке человека. Природа. 2010; 463: 899–905. doi: 10.1038/nature08822. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]101.Ли Ю., Робертс Н.Д., Вала Дж.А., Шапира О., Шумахер С.Е., Кумар К., Хурана Э., Васзак С., Корбель Дж.О., Хабер Дж.Е. и др. Закономерности соматической структурной изменчивости в геномах рака человека. Природа. 2020; 578: 112–121. doi: 10.1038/s41586-019-1913-9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]102. Маротта М., Чен Х., Иношита А., Стивенс Р., Бадд Г.Т., Кроу Дж.П., Лайонс Дж., Кондратова А., Таббс Р., Танака Х. Общая контрольная точка количества копий амплификации ERBB2 при раке молочной железы колокализирует со сложным блоком сегментарных дупликаций.Рак молочной железы Res. 2012; 14:1–19. doi: 10.1186/bcr3362. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]103. Демиденко З.Н., Фойо Т., Благосклонный М.В. Комплементация двух мутантов p53: последствия потери гетерозиготности при раке. ФЭБС лат. 2005; 579: 2231–2235. doi: 10.1016/j.febslet.2005.03.012. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 104. Алаеи-Махабади Б., Бхадури Дж., Карлссон Дж.В., Нильссон Дж.А., Ларссон Э. Глобальный анализ соматических структурных геномных изменений и их влияние на экспрессию генов при различных видах рака человека.проц. Натл. акад. науч. США. 2016;113:13768–13773. doi: 10.1073/pnas.1606220113. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]107. Ле Скуарнек С., Гриббл С.М. Характеристика хромосомных перестроек: последние технические достижения в области молекулярной цитогенетики. Наследственность. 2012; 108:75–85. doi: 10.1038/hdy.2011.100. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]108. Эскарамис Г., Докампо Э., Рабионет Р. Десятилетие структурных вариантов: описание, история и методы обнаружения структурных изменений. Краткий. Функц. Геном. 2015;14:305–314. doi: 10.1093/bfgp/elv014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 110. Куэйл М.А., Смит М., Коупленд П., Отто Т.Д., Харрис С.Р., Коннор Т.Р., Бертони А., Свердлоу Х.П., Гу Ю. Рассказ о трех платформах секвенирования NGS. БМС Геном. 2012; 13:1–13. дои: 10.1186/1471-2164-13-341. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]111. Чоуэлл Д., Напьер Дж., Гупта Р., Андерсон К.С., Мэйли К.С., Уилсон Сайрес М.А. Моделирование субклональной эволюции популяций раковых клеток.Рак рез. 2018; 78: 830–839. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-17-1229. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]113. Гаффни Э.Ф., Ригман П.Х., Гриззл В.Е., Уотсон П.Х. Факторы, которые стимулируют более широкое использование ткани FFPE в фундаментальных и трансляционных исследованиях рака. Биотех. гистохим. 2018;93:373–386. doi: 10.1080/10520295.2018.1446101. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 114. Роймерс Дж., Рийк П.Д., Чжао Х., Ликенс А., Смитс Д., Клири Дж., Лу П. В., Босше М.В.Д., Кэттор К., Саббе Б., и другие. Оптимизированная фильтрация снижает частоту ошибок при обнаружении геномных вариантов с помощью секвенирования с коротким считыванием. Нац. Биотехнолог. 2012; 30:61–68. doi: 10.1038/nbt.2053. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Клинические инициативы NGS: влияние с помощью секвенирования

Что такое секвенирование ДНК?

Секвенирование ДНК относится к ряду методов, которые анализируют участки генома с разрешением до одного нуклеотида. Традиционный метод Сэнгера по-прежнему популярен в клинических приложениях, но высокопроизводительные методы секвенирования следующего поколения (NGS) находятся на подъеме.NGS позволяет относительно легко выполнять секвенирование всего генома, всего экзома, транскриптома и целевого секвенирования.

Плюсы и минусы секвенирования нового поколения (NGS)

Основной причиной выбора NGS для клинической диагностики является сочетание высокой пропускной способности, скорости и разрешения. Как и микрочипы, анализы NGS могут эффективно анализировать весь геном или экзом или фокусироваться на определенном количестве целевых участков генома.

Однонуклеотидное разрешение

NGS также позволяет обнаруживать даже самые маленькие возможные мутации (SNP), не обязательно заранее зная о мутации.По мере совершенствования технологии комбинированное обнаружение SNP и более крупных аномалий становится проще, предоставляя комплексное решение для обнаружения нескольких типов мутаций.

Одна из проблем, с которой NGS сталкивается в клинике, заключается в том, что у нее еще нет долгого и проверенного опыта или знакомства с другими технологиями. Однако ситуация быстро меняется благодаря постоянным инновациям и снижению стоимости базы.

Технология

NGS также требует определенного опыта для проведения анализов и интерпретации данных, но это тоже меняется.Недавний прогресс в отношении рекомендаций Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США [i] и одобрения FDA по борьбе с раком [ii] устраняют эти барьеры и ведут к увеличению инвестиций и клиническому внедрению.

Основные клинические применения NGS

В декабре 2018 года компания Genomics England объявила, что достигла главной цели своего амбициозного «Проекта 100 000 геномов» — секвенировать 100 000 геномов [iii]. Результаты уже оказывают влияние на жизнь людей, больных раком и рядом других заболеваний.

Цели Genomics England не уникальны. Во всем мире запускаются или продолжаются масштабные инициативы и сотрудничество в области NGS — все они направлены на углубление нашего понимания геномики и улучшение жизни пациентов с помощью возможностей секвенирования ДНК.

Здесь мы выбрали некоторые инициативы по секвенированию ДНК, в рамках которых сегодняшние ученые работают вместе, чтобы изменить результаты для пациентов завтра. Кто они и чего пытаются добиться?

100 000 способов улучшить молекулярную диагностику

Одной из основных целей проекта «100 000 геномов» является предоставление диагностических инструментов для пациентов с редкими заболеваниями: теми, которые в прошлом было трудно диагностировать [iv]. Эти пациенты часто проходили через «диагностические одиссеи», поскольку врачи изо всех сил пытались раскрыть причину их состояния.

Запущенный в 2013 году проект «100 000 геномов» не только рассматривал ДНК, содержащую вредные мутации, но и создавал здоровые эталонные геномы. Например, у больных раком была секвенирована как здоровая, так и опухолевая ДНК. Для наследственных заболеваний проект использовал родительские геномы для сравнения.

Genomics England рассчитывает представить окончательные результаты Национальной службе здравоохранения Великобритании (NHS) в 2019 году.Но ранние результаты этой инициативы NGS уже выявили причинные мутации у пациентов с ранее не диагностированными состояниями, что позволяет проводить более целенаправленное лечение и часто заканчивает годы неопределенности.

Установление стандарта диагностики рака

По мере расширения клинического использования NGS и увеличения количества доступных генетических тестов возникает потребность в улучшении стандартизации и нормативного контроля.

Одна из совместных организаций, которая работает над решением этой проблемы в области секвенирования рака, — Actionable Genome Consortium [v].Его главная цель — работать над более четким определением «действующего генома рака». Он направлен на установление четких стандартов, определяющих опухоли (и их лечение) по генетическому составу.

Сотрудничество началось в 2014 году и включает в себя секвенирование гиганта Illumina и четырех крупных онкологических центров США [vi]: Института рака Дана-Фарбер, Центра исследования рака Фреда Хатчинсона, Онкологического центра доктора медицины Андерсона и Мемориального онкологического центра имени Слоана-Кеттеринга.

Дополнительным преимуществом этого сотрудничества является то, что в этих крупных онкологических центрах есть большие междисциплинарные онкологические советы.Их ноу-хау может помочь другим клиницистам, работающим в области диагностики рака, оценить клиническую значимость сложных данных NGS.

Это сотрудничество также уже оказывает влияние на то, как организации разрабатывают новые панели секвенирования [vii].

Оценка более широкого воздействия клинических NGS

Когда дело доходит до сбора данных клинического секвенирования, центральная парадигма часто звучит так: «чем больше, тем лучше». Но это стремление получить все больше и больше информации о наших геномах упускает из виду проблему, которая волнует многих людей в нашем обществе: всегда ли больше информации улучшает благополучие?

Эта проблема является одним из аспектов секвенирования, который исследует проект BabySeq.BabySeq – это рандомизированное клиническое исследование, в ходе которого ученые секвенируют геномы примерно 150 детей [i] в ​​экспериментальной группе и сравнивают их с контрольной группой, где секвенирование не проводится.

Целью этого подхода является исследование более широкого влияния секвенирования всего генома на благополучие как младенцев, так и их родителей. Наряду с данными о здоровье младенцев и уходе, который они получают, в исследовании также учитываются ответы, полученные из анкет, раздаваемых родителям о том, как доступ к генетической информации их ребенка влияет на их семейную жизнь.

Исследователи надеются использовать эту информацию, чтобы получить представление о последствиях секвенирования ДНК, которые в противном случае могли бы остаться незамеченными при чисто клиническом подходе.

Крупнейший рынок NGS в настоящее время находится в области репродуктивного здоровья, в частности, неинвазивного пренатального тестирования (NIPT)1, где он постепенно заменяет методы на основе массивов, такие как сравнительная геномная гибридизация массивов (aCGH). НИПТ представляет собой более безопасную альтернативу инвазивным тестам, поскольку он анализирует бесклеточную ДНК плода (вкДНК) из кровотока матери, что упрощает выявление генетических нарушений, таких как синдром Дауна.

Использование NGS также растет в онкологии, менделевских заболеваниях, комплексных заболеваниях и инфекционных заболеваниях. Ученые-клиницисты могут использовать анализы NGS либо для диагностики, либо для принятия решений о лечении, одновременно изучая как небольшие мутации (например, SNP и вставки), так и более крупные аномалии (например, CNV).

Уточнение диагнозов рака является особым направлением развития NGS. По мере того, как лечение становится все более персонализированным, возникает необходимость в классификации рака с точки зрения лежащих в его основе мутаций, чтобы помочь определить варианты лечения в клинике.NGS играет ключевую роль в этой тенденции к точной медицине, помогая минимизировать человеческие и финансовые затраты на неэффективное лечение рака.

Это несколько примеров инициатив NGS, в которых клинические исследования с использованием секвенирования говорят нам не только о мутациях в наших генах. Прочтите наш информационный документ для получения дополнительной информации о текущих тенденциях и применениях NGS в клинической практике.

Будущее NGS

Из четырех ключевых методов молекулярной диагностики (кПЦР, FISH, микроматрицы и NGS) NGS имеет самую высокую скорость роста.2 Вероятно, это связано с его потенциалом и способностью предоставлять исчерпывающие данные о целом ряде аномалий.

Скорость, с которой NGS будет расти на различных клинических рынках, вероятно, будет зависеть от дальнейшего снижения затрат на секвенирование, а также от развития нормативно-правовой базы. По мере того, как ученые-клиницисты все больше знакомятся с возможностями NGS, они также могут способствовать более быстрому росту за счет спроса.


[i] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6170456/

[ii] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29506529

[iii] https://www.bbc.co.uk/news/health-46456984

[iv] https://www.genomicsengland.co.uk/about-genomics-england/the-100000-genomes-project/

[v] https://www.fredhutch.org/en/news/releases/2014/09/actionable-genome-consortium-world-renowned-cancer-institutions.html

[vi] https://www.nature.com/articles/nbt1014-965d

[vii] https://emea.illumina.com/company/news-center/press-releases/press-release-details.html

[i] https://www.genomes2people.org/research/babyseq/

1. BCC Research (2017) Секвенирование следующего поколения: новые клинические приложения и глобальные рынки

2. BCC Research (2017) Секвенирование следующего поколения: новые клинические приложения и глобальные рынки

 

Статьи Industry Insights создаются и оплачиваются рекламодателями. Взгляды, выраженные в этих статьях, не обязательно отражают точку зрения AACC, и их включение в CLN не является одобрением со стороны CLN или AACC.

Секвенирование нового поколения в клинике

Секвенирование следующего поколения (NGS), примененное к геномному тестированию, предоставило клиницистам мощный инструмент для лучшей диагностики образцов пациентов. NGS предлагает преимущества высокой производительности и меньших требований к образцам по сравнению с его предшественником, секвенированием по Сэнгеру. За последние несколько лет произошло быстрое расширение возможностей геномного тестирования в медицинских центрах, использующих NGS для секвенирования всего генома (WGS), секвенирования всего экзома (WES) и целевого секвенирования. Сегодня исследователи и клиницисты могут использовать NGS для проверки нескольких сотен генов на наличие мутаций, изменений числа копий и слияний. Вот взгляд на то, как NGS используется в клинике и как компании предлагают инструменты NGS для удовлетворения как клинических, так и диагностических потребностей.

Использование NGS для принятия клинических решений

Конкретные геномные изменения, влияющие на курс лечения, или изменения, требующие принятия мер, являются наиболее важными для клиницистов. Многие клиницисты используют геномное тестирование только тогда, когда оно полезно для лечения.Хотя только несколько генетических изменений связаны с одобренным препаратом, другим вариантом являются клинические испытания. «У нас есть почти 100 клинических испытаний, которые требуют, чтобы опухоли пациента имели специфическое генетическое изменение», — говорит Фунда Мерик-Бернстам, заведующая кафедрой исследовательской терапии рака в Онкологическом центре им. М. Д. Андерсона Техасского университета.

При принятии большинства клинических решений сегодня используются панели NGS на основе экзома, которые отслеживают конкретные изменения, связанные с состоянием пациента.Некоторые панели NGS проверяют набор мутаций, например панели рака молочной железы или солидных опухолей. Небольшие генные панели, которые часто используются для тестирования определенных фенотипов или классов опухолей, обычно дают четкие результаты ограниченной сложности. «Это делает их пригодными для использования практически всеми врачами с соответствующим академическим опытом», — говорит Мэтью Фербер, клинический молекулярный генетик и ведущий директор лаборатории клинического секвенирования генома в клинике Майо. Напротив, большие генные панели и WES требуют более крупной междисциплинарной команды для управления процессом, от первоначальной встречи с пациентом до интерпретации окончательных результатов.Большинство клиницистов обычно не используют секвенирование всего генома, которое занимает больше времени, стоит дороже и создает проблемы с биоинформатикой и хранением данных, потому что оно обычно не дает никакой дополнительной полезной для пациента информации (исключения см. ниже).

Когда дело доходит до диагностики пациентов, последствия ошибок могут быть катастрофическими. Поэтому клинические лаборатории тратят много времени на подтверждение изменений на альтернативных платформах, используя либо другую систему NGS, либо общепринятый метод Сэнгера.«Тем не менее, золотым стандартом является секвенирование по Сэнгеру», — говорит Жаклин Бигель, директор Центра персонализированной медицины и руководитель отдела геномной медицины в Детской больнице Лос-Анджелеса и профессор клинической патологии в Медицинской школе Кека Университета Южной Калифорнии. . «Для полноэкзомного секвенирования в условиях клинической диагностики, когда вы пытаетесь поставить диагноз ребенку с редким заболеванием, мы подтверждаем патогенные варианты по Сэнгеру».

Ульрике Каппес, директор Лаборатории развития и нейрогенетики в Центре генетики человека и молекулярной генетики Медицинского колледжа Висконсина, также использует секвенирование по Сэнгеру для подтверждения результатов NGS. Команда Каппеса использует NGS для секвенирования всего экзома и генома для диагностики редких заболеваний, таких как нарушения развития нервной системы. «Секвенирование экзома и генома является частью клинического обследования наших пациентов, когда имеются серьезные подозрения на генетический компонент, но другие тесты не смогли поставить диагноз», — говорит Каппес.

Группа Бигеля разрабатывает использование секвенирования всего генома для образцов педиатрической онкологии для проверки хромосомных перестроек — то, что часто не удается обнаружить секвенированием экзома.«Мы бы упустили слишком много вещей, используя только секвенирование всего экзома, поэтому для соматического обнаружения перестроек в образцах рака мы просто перескочим прямо к секвенированию всего генома», — говорит Бигель. Однако сначала они используют панель, чтобы избежать сложной биоинформатики, которая потребовалась бы для выполнения полногеномного секвенирования каждого пациента.

Расширение охвата NGS

Большая часть текущих NGS-тестов основана на тканях, но растущий интерес к жидкой биопсии стимулирует инновации в этой технологии.

Преимущества включают неинвазивный отбор проб (таких как забор крови) и возможность серийного отбора проб для изучения состояния пациента в динамике. Образцы крови получить намного проще, чем биопсии труднодоступных опухолей. Для пациентов, ранее проходивших лечение в другом месте, перенос образца ткани из архива может задержать терапию, а выполнение новой биопсии является более инвазивным и дорогостоящим. «Кроме того, около 15% пациентов, которым делают биопсию, не имеют достаточного количества ткани для проведения геномного тестирования», — говорит Мерик-Бернстам.«Возможность жидкостной биопсии увеличила бы возможности геномного тестирования для пациентов».

Компания Cynvenio разработала средство для оценки сигналов опухоли из жидкой биопсии, в котором используются клетки, полученные из опухоли, и фрагменты ДНК, присутствующие в крови пациента. Платформа Cynvenio обогащает опухолевые клетки и очищает два типа ДНК из крови — циркулирующую внеклеточную ДНК (ccfDNA, ДНК, высвобождаемую из мертвых или умирающих клеток) и циркулирующую ДНК опухолевых клеток (ctcDNA, ДНК из интактных клеток, которые возникают в опухоли и попадают в кровь). кровь), которые предоставляют различные виды информации.Cynvenio также разработала трижды отрицательную панель секвенирования, специфичную для рака молочной железы, которая позволяет исследователям искать признаки этого заболевания в образцах крови путем секвенирования как ccfDNA, так и ctcDNA.

В настоящее время Cynvenio использует эти инструменты в исследовании пациентов в стадии ремиссии трижды негативного рака молочной железы, агрессивного заболевания с 30% рецидивами. Компания использует оценку NGS образцов крови с течением времени, чтобы отслеживать молекулярные доказательства рецидива рака молочной железы. Клиническое исследование направлено на установление связи с клиническим рецидивом.ЦОК можно обнаружить на ранней стадии, еще до клинических проявлений. «Эта информация может быть использована для предоставления доказательной информации, которая может помочь врачу принять решение о… наилучшем способе продвижения вперед для каждого пациента», — говорит Пол Демпси, главный научный сотрудник Cynvenio.

Инструменты NGS для будущих приложений

Исследователи и врачи продолжают расширять границы современной технологии NGS. Например, части генома человека по-прежнему сложно секвенировать с помощью NGS.«К ним относятся вариации числа копий, длинные повторяющиеся последовательности, структурные хромосомные перестройки, полиплоидия, GC-богатые области, эпигенетические эффекты или мозаицизм», — говорит Каппес. NGS также ограничен, когда речь идет об идентификации вариантов в областях генома с высокой гомологией последовательностей с другими областями, таких как паралогичные гены и псевдогены. «Для некоторых генов и, в частности, для определенных экзонов различных генов у нас все еще недостаточно охвата или глубины чтения для анализа этих областей», — говорит Каппес.

Исследователи работают совместно с компаниями над разработкой инновационных инструментов и анализов, которые используют сильные стороны NGS в клинике.

Biegel работает с Thermo Fisher Scientific над разработкой панели NGS для пациентов с детской онкологией. «Исследовательская группа Thermo Fisher’s AmpliSeq Oncomine не включала достаточного количества информации о раке у детей», — говорит Бигель. Ее группа совместно разрабатывает комплексную панель NGS, которая включает биомаркеры для всех типов опухолей у детей. Панель все еще проходит проверку и использует высокопроизводительную платформу Thermo Fisher Ion Torrent NGS и технологию AmpliSeq ; для этого требуется исходный образец размером всего нанограмм.«Это комбинированная платформа ДНК и РНК, поэтому мы можем улавливать как транслокации, так и мутации», — говорит Бигель.

Некоторые инструменты NGS, хотя и предназначены только для исследовательских целей, становятся все более ценными при разработке клинических инструментов. Promega предлагает инструменты, предназначенные только для научных исследований, для количественного определения ДНК, поступающей в библиотеку, и разрабатывает анализ контроля качества для определения уровня деградации образца. Знание качества и размера образца ДНК помогает исследователям получить максимально возможную информацию об образце. «Например, когда исследователи работают с низкокачественными и ценными образцами, они могут решить использовать меньшую панель [NGS], состоящую только из самых важных генов, чтобы получить максимально полезную информацию», — говорит Кертис Нокс, менеджер по глобальному стратегическому маркетингу для НГС на Промеге. На фоне возросшего интереса к жидкой биопсии компания Promega также недавно выпустила метод очистки циркулирующей внеклеточной ДНК, в котором используется набор Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit на приборе Maxwell® RSC.

Система QIAGEN GeneReader , предназначенная в настоящее время только для исследовательских целей, помогает клиническим исследователям сузить поиск полезной информации.«Цель [инструмента], предназначенного только для исследовательских целей, — обеспечить разработку будущих диагностических инструментов», — говорит Джонатан Арнольд, руководитель франшизы онкологического бизнеса в QIAGEN. «Мы хотим внедрить NGS в клиническую рутину». QIAact Actionable Insights Tumor Panel от QIAGEN нацелена на 12 генов и до 1250 генетических мутаций в распространенных типах рака. Недавно компания выпустила панель для использования с образцами плазмы жидкой биопсии. QIAGEN также разрабатывает дополнительные панели QIAact для лечения рака легких, молочной железы и яичников.

Несмотря на то, что затраты на секвенирование продолжают снижаться, стоимость по-прежнему является ограничением, влияющим на более широкое внедрение NGS в клинических ситуациях.

Более сложным препятствием является необходимость сложных систем и междисциплинарных групп экспертов для интерпретации результатов NGS в клинических условиях.

«[Тестирование NGS] не получит большого успеха, пока кто-то не изобретет еще более дешевый и быстрый секвенатор, которым, что более важно, могут управлять один или два человека от подготовки образца до интерпретации вариантов и создания отчетов», говорит Фербер.«Я надеюсь, что когда-нибудь требования к анализу данных станут намного менее громоздкими».

Программа Фербера в клинике Майо быстро расширилась, чтобы удовлетворить растущий объем запросов на тестирование NGS. «Это дорого, тяжело и отнимает много времени, но все это исчезает, когда мы работаем над делом, которое не было раскрыто более 10 лет, вынуждая семьи бесчисленные визиты к врачу и тратя неисчислимые суммы денег — и [затем] команда находит ответ», — говорит он.«Тогда ты понимаешь, что все это того стоило».

Секвенирование нового поколения в клинике: готовы ли мы?

  • Burson, C.M. & Markey, K.R. Вопросы генетического консультирования при прогностическом генетическом тестировании семейных неврологических заболеваний у взрослых. Семинары Педиатр. Нейрол. 8 , 177–186 (2001).

    КАС Статья Google ученый

  • Эванс, Дж. П. и Ротшильд, Б. Б. Возврат результатов: не так уж сложно? Жен.Мед. 14 , 358–360 (2012).

    Артикул Google ученый

  • Бизекер, Л. Г. Возможности и проблемы интеграции массового параллельного геномного секвенирования в клиническую практику: уроки проекта ClinSeq. Жен. Мед. 14 , 393–398 (2012).

    Артикул Google ученый

  • Кохане И. С., Син М.и Конг, С. В. Таксономизация, определение размеров и преодоление инциденталома. Жен. Мед. 14 , 399–404 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Институт медицины Национальной академии. Интеграция крупномасштабной геномной информации в клиническую практику: резюме семинара (National Academies Press, 2012).

  • Mennuti, M. T. Генетический скрининг в охране репродуктивного здоровья. клин. Обст. Гинекол. 51 , 3–23 (2008).

    Артикул Google ученый

  • Goldman, J. S. et al. Генетическое консультирование и тестирование на болезнь Альцгеймера: совместные практические рекомендации Американского колледжа медицинской генетики и Национального общества консультантов-генетиков. Жен. Мед. 13 , 597–605 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Берк, В.Генетическое тестирование. Новый англ. Дж. Мед. 347 , 1867–1875 (2002).

    КАС Статья Google ученый

  • Патай, Б. А. и Тополь, Э. Дж. Неудовлетворенная потребность в образовании в области геномной медицины. Ам. Дж. Мед. 125 , 5–6 (2012).

    Артикул Google ученый

  • Сифри, Р. и др. Использование тестирования на предрасположенность к раку среди врачей первичной медико-санитарной помощи. клин. Жене. 64 , 355–360 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Wideroff, L. et al. Использование врачом генетического тестирования на предрасположенность к раку: результаты национального исследования. Рак Эпидемиол. Биомаркеры Пред. 12 , 295–303 (2003).

    ПабМед Google ученый

  • Scheuner, M. et al. Готовы ли электронные медицинские карты для геномной медицины? Жен.Мед. 11 , 510–517 (2009).

    Артикул Google ученый

  • Тверски А. и Канеман Д. Суждение в условиях неопределенности: эвристика и предубеждения. Наука 185 , 1124–1131 (1974).

    КАС Статья Google ученый

  • Соловиц П. и Паукер С. Г. Категориальные и вероятностные рассуждения в медицинской диагностике. Артиф. Интеллект Мед. 11 , 115–144 (1978).

    Артикул Google ученый

  • Лин, З., Альтман, Р. Б. и Оуэн, А. Б. Конфиденциальность в исследованиях генома. Наука 313 , 441–442 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Поттер, Н. Т., Спектор, Э. Б. и Прайор, Т. В. Технические стандарты и рекомендации по тестированию на болезнь Хантингтона. Жен. Мед. 6 , 61–65 (2004).

    Артикул Google ученый

  • Johnston, J.J. et al. Вторичные варианты у лиц, подвергающихся секвенированию экзома: скрининг 572 человек выявил мутации с высокой пенетрантностью в генах предрасположенности к раку. Ам. Дж. Хам. Жене. 91 , 97–108 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Райли Б.Д. и др. Основные элементы оценки риска генетического рака, консультирования и тестирования: обновленные рекомендации Национального общества консультантов-генетиков. Ж. Жене. Счетчики 21 , 151–161 (2012).

    Артикул Google ученый

  • Plon, S.E. et al. Генетическое тестирование и рекомендации врачей по управлению риском рака для родственников из группы риска. Жен. Мед. 13 , 148–154 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Голдгар, Д. Э., Истон, Д. Ф., Кэннон-Олбрайт, Л. А. и Сколник, М. Х. Систематическая популяционная оценка риска рака у родственников первой степени родства больных раком. J. Natl Cancer Inst. 86 , 1600–1608 (1994).

    КАС Статья Google ученый

  • Bisecker, L.G. et al. Проект ClinSeq: пилотирование крупномасштабного секвенирования генома для исследований в области геномной медицины. Рез. генома. 19 , 1665–1674 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Лессер, К.С., Люси, К.Р., Эгенер, Б., Брэддок, С.Х., Линас, С.Л. и Левинсон, В. Поведенческий и системный взгляд на профессионализм. JAMA 304 , 2732–2737 (2010).

    КАС Статья Google ученый

  • Кохане, И.С., Масис, Д. Р. и Альтман, Р. Б. Инциденталом: угроза геномной медицине. JAMA 296 , 212–215 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Roberts, N.J. et al. Прогностическая способность персонального секвенирования генома. Науч. Перевод Мед. 4 , 133ra58 (2012).

    Артикул Google ученый

  • Гал, В.А. и др. Программа национальных институтов здравоохранения по недиагностированным заболеваниям: взгляд на редкие заболевания. Жен. Мед. 14 , 51–59 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Максмен, А. Экзомное секвенирование для расшифровки редких заболеваний. Cell 144 , 635–637 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • Майер, А.Н. и др. Своевременное появление геномной медицины. Жен. Мед. 13 , 195–196 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Берг, Дж. С. и др. Информатический подход к анализу инциденталома. Жен. Мед. , 27 июля 2012 г. (doi:10.1038/gim.2012.112).

  • Hicks, J.K. et al. Управляемая врачом автоматизированная система для интеграции фармакогенетической интерпретации в электронную медицинскую карту. клин. Фармакол. тер. , 19 сентября 2012 г. (doi: 10.1038/clpt.2012.140).

  • Оверби, С. Л., Тарчи-Хорнох, П., Хоат, Дж. И., Калет, И. Дж. и Винстра, Д. Л. Возможность включения геномных знаний в электронные медицинские записи для поддержки фармакогеномных клинических решений. BMC Bioinformatics 11 (Приложение 9), S10 (2010).

    Артикул Google ученый

  • Гуттмахер, А.Э., Дженкинс, Дж. и Ульманн, В. Р. Геномная медицина: кто будет ее практиковать? Призыв к распростертым объятиям. Ам. Дж. Мед. Жене. 106 , 216–222 (2001).

    КАС Статья Google ученый

  • Millot, G. A. et al. Руководство по функциональному анализу вариантов BRCA1 неопределенной значимости. Гул. Мутат. , 16 июля 2012 г. (doi: 10.1002/humu.22150).

  • Райт, К. и др. Следующие шаги в последовательности: последствия секвенирования всего генома для здоровья в Великобритании Ch. 12 153–160 (Фонд PHG, 2011).

    Google ученый

  • Райт, К. и др. Следующие шаги в последовательности: последствия секвенирования всего генома для здоровья в Великобритании Ch. 4 33–44 (Фонд PHG, 2011).

    Google ученый

  • Фарли, Т.A. Реформа здравоохранения или реформа здравоохранения? Ам. Дж. Общественное здравоохранение. 99 , 588–590 (2009).

    Артикул Google ученый

  • Комитет по разработке новой таксономии болезней; Национальный научно-исследовательский совет. На пути к точной медицине: создание сети знаний для биомедицинских исследований и новой таксономии болезней (National Academies Press, 2011).

  • Ци, Q.и другие. Сахаросодержащие напитки и генетический риск ожирения. Н. англ. Дж. Мед. , 21 сентября 2012 г. (doi: 10.1056/NEJMoa1203039).

  • От скамейки к постели: преодоление барьеров для клинического тестирования на основе NGS

    Джейсон Майерс, доктор философии

    Джейсон Майерс, доктор философии, является генеральным директором Genapsys и имеет более чем 20-летний опыт работы в отрасли геномики. До прихода в Genapsys он был соучредителем и генеральным директором ArcherDX, продолжая свой послужной список успешной разработки технологий и создания корпоративной ценности.До этого Джейсон руководил разработкой платформы и приложений для секвенирования для Ion Torrent™, где его руководство способствовало приобретению компании Life Technologies.


    Секвенирование следующего поколения (NGS) произвело революцию во многих областях, обеспечив высокопроизводительное массовое параллельное секвенирование по всему миру. Это особенно верно в области биомедицины, где исследователи вкладывают значительные средства в создание баз данных, которые могут предоставить геномную информацию на уровне населения, которая может изменить здравоохранение.

    Несмотря на эти достижения, NGS по-прежнему плохо подходит для многих диагностических приложений в местах оказания медицинской помощи (POC). По разным причинам он хорошо работает в специализированной лаборатории, но не может быть использован непосредственно в условиях ухода за пациентами.

    Барьеры для доступа

    Как и многие сложные лабораторные инструменты, оборудование, необходимое для NGS, как правило, жесткое, сложное и непомерно дорогое, часто требующее значительных первоначальных капиталовложений. Кроме того, стоимость каждого «прогона» NGS значительна, что заставляет многие лаборатории объединять несколько образцов пациентов для более эффективного секвенирования, но в результате увеличивается время выполнения и потенциальные задержки с решениями о лечении.Хотя это возможная покупка для хорошо финансируемых лабораторий, почти для всех остальных NGS просто недоступен.

    Принимая во внимание сложность всей экосистемы NGS, текущая парадигма ограничивает широкий доступ к тестированию по запросу в режиме реального времени, сводя на нет NGS как подходящий подход для тестирования по месту оказания медицинской помощи (POCT) и возможность предоставлять пациенты с пониманием здоровья на основе геномных данных. Благодаря более простому и экономичному оборудованию NGS клиники могли бы самостоятельно проводить секвенирование и обрабатывать большее количество образцов пациентов, тем самым расширяя доступ к тестированию NGS.

    Еще одним препятствием является интерпретация результатов NGS. Лаборатории нередко нуждаются в привлечении внешних экспертов для интерпретации геномных данных, которые позволяют получить полезную клиническую информацию. Это может увеличить время выполнения работ и ограничить доступ к NGS даже для хорошо оборудованных площадок.

    Широкое клиническое внедрение тестирования на основе NGS потребует экосистемного подхода, большей автоматизации и методов диагностического уровня. Использование быстрых клинических решений, основанных на бинарных результатах «присутствует/отсутствует», может изменить здравоохранение, поддерживая простую интерпретацию в центрах POCT штатными лаборантами.

    Следующее поколение

    Хотя внедрение NGS имеет неоценимое значение для скрининга наследственных заболеваний и обнаружения мутаций онкологических опухолей, его еще предстоит развить таким образом, чтобы он поддерживал рутинную POCT. Компании вкладывают средства в разработку инструментов, которые выходят за рамки «типичной» идеи секвенсора, превращаясь из жесткого, сложного и дорогого устройства в более простое — или даже портативное — и экономически целесообразное. Те, кто является пионером в использовании полупроводниковых микросхем, могут разрабатывать устройства меньшего размера, идеально подходящие для использования в условиях POC, обеспечивая при этом возможность экономичного анализа отдельных образцов и получения быстрых результатов.

    Расширенный доступ к геномному тестированию на основе NGS служит для всей области биомедицины и расширит возможности исследователей и клиницистов, снабжая их более глубокими знаниями о здоровье, чтобы лучше направлять уход за пациентами. Приложения будут продолжать развиваться, включая фармакогеномику, неинвазивное пренатальное тестирование, онкологическое тестирование жидкой биопсии и вирусный надзор за текущими и возникающими пандемиями. Когда тестирование на основе NGS полностью переместится со стационарного на прикроватное, станет возможным бесчисленное множество приложений, что приведет к революционному и столь необходимому изменению парадигмы в здравоохранении.

    Упрощение секвенирования нового поколения в клинике

    Секвенирование следующего поколения (NGS) может сыграть ключевую роль в подходах точной медицины, позволяя клиницистам выбирать методы лечения, которые с наибольшей вероятностью принесут пользу пациентам, на основе их геномных профилей. Однако из-за таких барьеров, как стоимость и сложность, большинству местных больниц еще предстоит внедрить тестирование на основе NGS, и вместо этого они продолжают полагаться на тесты с одним геном, которые дают гораздо более ограниченную информацию для клиницистов. В результате многие лаборатории прибегают к аутсорсингу тестирования, что может иметь свои недостатки.Упрощение геномного тестирования, чтобы оно было легко доступно во всех больницах, могло бы изменить правила игры для больных раком, предоставив им быстрый доступ к наилучшему подходу к лечению.

    Недавно мы поговорили с Лукой Квальятой, доктором медицинских наук, руководителем глобального отдела по медицинским вопросам клинических NGS и онкологии в Thermo Fisher Scientific, чтобы обсудить некоторые барьеры, препятствующие полному внедрению геномного тестирования на основе NGS в больницах, и узнать больше. о решении, которое может помочь решить эти проблемы.

    Анна Макдональд (AM): Что мешает местным больницам внедрить геномное тестирование на основе NGS?

    Luca Quagliata (LQ):
    Препятствия для полного внедрения NGS как части интегрированного рутинного молекулярного диагностического рабочего процесса одинаковы как для местных, так и для крупных эталонных больниц.Основное отличие заключается в том, что местным больницам часто не хватает ресурсов для преодоления этих предполагаемых проблем. Основываясь на знакомстве со старыми версиями технологии NGS, некоторые провайдеры по-прежнему считают NGS сложным, трудным для реализации и проверки методом, который требует параллельного анализа множества образцов, чтобы быть экономически эффективным. NGS также имеет репутацию компании, требующей значительных инвестиций как в оборудование, так и в высококвалифицированный персонал для обработки проб и анализа данных. Мы разработали новую систему Ion Torrent Genexus, чтобы упростить NGS и решить эти проблемы в будущем.

    AM: В отсутствие NGS, на какие технологии полагаются эти больницы? Каковы ограничения этих методов и как это влияет на пациентов?

    LQ:
    Обычно патологоанатомическое отделение местной больницы будет полагаться на классический гистоморфологический диагноз, сопровождаемый некоторыми возможностями IHC и, реже, FISH. Однако, хотя эта морфология по-прежнему является основой для первоначального диагноза, одобрение противораковых препаратов, не зависящих от тканей, подчеркивает необходимость более точного профилирования опухоли по биомаркерам.IHC может частично служить этой цели, но часто необходимо подтвердить положительный результат с помощью ортогонального метода, такого как NGS, из-за неточности IHC. Один из примеров неточности IHC можно увидеть в его неспособности обнаруживать слияния NTRK. То же самое относится и к FISH, методу, который постепенно теряет свою популярность для обнаружения некоторых важных слияний генов, таких как RET или NTRK, где, как было показано, он страдает от значительной доли ложноположительных и отрицательных результатов. Это может привести либо к ненужному воздействию препарата на пациента, либо к предотвращению принятия соответствующих терапевтических решений, соответственно.Кроме того, интерпретация как ICH, так и FISH оказалась субъективной и сильно зависит от опыта патологоанатома. В целом, использование этих традиционных, менее полных методов может привести к снижению диагностической точности, что напрямую ухудшит последующее клиническое ведение пациентов.

    AM: Почему аутсорсинг тестирования NGS невыгоден?

    LQ: Аутсорсинг NGS связан с рядом проблем. Самый очевидный из них — чисто логистический, поскольку референс-лаборатория-получатель может находиться за много миль от пункта сбора, а отправка ценных образцов может увеличить затраты и продлить время до получения результатов.Это может вызвать стресс как у лечащего врача, так и у пациента. Более быстрое время обработки имеет решающее значение для принятия эффективных решений по лечению рака, особенно для пациентов на поздних стадиях, у которых нет свободного времени. Генерация данных в домашних условиях не только быстрее, но и, что не менее важно, также помогает наладить продуктивный обмен между командой по лечению рака, способствуя взаимодействию на месте для более обоснованного принятия клинических решений. Например, клиническое значение наблюдаемых вариантов часто неясно.Чтобы точно оценить варианты, лечащий врач мог бы существенно выиграть от местной поддержки эксперта NGS, который знаком с историей болезни пациента, а не звонить или обмениваться электронными письмами с кем-то, кто находится далеко и не имеет предварительной информации о случае. Внутреннее тестирование создает культуру и ноу-хау в области молекулярного профилирования, которые будут иметь решающее значение для внедрения точной медицины.

    AM: Можете ли вы рассказать нам о системе Ion Torrent Genexus и о том, как она может помочь клиницистам получить доступ к геномной информации?

    LQ:
    В двух словах, система Ion Torrent Genexus оснащена автоматизированным рабочим процессом «от образца до отчета», который позволяет получить результаты за один день.Эта система обладает потенциалом в будущем, чтобы действительно продвинуть парадигму точной медицины в клинику. Его беспрецедентное время выполнения работ, всего 14 часов, позволит лабораториям получать результаты за гораздо меньшее время; в настоящее время онкологам может потребоваться до четырех недель, чтобы получить результаты теста NGS на аутсорсинг. Сокращение времени получения результатов означает, что клиницисты потенциально могут быстрее начинать таргетную терапию пациентам, вместо того, чтобы по умолчанию использовать менее эффективные схемы химиотерапии или облучения, которые могут иметь серьезные побочные эффекты.

    Система Genexus также поставляется с полностью автоматизированным рабочим процессом, не требующим специальных знаний для запуска и минимальным вмешательством оператора. По сути, машина делает все, включая предоставление полностью аннотированного отчета для окончательной интерпретации. Система также поддерживает интерпретацию геномных вариантов путем агрегирования данных из различных курируемых баз данных и предоставления прямых ссылок на руководства по лечению, одобренные FDA препараты и ссылки на текущие клинические испытания. Это облегчает клиницисту использование сгенерированной молекулярной информации.Наконец, система обрабатывает все основные типы образцов с минимальным вводом образца, всего 10 нг ДНК.

    AM: Помимо онкологии, какие еще клинические применения может принести эта технология?

    LQ:
    Первым тестом Thermo Fisher, представленным для системы Genexus, является прецизионный анализ Oncomine, первая в своем роде панраковая панель, которая позволяет проводить всестороннее геномное профилирование с помощью фиксированных в формалине и залитых в парафин ( FFPE) ткани и жидкие образцы биопсии.Мы планируем разработать тесты для других приложений, о которых мы объявим в будущем.

    Лука Квальята разговаривал с Анной Макдональд, научным писателем из Technology Networks.

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.