Староверов дмитрий николаевич анестезиолог: Староверов Дмитрий Николаевич | Специалист израильской клиники Хадасса в Москве
Староверов Дмитрий Николаевич — отзывы о враче, запись на прием в Москве
Староверов Дмитрий Николаевич — отзывы о враче, запись на прием в Москве — Zoon.ru- Информация
- Заведующий отделением анестезиологии-реанимации Юсуповской больницы.
Занимается послеоперационным ведением пациентов различной степени тяжести, владеет методикой различных видов анестезиологических пособий при больших и малых оперативных вмешательствах.
Долгое время был почетным лектором в Школе медицины Университета Замбии, Лусака, Замбия.
С 2008 – по январь 2013 работа анестезиологом в отделении анестезии Университетского госпиталя, в Лусаке, Замбия
- Образование
Ташкентский медицинский институт (лечебное дело) (2004 г.).
Ташкентский медицинский институт (анестезиология и реаниматология) (2006 г.).Курсы повышения квалификации
Международная Конференция по Анестезиологии и Интенсивной Терапии, Лусака, Замбия (2010 г.).
Preparation for Primary Departure, Médecins Sans Frontières (MSF-OCB), Brussels, Belgium (2012 г.).
Medical Days Course, Médecins Sans Frontières (MSF-OCB), Brussels, Belgium (2012 г.).
Международная Конференция по Анестезиологии и Интенсивной Терапии, Лусака, Замбия (2012 г.).
Ташкентский медицинский институт (анестезиология и реаниматология) (2014 г.).
XV Съезд Федерации Анестезиологов и Реаниматологов, Москва, РФ (2016 г.).
- Опыт и достижения
Общая практика
Лектор. Школа Медицины, Университет Замбии, Лусака, Замбия (2012-2014 гг.).
Младший научный сотрудник. Республиканский Специализированный Научный Центр Хирургии им.акад.В.В.Вахидова, Ташкент, Узбекистан (2006-2007 гг.).
Врач анестезиолог-реаниматолог. Универститетский Госпиталь, Лусака, Замбия (2007-2014 гг.).
Врач анестезиолог-реаниматолог. Первый Правительственный стационар, Ташкент, Узбекистан (2014-2015 гг.).
Врач анестезиолог-реаниматолог. ГКБ 7, Екатеринбург, РФ (2015-2016 гг.).
Врач анестезиолог-реаниматолог. ГКБ 31, Москва, РФ (2016-2017 гг.).
Врач анестезиолог-реаниматолог. АО ”К+31” (2018 г.).
Зам главврача по лечебной части (Chief Medical Officer). International SOS, Актау, Казахстан (2019-2019 гг.).
- Профессиональный стаж
- 17 лет
Мы перезвоним вам в течение 5 минут
Часто задаваемые вопросы о враче Староверове Дмитрии Николаевиче
Средняя оценка — 4.2 на основании 14 оценок
Профессиональный подбор врача
Мы перезвоним вам в течение 15 минут
Загружаем нейронную сеть Анализируем ваши предпочтения Предлагаем лучшего специалиста
Староверов Дмитрий Николаевич — прием ₽ Анестезиолог, Реаниматолог отзывы, адрес где принимает в Москве
Анестезиолог, Реаниматолог
Cтаж 15 лет
Стоимость приема р.
На данный момент запись к данному врачу закрыта. Вы можете выбрать из доступных врачей или записаться к другому врачу по телефону
Староверов Дмитрий Николаевич, найдено отзывов: 0 , опыт работы: 15 лет
Сфера деятельности:- консультация пациента о подготовке к анестезии;
- сбор анамнеза и подбор метода обезболивания;
- выполнение анестезии и обеспечение безопасности во время проведения операции или диагностики;
- контроль выхода пациента из наркоза.
Староверов Дмитрий Николаевич Анестезиолог, Реаниматолог
Образование
- Диплом по специальности «Лечебное дело», Первый Ташкентский государственный медицинский институт (2004 г.)
Курсы повышения квалификации
Опыт работы
Заведующий отделением анестезиологии-реанимации с палатами реанимации и интенсивной терапии — врач-анестезиолог-реаниматолог, Юсуповская больница, город МоскваВрач Староверов Дмитрий Николаевич записаться на приём
Наша команда каждую минуту проверяет график работы для приёма у врача Староверов Дмитрий Николаевич, а также стоимость приёма в различных клиниках, где принимает Староверов Дмитрий Николаевич. Если вам не подходит график, место или условия приема, которые предлагает Староверов Дмитрий Николаевич и вы хотите найти другого специалиста по направлению Анестезиолог, Реаниматолог, сервис ГлавВрач поможет найти нужного доктора. Для этого просим вас перейти к форме поиска и ввести требуемые критерии. Наш поиск работает молниеносно!ГКБ №31 — Староверов Д.Н.
— Ирина Капилина
Хочу выразить огромную искреннюю благодарность всему персоналу 2 Гинекологического отделения 31 больницы. В августе 2017 мне делали лапароскопию. Наслушавшись от мамы ужасов о быте и нравах современных отечественных лечебных учреждений (маме, в силу состояния здоровья, довольно часто приходится сталкиваться с нашей медициной), была очень напугана и обеспокоена, как пройдет моя операция и вообще пребывание в больнице. Каково же было мое удивление (приятное, безусловно), когда на всех этапах – от оформления до самой операции и выписки, я встречала исключительно доброжелательное, сердечное к себе отношение, начиная от медсестер, заканчивая специалистами.
Анжела Могамедхановна Алиханова – милейшая ординатор, добрая, участливая, ответит на любой вопрос, поддержит и ободрит!
Дмитрий Николаевич Староверов – анестезиолог, удивительный, опытный, знающий (у меня были некоторые нюансы с анестезией, которые этот замечательный доктор предусмотрел), очень позитивный и душевный молодой человек!
Отдельное спасибо Заведующей отделением Мишиевой Ольге Игоревне, что подбирает таких высокопрофессиональных специалистов и большой душевной щедрости людей!
Спасибо вам всем ОГРОМНОЕ и низкий Поклон!
Без ложного пафоса хочу назвать вас Врачами с Большой буквы!!!
Какое же счастье, что в настоящее время есть такие Доктора и что я к вам попала!!!
ОГРОМНОЕ, ПРЕОГРОМНОЕ СПАСИБО!
СЧАСТЬЯ ВАМ ВСЕМ, ЗДОРОВЬЯ И ВСЕХ-ВСЕХ БЛАГ!!!
— Ирина Лищенко
Направлена была 21.09.2017г. в СКП (стационар кратковременного пребывания) гинекологического отделения на 7-ом этаже с полипом шейки матки. Это первая операция и впечатления самые искренние. В палате было чисто, светло, удобные хорошие кровати, чистое белье. Сразу хочу отметить высокий профессионализм, организованность, добродушие медперсонала. Квалифицированную работу постовых медсестёр Зенковой Ольги Валерьевны, Маршевой Татьяны Васильевны!! Ни на шаг не отходили, отвечали на все волнующие вопросы, просто молодцы! Конечно огромное спасибо хирургу, прекрасно провела операцию, я быстро пошла на поправку это Петренко Екатерина Игоревна! Не боюсь теперь доверять свое здоровье молодым хирургам (как я потом узнала ей 33 года), просто умница! Анестезиолог ну просто красавчик, такой добродушный, улыбчивый, именно таких хочется видеть анестезиологов Староверов Дмитрий Николаевич, чувствовала себя прекрасно после анестезии. Всему коллективу большое спасибо!
— Колесникова Лариса Юрьевна
Оставить отзыв →
Староверов Дмитрий Николаевич (Анестезиолог) в рейтинге лучших докторов Москвы. Отзывы, фото Анестезиолог Староверов Дмитрий Николаевич
Староверов Дмитрий Николаевич
Анестезиолог принимает в следующих клиниках:Дмитрий Николаевич — Занимается послеоперационным ведением пациентов различной степени тяжести, владеет методикой различных видов анестезиологических пособий при больших и малых оперативных вмешательствах.
Образование
Опыт работы
Дмитрий Николаевич — отзывы
Регулярно обращаюсь к этому врачу
Регулярно обращаюсь к этому врачу, выслушал меня и рекомендовал сдать еще анализы. В разговоре с доктором мы выяснили все детали. Kostya
Доктор внимательный
Доктор внимательный, учел все мои жалобы. Прием меня устроил. Никита
Хороший доктор
Хороший доктор, кое-что уточнил и поставил диагноз. Посещение было своевременным. Денис
Врач хороший
Врач хороший, послушал все мои жалобы. Хочется порекомендовать доктора знакомым. Victoria
Врач был приветливым
Врач был приветливым, принял во внимание все мои жалобы. Я доверяю этому доктору. Ильдар
У доктора доброе отношение к пациентам
У доктора доброе отношение к пациентам, послушал все мои жалобы. Прием меня устроил. Oxana
Сразу видно, что доктор разбирается в предмете
Сразу видно, что доктор разбирается в предмете, сообщил что у меня частая проблема и прописал курс лечения. Буду порекомендовать доктора родным. Денис
Опытный доктор
Опытный доктор, кое-что уточнил и диагностировал обострение. Прием меня устроил. Елизавета
Чтобы написать отзыв, вам необходимо авторизоваться
Староверов Дмитрий Николаевич врач анестезиолог, реаниматолог. Запись на прием, отзывы, цены, где принимает в Москве на MedBooking.com
Первичный прием
3 000 руб
Записаться к врачу
Москва, улица Лобачевского, 42с4- Проспект Вернадского
- Юго-Западная
- Калужская
- О враче
- Отзывы
- Услуги
- Где принимает
Отзывов
о враче
0
О враче
Староверов Дмитрий Николаевич
Образование
- 1997–2004 – Первый Ташкентский Государственный Медицинский Институт
- 2004-2006 – Ординатура по специальности: Анестезиология и Реаниматология, Республиканский Специализированный Научный Центр Хирургии им.акад.В.В.Вахидова
Где принимает
Староверов Дмитрий Николаевич врач анестезиолог, реаниматолог. Запись на прием, отзывы, цены, где принимает в Москве на MedBooking.com
Первичный прием
3 000 руб
Записаться к врачу
Москва, улица Лобачевского, 42с4- Проспект Вернадского
- Юго-Западная
- Калужская
- О враче
- Отзывы
- Услуги
- Где принимает
Отзывов
о враче
0
О враче
Староверов Дмитрий Николаевич
Образование
- 1997–2004 – Первый Ташкентский Государственный Медицинский Институт
- 2004-2006 – Ординатура по специальности: Анестезиология и Реаниматология, Республиканский Специализированный Научный Центр Хирургии им.акад.В.В.Вахидова
Где принимает
Анестезиолог-реаниматолог в Москве, отзывы пациентов, записаться на приём к анестезиологу-реаниматологу Москва
Свежие отзывы жителей Москвы о анестезиологах-реаниматологах
5 замечательноАноним
Принимал врач: Королев Ю. И.
Хочу поблагодарить анестезиолога — Королева Юрия Игоревича. Моя мама оперировалась в больнице В. Вересаева, куда попала в тяжелом состоянии в июне 2016 г. с перитонитом. Доктор провел беседу с мамой, всё внятно и доступно рассказал, что предстоит провести, какие могут быть осложнения, поднял настроение маме, в течение разговора. Всё время настраивал на положительный результат, что наверное настраивает самого больного на хороший исход. Операция прошла, мама находилась в реанимации трое суток, за что тоже выражаю благодарность коллективу отделения общей реанимации. Мама проснулась только в реанимации. Осталась довольна, что ничего не видела и не почувствовала. Спасибо всей анестезиологической бригаде. (Пациент проходил лечение по адресу ул. Воронцовская, д. 8, стр. 6)
Отзыв опубликован: 5 января 2017 года
Аноним
Принимал врач: Филимонова Е. В.
Очень внимательный, добрый человек и прекрасный специалист. Второй год лечусь у неё, всё очень нравится! Результат на лице! (Оставивший отзыв был по адресу ул. Вильнюсская, д. 13)
Отзыв опубликован: 16 апреля 2015 года
5 замечательноАноним
Принимал врач: Ребик С. А.
Ответственный, опытный, высокопрофессиональный врач! Спасибо за работу! Давайте пациентам такие же хорошие сны как и мне! (Пациент проходил лечение по адресу ул. Пехотная, д. 3)
Отзыв опубликован: 23 марта 2016 года
Аноним
Принимал врач: Никитина Л. Е.
Чёткость, профессионализм, чуткое отношение к пациенту. 19 марта 2014 года произведена операция по замене тазобедренного сустава Климову В. Б. Благодарен врачу Никитиной Л. Е. за профессионализм и внимательное отношение к пациенту, не только во время операции, но и в послеоперационный период. Огромное спасибо за чуткость и внимание врача. (Бывший пациент лечился по адресу ул. Шоссейная, д. 43)
Отзыв опубликован: 9 августа 2014 года
Аноним
Принимал врач: Лазаревич А. В.
Объективной информации не узнать, говорит однообразные дежурные фразы. Когда ваш близкий человек в реанимации в тяжёлом состоянии, думаю, не сложно представить состояние родных. (Написавший отзыв посещал учреждение по адресу ул. Фортунатовская, д. 1)
Отзыв опубликован: 13 июля 2017 года
4 замечательноАноним
Принимал врач: Джога Е. Э.
Нормальный врач. Хотя в последнее время и это уже немало. Перед операцией провела со мной беседу, предупредила чем опасен наркоз и как я должен вести себя после него. Потом заходила в палату раза три, измеряла давление, осматривала. Так и нужно работать.. (Пациент лечился по адресу ул. Шкулева, д. 4)
Отзыв опубликован: 16 марта 2014 года
Аноним
Принимал врач: Маныч Д. Ю.
Спасибо Вам за то, что не дали боли затуманить разум и рождение дочери стало счастьем! (Бывший пациент посещал учреждение по адресу Коломенский проезд, д. 4)
Понравилось:Отношение врача хорошее, всегда с юмором общается, саму процедуру делает безболезненно. После процедуры спина (как говорят многие) не болит вообще и ни следа от укола. 5 дней, что находилась в ЦГБ, приходил и узнавал как дочка, как я. Большое спасибо, что при бешеной занятости находили время на добрые слова.
Не понравилось:Такого просто быть не может, всё сделано чётко, быстро и безболезненно.
Отзыв опубликован: 8 марта 2015 года
5 замечательноАноним
Принимал врач: Качур Ю. Ю.
Сложная, многочасовая операция прошла успешно благодаря слаженной, профессиональной работе каждого врача и мед работников из операционной бригады. В их число входила и Юлия Юрьевна. Она была ответственна за наркоз, и, судя по тому, что я ничего не чувствовала во время операции и довольно легко отошла, то можно говорить о безошибочном выборе препарата и о правильной его дозировке. Спасибо огромное доктору, она действительно важный участник всего процесса, о котором нередко просто забывают. Считаю, что это несправедливо.
Отзыв опубликован: 24 января 2017 года
Аноним
Принимал врач: Маныч Д. Ю.
Дмитрий Юрьевич, спасибо за роды без боли! Очень боялась за какие-либо последствия, но все было сделано качественно и профессионально! 2.11.2016 г. совершенно безболезненно на свет появился мой сыночек! Вы — настоящий мастер своего дела! (Оставивший отзыв посещал учреждение по адресу Коломенский проезд, д. 4)
Отзыв опубликован: 14 февраля 2017 года
Аноним
Принимал врач: Певзнер Д. В.
Певзнер Дмитрий Вольфович — самый лучший врач, профессионал своего дела, к тому же добрый и великодушный человек! Здоровья Вам! (Оставивший отзыв посещал учреждение по адресу ул. 3-я Черепковская, д. 15А)
Отзыв опубликован: 7 июля 2017 года
5 замечательно
Аноним
Принимал врач: Маныч Д. Ю.
Хочу выразить благодарность Дмитрию Юрьевичу! Было кесарево, никаких болевых ощущений во время операции, от анестезии отошла благополучно, спина не болела ни разу, и все благодаря ему! Внимательный и чуткий доктор, всегда ответит на все вопросы, проконсультирует в любое время, осталась очень довольна! Спасибо Вам! (Бывший пациент посещал учреждение по адресу Коломенский проезд, д. 4)
Отзыв опубликован: 28 июня 2017 года
5 замечательноАноним
Принимал врач: Стахурский М. В.
Огромное спасибо анестезиологу-реаниматологу Михаилу Владимировичу! Он был ко мне даже более внимателен, чем прооперировавший меня хирург! Очень приятно, когда встречаешь доктора с таким неравнодушным отношением к пациентам. Он отличный профессионал, с наркозом у меня не возникло никаких проблем. Жуткие «отходняки» после выхода не ловила, постепенно вернулась к реальности, восстановилась постепенно. Доктор Стахурский контролировал мое состояние и мне было спокойнее, потому что под наблюдением надежного, грамотного доктора. (Оставивший отзыв проходил лечение по адресу ул. Клары Цеткин, д. 33 корп. 28)
Отзыв опубликован: 2 февраля 2017 года
Аноним
Принимал врач: Бугровская О. И.
Уважаемая Ольга Ивановна, огромное спасибо за Ваш труд. Год назад Вы спасли жизнь моему дорогому человеку. И Вы знаете, и я знаю, что только благодаря Вам он сейчас живет на этом свете. Мы Вас вспоминаем очень часто и с большой теплотой. Дай Бог Вам здоровья и счастья. Мне бы хотелось, чтобы об этой чудесной женщине и блестящем специалисте знало как можно больше людей. К сожалению, мы с удивлением и разочарованием обнаружили, что Бугровская Ольга Ивановна больше не заведующая отделением. Это огромная потеря для нас — людей, у которых есть риск попасть (не дай Бог) в это отделение и не попасть под эти заботливые руки. Ольга Ивановна, мы Вас помним и любим. Я знаю (так как сейчас мой отец попал в это отделение), как все изменилось в худшую сторону без Вас. Спасибо Вам за Ваше большое сердце.
Отзыв опубликован: 27 марта 2017 года
Аноним
Принимал врач: Никитин В. В.
Хороший доктор. Человек по праву занимает свою должность. Внимательно и с заботой относится к детям. Хорошо бы, чтобы доктора других клиник были хотя бы на его уровне. (Бывший пациент посещал учреждение по адресу ул. Героев Панфиловцев, д. 28)
Отзыв опубликован: 19 января 2014 года
Аноним
Принимал врач: Ивкин А. И.
Я хочу сказать спасибо Александру Ивановичу за его неоценимую помощь во время моей операции. Он смог подобрать мне правильную дозировку и я совсем не заметил, как прошла многочасовая операция. Считаю его очень профессиональным и грамотным, ведь после я очнулся и чувствовал себя совершенно нормально. Как хорошо, что в нашей медицине есть такие высококвалифицированный и добросовестные специалисты как он. Всем рекомендую смело обращаться к грамотному специалисту Ивкину.
Отзыв опубликован: 10 февраля 2017 года
Аноним
Принимал врач: Маныч Д. Ю.
Рожала в ОБ №2 в 2010 году. Дмитрий Юрьевич работал в это время там. Делал мне эпидуральную анестезию. Был со мной на протяжении всех родов. Непосредственно помогал врачам и акушерам появиться на свет моему малышу. Ни капельки не пожалела, что в момент родов была его смена. Дмитрий Юрьевич очень позитивный, легкий, человек с прекрасным чувством юмора и сильными руками. Настоящий профессионал в своем деле! Проблем после эпидуралки не возникло. Спасибо! (Написавший отзыв лечился по адресу Коломенский проезд, д. 4)
Отзыв опубликован: 11 июля 2016 года
Аноним
Принимал врач: Билич А. Г.
Билич А. Г. — высококлассный профессионал своего дела. Спас жизнь моей маме — установив стент, выражаю ему огромную сердечную благодарность! (Оставивший отзыв лечился по адресу ул. Велозаводская, д. 1/1)
Отзыв опубликован: 11 января 2015 года
Аноним
Принимал врач: Шолтояну А. В.
Мы счастливы, что попали именно к этому доктору и именно в эту больницу. Спокойно, профессионально и честно Доктор Шолтояну делает свою работу, спасая жизни детей.
Понравилось:Трудно подобрать слова благодарности доктору А.В. Шолтояну, который спас жизнь моей дочери. Была оказана высококвалифицированная помощь, которую она получила в течение 10 дней. Необыкновенный персонал больницы, каждого из которых хотелось бы благодарить и благодарить.
Не понравилось:—
Отзыв опубликован: 16 августа 2015 года
Аноним
Принимал врач: Маныч Д. Ю.
Этот чудо-врач, по другому и назвать его не могу, делал мне эпидуральную анестезию перед операцией кесарево. Через 2 часа я уже спокойно вставала и перемещалась в обычном темпе по отделению. От анестезии не осталось никаких ощущений. У меня были первые роды, а у девочек, которые лежали вместе со мной, вторые, и они были тоже в восторге, т. к. раньше рожали в других роддомах, и анестезию делали им другие врачи. Рассказывали, что отходили по 9-10 часов. А в этот раз всего за два все восстановилось! (Бывший пациент лечился по адресу Коломенский проезд, д. 4)
Отзыв опубликован: 26 октября 2016 года
Аноним
Принимал врач: Прохоров А. Ю.
Хочется сказать огромное спасибо от всей нашей семьи Александру Ювенальевичу. Недавно мы лечили зубки под наркозом нашему сыну, я очень переживала, как Ваня перенесет санацию полости рта. Но благодаря такому специалисту ребенок хорошо вышел из наркоза, и мы в этот же день уехали домой в Рязань. Дай Вам Бог здоровья, и спасибо за все. (Написавший отзыв посещал учреждение по адресу ул. Тимура Фрунзе, д. 16)
Отзыв опубликован: 7 декабря 2016 года
Аноним
Принимал врач: Морозова Е. В.
Не могу не поделиться несгладимым впечатлением от артистических талантов реаниматолога Елены Васильевны. Когда скорая привезла мою маму в реанимацию ОКД1 на Волочаевскую 36 (5 эт.), переложили с каталки и отдали мне её вещи, Е. В. сразу повела меня в свой кабинет. А на вопрос — не будет ли она сначала осматривать мою маму, как только что поступившего пациента, и оказывать сейчас ей помощь? Она ответила: «Щас! У меня 7 человек. А я плюну на них с харчой (изобразила ногой в воздухе пинок с характерным звуком плевка!) и буду заниматься только вашей мамой». Потом в кабинете она долго искала куда бы записать мой номер телефона. Сказала, чтобы я ехала домой и позвонила в реанимацию завтра, когда её уже не будет. И только после всего этого цирка, у меня появилась слабая надежда, что, возможно, она найдёт время для моей мамы. Мама вскоре умерла. Елена Васильевна, направьте Ваше актерское мастерство на изображение уважения к пациентам и сочувствие родственникам, пожалуйста. (Бывший пациент был по адресу ул. Волочаевская, д. 36)
Отзыв опубликован: 21 сентября 2017 года
Аноним
Принимал врач: Мельков Е. Е.
Евгению Евгеньевичу Мелькову спокойно можно довериться. Он умнейший врач и такой добрый, я под впечатлением до сих пор. Первая операция в жизни, представляете, как я боялась, нервничала, а Евгений Евгеньевич поддержал меня добрыми словами. Это много значило, я тогда поверила, что все будет хорошо, что операция пройдет успешно. Он ставил мне наркоз, я быстро отключилась и ничего не чувствовала. После операции пришла в себя, меня не тошнило, не было плохо, легко отошла. Спасибо!
Отзыв опубликован: 7 мая 2017 года
Аноним
Принимал врач: Маныч Д. Ю.
Здравствуйте, я рожала 9 октября. Хочу поблагодарить Маныча Дмитрия Юрьевича за его работу! Отлично сделал эпидуралку, я ничего не чувствовала, и последствий никаких! Очень хороший врач! Спасибо вам большое, Дмитрий Юрьевич! (Бывший пациент лечился по адресу Коломенский проезд, д. 4)
Отзыв опубликован: 4 мая 2015 года
5 замечательноАноним
Принимал врач: Николаев Л. Л.
Николаев Лев Леонидович — профессионал своего дела! В нем сочетаются профессиональные и человеческие качества, забота и внимание к своим пациентам. Если есть какие-нибудь сомнения, Лев Леонидович подскажет и поможет справиться с ними. Всегда ответственно относится к своим пациентам. Побольше бы таких специалистов. Спасибо Вам огромное! (Пациент посещал учреждение по адресу бул. Цветной, д. 25, стр. 5)
Отзыв опубликован: 13 февраля 2017 года
Аноним
Принимал врач: Самохина О. В.
Нет бы сразу прийти к терапевту и начать лечиться основательно, так я дотянула до края. После перенесенной простуды (или гриппа, кто теперь уже разберет, что это было) у меня остался сильный кашель. Ничего сделать самой не получалось, температура держалась и самочувствие было никуда не годное. Ольга Викторовна на приеме объяснила мне, что у меня уже самый что ни на есть бронхит. Доктор выписала лекарства, в том числе и антибиотики. Внимательно, вдумчиво подобрала для меня таблетки, т. К. У меня много противопоказаний. Спасибо доктору, что была так заботлива и добра на приеме. Это и морально еще поддержало, что ты кому-то нужен, тебе хотят помочь. И это получилось, сейчас уже никаких симптомов болезни нет. Чувствую себя бодро, поправилась. Всем желаю не болеть! А если так уже случилось и пора к врачу, я бы советовала обратиться к этому терапевту. (Оставивший отзыв посещал учреждение по адресу Боровское шоссе, д. 30)
Отзыв опубликован: 15 января 2017 года
Визуализация внутриклеточной продукции перекиси водорода с помощью HyPer при стимуляции клеток HeLa эпидермальным фактором роста
Избыточная продукция активных форм кислорода (АФК) и связанный с этим окислительный стресс играют важную роль во всех фазах атеросклероза. Несмотря на значительные достижения в понимании регуляторных путей и молекулярных источников АФК в сосудистой сети, специфическое обнаружение и количественное определение АФК в экспериментальных моделях болезни остается проблемой.Мы стремились разработать надежную и простую процедуру визуализации для исследования перепроизводства АФК в сосудистой сети и в различных органах / тканях при атеросклерозе. С этой целью непроницаемый для клеток зонд ROS Brite ™ 700 (RB700), который дает яркую флуоресценцию в ближнем инфракрасном диапазоне при окислении ROS, был инкапсулирован в стерически стабилизированные липосомы (VLp), нацеленные на VCAM-1. Культивируемые человеческие эндотелиальные клетки (EC) и макрофаги (Mac) использовали для экспериментов in vitro. Мыши C57BL6 / J и ApoE — / — были рандомизированы для получения нормальной или богатой жирами и холестерином диеты в течение 10 или 32 недель.Мышам вводили ретроорбитальную инъекцию флуоресцентно меченных VLp, включающих RB700 (VLp-RB700). Через два часа специфические сигналы окисленного RB700 и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- (7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ила) (NBD-DSPE) , вставленные в бислои липосом, были измерены ex vivo в аорте и различных органах мыши с помощью флуоресцентной визуализации с высоким разрешением. VLp-RB700 эффективно поглощался культивированными человеческими EC и Mac, что подтверждено флуоресцентной микроскопией и спектрофлуориметрией.После системного введения атеросклеротическим мышам ApoE — / — VLp-RB700 эффективно концентрировались в местах поражения аорты, на что указывает усиленная флуоресценция NBD. Значительное увеличение сигнала окисленного RB700 было обнаружено в аорте, печени и почках атеросклеротических мышей ApoE — / -. Инкапсуляция RB700 в стерически стабилизированный VCAM-1-чувствительный Lp может быть новой стратегией для качественного и количественного определения ROS в сосудистой сети и различных органах и тканях на животных моделях болезни.Точное и точное обнаружение АФК в экспериментальных моделях болезней может облегчить перенос результатов на человеческие патологии. 1. Введение Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль в физиологии клетки. Однако, когда они производятся в избытке в ответ на различные патологические стимулы, АФК представляют собой вредные молекулы, вызывающие повреждение клеток за счет сложных механизмов, которые обычно включают активацию определенных путей передачи сигнала и обратимые / необратимые изменения биологических молекул, вызванные окислением (например,ж., липиды, белки, нуклеиновые кислоты и углеводы) [1]. АФК представляют собой химически активные молекулы, производные от кислорода, которые являются побочными продуктами клеточного дыхания и метаболизма и вырабатываются также строго регулируемым образом специфическими ферментными системами. Одно- или двухэлектронное восстановление молекулярного кислорода (O2) приводит к образованию супероксид-аниона (O2⋅-) и пероксида водорода (h3O2) соответственно. И O2⋅-, и h3O2 участвуют во вторичных химических реакциях с образованием высокотоксичных свободных радикалов, таких как гидроксильный радикал (HO⋅), гидропероксильный радикал (HOO⋅) и пероксинитрит-анион (ONOO⁻).Клетки и организмы эволюционировали, чтобы ограничить потенциально вредные эффекты ROS, экспрессируя высокоорганизованные ферментативные и неферментативные антиоксидантные системы. Однако, в отличие от O2⋅- и h3O2, которые специфически улавливаются специальными антиоксидантными ферментами (например, супероксиддисмутазой и каталазой), HO⋅, HOO⋅ и ONOO⁻ не могут быть нейтрализованы ферментативными реакциями. Таким образом, последние АФК легко взаимодействуют с биологическими молекулами в месте их образования и обычно запускают цепь окислительных реакций, дополнительно способствуя обострению окислительного стресса клетки.В совокупности, будучи высокореактивными и относительно короткоживущими молекулами (от 10 до 10⁻⁶ секунд), тип, скорость образования и внутриклеточная компартментализация АФК, вероятно, будут определять их физиологическое или патологическое воздействие на биологические системы [2 ]. Избыточное производство АФК и связанный с этим окислительный стресс механически связаны с многочисленными патологиями человека, включая сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), метаболические нарушения, рак и нейродегенерацию. Другие и мы продемонстрировали, что усиленное образование АФК играет важную роль во всех фазах атеросклероза [3], и в целом это признак сердечно-сосудистых заболеваний [4].Сильная корреляция между активированной АФК и тяжестью атеросклеротических поражений была продемонстрирована у людей и атеросклеротических мышей [3–6]. Примечательно, что ранние атеросклеротические поражения едва ли можно обнаружить с помощью стандартных процедур визуализации (например, эхографии и ангиографии) из-за того, что некоторые параметры, такие как диаметр просвета и толщина стенки сосуда, существенно не изменяются по сравнению с нормальными условиями. Однако поражения на ранней стадии характеризуются сильными окислительными и воспалительными реакциями, которые в дальнейшем способствуют прогрессированию атеромы [7].Таким образом, невозможно переоценить потребность в новых инструментах для обнаружения образования АФК при атеросклерозе. Недавно компанией AAT Bioquest (США) был разработан и оптимизирован новый водорастворимый чувствительный к окислительно-восстановительному потенциалу флуоресцентный зонд ROS Brite ™ 700 (RB700) для обнаружения ROS in vivo у мелких экспериментальных животных (https: // www. .aatbio.com). Основным преимуществом RB700 является то, что он генерирует яркую флуоресценцию в ближнем инфракрасном диапазоне при окислении ROS; Эта важная особенность сводит к минимуму артефакты, обычно вызываемые помехами аутофлуоресценции ткани, и, следовательно, приводит к значительному улучшению отношения сигнал / фоновый шум.Тем не менее, недостаток этого зонда проистекает из его свойства непроницаемости для клеток, и поэтому внутриклеточное и, в частности, окислительное микроокружение атеросклеротической бляшки легко недооценивается. Чтобы преодолеть это техническое ограничение, в попытке доставить и сконцентрировать зонд в атеросклеротических поражениях, мы разработали специальный состав липосом (Lp), стабилизированных полиэтиленгликолем (ПЭГ), нацеленных на молекулу адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1). как наноносители для RB700.Мы предоставляем здесь доказательства того, что чувствительный к окислительно-восстановлению датчик изображения RB700, захваченный в VCAM-1-нацеленный ПЭГилированный Lp, надежно локализует и непосредственно количественно определяет образование ROS в атероматозной бляшке и в различных органах при экспериментальном атеросклерозе. 2. Материалы и методы 2.1. Материалы Если не указано иное, стандартные химические вещества и реагенты были получены от Sigma-Aldrich. Липиды были приобретены у Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Нацеливающий пептид VCAM-1 (Nh3-VHPKQHRGGSKGC-COOH) был синтезирован GeneCust (Дюделанж, Люксембург).ROS Brite ™ 700 (RB700) был получен от AAT Bioquest. Первичные и вторичные антитела были от Santa Cruz Biotechnology. Использовали линию эндотелиальных клеток (ЕС) пупочной вены человека (EA.hy926), полученную из Американской коллекции типовых культур, и линию моноцитарных (Mon) клеток человека THP-1. 2.2. Получение и характеристика липосом, нацеленных на VCAM-1, как наноносителей RB700 (VLp-RB700) Стерически стабилизированные липосомы, нацеленные на VCAM-1 (VLp), были приготовлены с использованием метода экструзии, как описано нами ранее [8].Вкратце, основные компоненты Lp были следующими: 45 мол.% 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 28 мол.% Холестерина, 20 мол.% 1,2-диолеоил-snglycero-3- фосфатидная кислота (ДОФА), 2 мол.% (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- (7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил) (соль аммония) (NBD- PE), 4 мол.% 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси (полиэтиленгликоль) -2000] (соль аммония) (PEG-DSPE) и 1 мол.% 1,2-дистеароил -sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [малеимид (полиэтиленгликоль) -2000] (Mal-PEG-DSPE).Смесь фосфолипидов в хлороформе сушили на роторном испарителе, а затем липидную пленку гидратировали с помощью PBS или раствора, содержащего флуорогенный окислительно-восстановительный датчик RB700. Затем суспензию многослойных везикул экструдировали через поликарбонатные мембраны 200 нм с использованием мини-экструдера (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL / USA). Пептид Nh3-VHPKQHRGGSKGC-COOH с известным сродством к VCAM-1 [9] был связан с функционализированными малеимидом липидами ПЭГ (Mal-PEG-DSPE), как описано в [8].Lp центрифугировали с использованием фильтровальных блоков Amicon ™ Ultra 100 K для отделения инкапсулированного от свободного RB700 и связанного пептида от несвязанного Lp. Флуоресценцию RB700 в фильтрате разделительных колонок (свободный RB700) измеряли при нм (возбуждающих нм) с помощью флуороспектрометра (NanoDrop ™ 3300 Fluorospectrometer, Thermo Fisher Scientific) и использовали для определения концентрации свободного RB700 (по стандартной кривой флуоресценции). для концентраций RB700). Концентрацию инкапсулированного Lp RB700 определяли путем вычитания свободного RB700 из первоначально добавленной концентрации.Количество пептида VCAM-1, связанного с поверхностью Lp, определяли с использованием анализа сверхвысокой жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) (Agilent 1290 Infinity, Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), как подробно описано в [8]. Размер частиц и индекс полидисперсности (PDI) анализировали методом динамического светорассеяния (DLS) на аппарате Nano ZS (ZEN 3600) (Malvern Instruments, Malvern, UK). 2.3. Культура клеток ЭК выращивали до слияния в среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) в соответствии с инструкциями поставщика (ATTC).Дифференцировку моно-макрофагов (Mac) проводили путем инкубации THP-1 Mon в течение 3 дней с 100 нмоль / л форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), как мы ранее описали [5]. 2.4. Анализ цитотоксичности in vitro RB700, нацеленного на VCAM-1, захватывающий Lp Потенциальные токсические эффекты VLp-RB700 были протестированы на культивируемых EC и Mac с помощью анализа пролиферации клеток Vybrant ™ MTT [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид] в соответствии с рекомендациями производителя. протокол (Thermo Scientific). 2.5. Стратегия визуализации АФК в экспериментальной модели атеросклероза. Самки мышей B6.129P2-Apoetm1Unc / J (ApoE — / -; инвентарный номер: 002052) и C57BL / 6 (инвентарный номер: 000664) были приобретены в лаборатории Джексона, выведены на нашем предприятии в условиях SPF и подвергнуты воздействию 12 ч. циклов свет / темнота и доступ к стандартной диете для грызунов и воде ad libitum. Для развития атеросклеротических поражений аорты [10] в возрасте 12 недель самки мышей ApoE — / — были рандомизированы (/ группа) для получения нормальной диеты (ND) или диеты с высоким содержанием жиров и холестерина (HD) в течение 10 или 32 недели.У нас было три экспериментальные группы: (i) мыши ApoE — / -, получавшие ND в течение 10 недель, (ii) мыши ApoE — / -, получавшие HD в течение 10 недель, и (iii) мыши ApoE — / -, которым вводили HD в течение 10 недель. 32 недели. Самок мышей C57BL6 / J, получавших обычную диету () в течение 10 недель, использовали в качестве контроля. VLp-RB700 доставляли мышам с помощью одной ретроорбитальной инъекции под анестезией кетамин-ксилазин-ацепромазином (80/10/2 мг / кг) в дозе 20 мМ Lp / 500 мкМ RB700 (болюс 100 мкл). Через два часа животных умерщвляли и через сердечную пункцию собирали ~ 1 мл крови.Чтобы удалить любые следы циркулирующих VLp-RB700, животных перфузировали (15 мин) нагретым кальцийсодержащим PBS, pH 7,4. Перед флуоресцентным анализом осторожно удаляли периваскулярную жировую ткань аорты. Флуоресцентный сигнал отслеживали ex vivo в аорте и различных органах с использованием системы визуализации IVIS ™. Чтобы отделить конкретный сигнал RB700 от аутофлуоресценции ткани, мы выполнили спектральный анализ несмешивания с использованием программного обеспечения Living Image 4.3.1. Окрашивание масляным красным O (ORO) использовали для оценки атеросклеротических поражений аорты, как мы ранее описали [6].Исследования на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Директивы ЕС 2010/63 / EU с предварительного одобрения этического комитета Института клеточной биологии и патологии «Николае Симионеску». 2.6. Вестерн-блоттинг Экстракты белка аорты и вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [11]. Вкратце, всю аорту, полученную от мышей C57BL6 / J и ApoE — / -, суспендировали в буфере RIPA, содержащем коктейль ингибиторов протеазы (Sigma), и подвергали обработке на основе стеклянных шариков (1.0 мм) механическая гомогенизация / разрушение (BioSpec). Денатурацию белка проводили в буфере для образцов для электрофореза Лэммли (Serva) при 95 ° C в течение 20 минут. Образцы белка (30 мкг / дорожка) подвергали SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad). Последние инкубировали в течение 12 часов (4 ° C) с первичным антителом против нитротирозина (NT) (мышиное моноклональное, sc-32757, разведение 1: 200) с последующим часовым воздействием (при комнатной температуре) антимышиного IgG. -HRP (sc-2031, разведение 1: 2000) в качестве вторичного антитела.Полосы белка детектировали с помощью хемилюминесцентной визуализации (система ImageQuant LAS 4000, Fujifilm). Денситометрический анализ уровней аддукта NT-белка на основе TotalLab ™ проводили с использованием уровня экспрессии белка -актина в качестве внутренней нормализации. 2.7. Статистический анализ Данные, полученные как минимум из трех независимых экспериментов, были выражены как. Статистический анализ был выполнен с помощью -тест и односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Тьюки; считался статистически значимым.3. Результаты 3.1. Характеристика Lp, нацеленного на VCAM-1 (VLp) Средний гидродинамический диаметр VLp был измерен методом DLS после разбавления 1: 100 в дистиллированной воде; полученное значение было нм () с унимодальным распределением по размерам, показанным индексом полидисперсности, который всегда был меньше 0,2. Для нацеливания на активированный эндотелий, обычно покрывающий атеросклеротические поражения, мы воспользовались воздействием на поверхность VCAM-1, который обычно экспрессируется эндотелиальными клетками при воспалительных условиях [12].Как определено с помощью УВЭЖХ, эффективность связывания специфического пептида распознавания VCAM-1, ковалентно связанного с липосомным бислоем, составляла ≈10 мкг пептида / мкмоль липосом. 3.2. Lp, нацеленный на VCAM-1, эффективно поглощается культивированными ЭК и Mac человека Эндотелиальные клетки (EC) и Mac, происходящие из THP-1, использовали для исследования способности наноносителя VLp-RB700 доставлять RB700 в клетки. Культивируемые клетки подвергали воздействию возрастающих концентраций VLp-RB700 (1-10 мкМ) в течение 2 часов, затем промывали свежей культуральной средой и подвергали анализу на основе флуоресценции.Зависимое от концентрации увеличение поглощения VLp-RB700 культивированными EC и Mac было обнаружено с помощью флуоресцентной микроскопии (рисунки 1 (а) и 1 (b)). Количественная оценка клеточной интернализации VLp-RB700, проведенная с помощью флуоресцентного анализа с высоким разрешением (IVIS ™ Caliper, Perkin Elmer), продемонстрировала устойчивое, зависящее от концентрации VLp-RB700 значительное увеличение сигнала флуоресценции Lp, меченного NBD-DSPE, как в культивированных EC и Mac (Рисунки 1 (c) и 1 (e) и Рисунки 1 (d) и 1 (f)). (a)
Визуализация внутриклеточной продукции перекиси водорода с помощью HyPer при стимуляции клеток HeLa с помощью EGF
Избыточная продукция активных форм кислорода (АФК) и связанный с этим окислительный стресс играют важную роль во всех фазах атеросклероза.Несмотря на значительные достижения в понимании регуляторных путей и молекулярных источников АФК в сосудистой сети, специфическое обнаружение и количественное определение АФК в экспериментальных моделях болезни остается проблемой. Мы стремились разработать надежную и простую процедуру визуализации для исследования перепроизводства АФК в сосудистой сети и в различных органах / тканях при атеросклерозе. С этой целью непроницаемый для клеток зонд ROS Brite ™ 700 (RB700), который дает яркую флуоресценцию в ближнем инфракрасном диапазоне при окислении ROS, был инкапсулирован в стерически стабилизированные липосомы (VLp), нацеленные на VCAM-1.Культивируемые человеческие эндотелиальные клетки (EC) и макрофаги (Mac) использовали для экспериментов in vitro. Мыши C57BL6 / J и ApoE — / — были рандомизированы для получения нормальной или богатой жирами и холестерином диеты в течение 10 или 32 недель. Мышам вводили ретроорбитальную инъекцию флуоресцентно меченных VLp, включающих RB700 (VLp-RB700). Через два часа специфические сигналы окисленного RB700 и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- (7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ила) (NBD-DSPE) , вставленные в бислои липосом, были измерены ex vivo в аорте и различных органах мыши с помощью флуоресцентной визуализации с высоким разрешением.VLp-RB700 эффективно поглощался культивированными человеческими EC и Mac, что подтверждено флуоресцентной микроскопией и спектрофлуориметрией. После системного введения атеросклеротическим мышам ApoE — / — VLp-RB700 эффективно концентрировались в местах поражения аорты, на что указывает усиленная флуоресценция NBD. Значительное увеличение сигнала окисленного RB700 было обнаружено в аорте, печени и почках атеросклеротических мышей ApoE — / -. Инкапсуляция RB700 в стерически стабилизированный VCAM-1-чувствительный Lp может быть новой стратегией для качественного и количественного определения ROS в сосудистой сети и различных органах и тканях на животных моделях болезни.Точное и точное обнаружение АФК в экспериментальных моделях болезней может облегчить перенос результатов на человеческие патологии. 1. Введение Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль в физиологии клетки. Однако, когда они производятся в избытке в ответ на различные патологические стимулы, АФК представляют собой вредные молекулы, вызывающие повреждение клеток за счет сложных механизмов, которые обычно включают активацию определенных путей передачи сигнала и обратимые / необратимые изменения биологических молекул, вызванные окислением (например,ж., липиды, белки, нуклеиновые кислоты и углеводы) [1]. АФК представляют собой химически активные молекулы, производные от кислорода, которые являются побочными продуктами клеточного дыхания и метаболизма и вырабатываются также строго регулируемым образом специфическими ферментными системами. Одно- или двухэлектронное восстановление молекулярного кислорода (O2) приводит к образованию супероксид-аниона (O2⋅-) и пероксида водорода (h3O2) соответственно. И O2⋅-, и h3O2 участвуют во вторичных химических реакциях с образованием высокотоксичных свободных радикалов, таких как гидроксильный радикал (HO⋅), гидропероксильный радикал (HOO⋅) и пероксинитрит-анион (ONOO⁻).Клетки и организмы эволюционировали, чтобы ограничить потенциально вредные эффекты ROS, экспрессируя высокоорганизованные ферментативные и неферментативные антиоксидантные системы. Однако, в отличие от O2⋅- и h3O2, которые специфически улавливаются специальными антиоксидантными ферментами (например, супероксиддисмутазой и каталазой), HO⋅, HOO⋅ и ONOO⁻ не могут быть нейтрализованы ферментативными реакциями. Таким образом, последние АФК легко взаимодействуют с биологическими молекулами в месте их образования и обычно запускают цепь окислительных реакций, дополнительно способствуя обострению окислительного стресса клетки.В совокупности, будучи высокореактивными и относительно короткоживущими молекулами (от 10 до 10⁻⁶ секунд), тип, скорость образования и внутриклеточная компартментализация АФК, вероятно, будут определять их физиологическое или патологическое воздействие на биологические системы [2 ]. Избыточное производство АФК и связанный с этим окислительный стресс механически связаны с многочисленными патологиями человека, включая сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), метаболические нарушения, рак и нейродегенерацию. Другие и мы продемонстрировали, что усиленное образование АФК играет важную роль во всех фазах атеросклероза [3], и в целом это признак сердечно-сосудистых заболеваний [4].Сильная корреляция между активированной АФК и тяжестью атеросклеротических поражений была продемонстрирована у людей и атеросклеротических мышей [3–6]. Примечательно, что ранние атеросклеротические поражения едва ли можно обнаружить с помощью стандартных процедур визуализации (например, эхографии и ангиографии) из-за того, что некоторые параметры, такие как диаметр просвета и толщина стенки сосуда, существенно не изменяются по сравнению с нормальными условиями. Однако поражения на ранней стадии характеризуются сильными окислительными и воспалительными реакциями, которые в дальнейшем способствуют прогрессированию атеромы [7].Таким образом, невозможно переоценить потребность в новых инструментах для обнаружения образования АФК при атеросклерозе. Недавно компанией AAT Bioquest (США) был разработан и оптимизирован новый водорастворимый чувствительный к окислительно-восстановительному потенциалу флуоресцентный зонд ROS Brite ™ 700 (RB700) для обнаружения ROS in vivo у мелких экспериментальных животных (https: // www. .aatbio.com). Основным преимуществом RB700 является то, что он генерирует яркую флуоресценцию в ближнем инфракрасном диапазоне при окислении ROS; Эта важная особенность сводит к минимуму артефакты, обычно вызываемые помехами аутофлуоресценции ткани, и, следовательно, приводит к значительному улучшению отношения сигнал / фоновый шум.Тем не менее, недостаток этого зонда проистекает из его свойства непроницаемости для клеток, и поэтому внутриклеточное и, в частности, окислительное микроокружение атеросклеротической бляшки легко недооценивается. Чтобы преодолеть это техническое ограничение, в попытке доставить и сконцентрировать зонд в атеросклеротических поражениях, мы разработали специальный состав липосом (Lp), стабилизированных полиэтиленгликолем (ПЭГ), нацеленных на молекулу адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1). как наноносители для RB700.Мы предоставляем здесь доказательства того, что чувствительный к окислительно-восстановлению датчик изображения RB700, захваченный в VCAM-1-нацеленный ПЭГилированный Lp, надежно локализует и непосредственно количественно определяет образование ROS в атероматозной бляшке и в различных органах при экспериментальном атеросклерозе. 2. Материалы и методы 2.1. Материалы Если не указано иное, стандартные химические вещества и реагенты были получены от Sigma-Aldrich. Липиды были приобретены у Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Нацеливающий пептид VCAM-1 (Nh3-VHPKQHRGGSKGC-COOH) был синтезирован GeneCust (Дюделанж, Люксембург).ROS Brite ™ 700 (RB700) был получен от AAT Bioquest. Первичные и вторичные антитела были от Santa Cruz Biotechnology. Использовали линию эндотелиальных клеток (ЕС) пупочной вены человека (EA.hy926), полученную из Американской коллекции типовых культур, и линию моноцитарных (Mon) клеток человека THP-1. 2.2. Получение и характеристика липосом, нацеленных на VCAM-1, как наноносителей RB700 (VLp-RB700) Стерически стабилизированные липосомы, нацеленные на VCAM-1 (VLp), были приготовлены с использованием метода экструзии, как описано нами ранее [8].Вкратце, основные компоненты Lp были следующими: 45 мол.% 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 28 мол.% Холестерина, 20 мол.% 1,2-диолеоил-snglycero-3- фосфатидная кислота (ДОФА), 2 мол.% (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- (7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил) (соль аммония) (NBD- PE), 4 мол.% 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси (полиэтиленгликоль) -2000] (соль аммония) (PEG-DSPE) и 1 мол.% 1,2-дистеароил -sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [малеимид (полиэтиленгликоль) -2000] (Mal-PEG-DSPE).Смесь фосфолипидов в хлороформе сушили на роторном испарителе, а затем липидную пленку гидратировали с помощью PBS или раствора, содержащего флуорогенный окислительно-восстановительный датчик RB700. Затем суспензию многослойных везикул экструдировали через поликарбонатные мембраны 200 нм с использованием мини-экструдера (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL / USA). Пептид Nh3-VHPKQHRGGSKGC-COOH с известным сродством к VCAM-1 [9] был связан с функционализированными малеимидом липидами ПЭГ (Mal-PEG-DSPE), как описано в [8].Lp центрифугировали с использованием фильтровальных блоков Amicon ™ Ultra 100 K для отделения инкапсулированного от свободного RB700 и связанного пептида от несвязанного Lp. Флуоресценцию RB700 в фильтрате разделительных колонок (свободный RB700) измеряли при нм (возбуждающих нм) с помощью флуороспектрометра (NanoDrop ™ 3300 Fluorospectrometer, Thermo Fisher Scientific) и использовали для определения концентрации свободного RB700 (по стандартной кривой флуоресценции). для концентраций RB700). Концентрацию инкапсулированного Lp RB700 определяли путем вычитания свободного RB700 из первоначально добавленной концентрации.Количество пептида VCAM-1, связанного с поверхностью Lp, определяли с использованием анализа сверхвысокой жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) (Agilent 1290 Infinity, Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), как подробно описано в [8]. Размер частиц и индекс полидисперсности (PDI) анализировали методом динамического светорассеяния (DLS) на аппарате Nano ZS (ZEN 3600) (Malvern Instruments, Malvern, UK). 2.3. Культура клеток ЭК выращивали до слияния в среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) в соответствии с инструкциями поставщика (ATTC).Дифференцировку моно-макрофагов (Mac) проводили путем инкубации THP-1 Mon в течение 3 дней с 100 нмоль / л форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), как мы ранее описали [5]. 2.4. Анализ цитотоксичности in vitro RB700, нацеленного на VCAM-1, захватывающий Lp Потенциальные токсические эффекты VLp-RB700 были протестированы на культивируемых EC и Mac с помощью анализа пролиферации клеток Vybrant ™ MTT [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид] в соответствии с рекомендациями производителя. протокол (Thermo Scientific). 2.5. Стратегия визуализации АФК в экспериментальной модели атеросклероза. Самки мышей B6.129P2-Apoetm1Unc / J (ApoE — / -; инвентарный номер: 002052) и C57BL / 6 (инвентарный номер: 000664) были приобретены в лаборатории Джексона, выведены на нашем предприятии в условиях SPF и подвергнуты воздействию 12 ч. циклов свет / темнота и доступ к стандартной диете для грызунов и воде ad libitum. Для развития атеросклеротических поражений аорты [10] в возрасте 12 недель самки мышей ApoE — / — были рандомизированы (/ группа) для получения нормальной диеты (ND) или диеты с высоким содержанием жиров и холестерина (HD) в течение 10 или 32 недели.У нас было три экспериментальные группы: (i) мыши ApoE — / -, получавшие ND в течение 10 недель, (ii) мыши ApoE — / -, получавшие HD в течение 10 недель, и (iii) мыши ApoE — / -, которым вводили HD в течение 10 недель. 32 недели. Самок мышей C57BL6 / J, получавших обычную диету () в течение 10 недель, использовали в качестве контроля. VLp-RB700 доставляли мышам с помощью одной ретроорбитальной инъекции под анестезией кетамин-ксилазин-ацепромазином (80/10/2 мг / кг) в дозе 20 мМ Lp / 500 мкМ RB700 (болюс 100 мкл). Через два часа животных умерщвляли и через сердечную пункцию собирали ~ 1 мл крови.Чтобы удалить любые следы циркулирующих VLp-RB700, животных перфузировали (15 мин) нагретым кальцийсодержащим PBS, pH 7,4. Перед флуоресцентным анализом осторожно удаляли периваскулярную жировую ткань аорты. Флуоресцентный сигнал отслеживали ex vivo в аорте и различных органах с использованием системы визуализации IVIS ™. Чтобы отделить конкретный сигнал RB700 от аутофлуоресценции ткани, мы выполнили спектральный анализ несмешивания с использованием программного обеспечения Living Image 4.3.1. Окрашивание масляным красным O (ORO) использовали для оценки атеросклеротических поражений аорты, как мы ранее описали [6].Исследования на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Директивы ЕС 2010/63 / EU с предварительного одобрения этического комитета Института клеточной биологии и патологии «Николае Симионеску». 2.6. Вестерн-блоттинг Экстракты белка аорты и вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [11]. Вкратце, всю аорту, полученную от мышей C57BL6 / J и ApoE — / -, суспендировали в буфере RIPA, содержащем коктейль ингибиторов протеазы (Sigma), и подвергали обработке на основе стеклянных шариков (1.0 мм) механическая гомогенизация / разрушение (BioSpec). Денатурацию белка проводили в буфере для образцов для электрофореза Лэммли (Serva) при 95 ° C в течение 20 минут. Образцы белка (30 мкг / дорожка) подвергали SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad). Последние инкубировали в течение 12 часов (4 ° C) с первичным антителом против нитротирозина (NT) (мышиное моноклональное, sc-32757, разведение 1: 200) с последующим часовым воздействием (при комнатной температуре) антимышиного IgG. -HRP (sc-2031, разведение 1: 2000) в качестве вторичного антитела.Полосы белка детектировали с помощью хемилюминесцентной визуализации (система ImageQuant LAS 4000, Fujifilm). Денситометрический анализ уровней аддукта NT-белка на основе TotalLab ™ проводили с использованием уровня экспрессии белка -актина в качестве внутренней нормализации. 2.7. Статистический анализ Данные, полученные как минимум из трех независимых экспериментов, были выражены как. Статистический анализ был выполнен с помощью -тест и односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Тьюки; считался статистически значимым.3. Результаты 3.1. Характеристика Lp, нацеленного на VCAM-1 (VLp) Средний гидродинамический диаметр VLp был измерен методом DLS после разбавления 1: 100 в дистиллированной воде; полученное значение было нм () с унимодальным распределением по размерам, показанным индексом полидисперсности, который всегда был меньше 0,2. Для нацеливания на активированный эндотелий, обычно покрывающий атеросклеротические поражения, мы воспользовались воздействием на поверхность VCAM-1, который обычно экспрессируется эндотелиальными клетками при воспалительных условиях [12].Как определено с помощью УВЭЖХ, эффективность связывания специфического пептида распознавания VCAM-1, ковалентно связанного с липосомным бислоем, составляла ≈10 мкг пептида / мкмоль липосом. 3.2. Lp, нацеленный на VCAM-1, эффективно поглощается культивированными ЭК и Mac человека Эндотелиальные клетки (EC) и Mac, происходящие из THP-1, использовали для исследования способности наноносителя VLp-RB700 доставлять RB700 в клетки. Культивируемые клетки подвергали воздействию возрастающих концентраций VLp-RB700 (1-10 мкМ) в течение 2 часов, затем промывали свежей культуральной средой и подвергали анализу на основе флуоресценции.Зависимое от концентрации увеличение поглощения VLp-RB700 культивированными EC и Mac было обнаружено с помощью флуоресцентной микроскопии (рисунки 1 (а) и 1 (b)). Количественная оценка клеточной интернализации VLp-RB700, проведенная с помощью флуоресцентного анализа с высоким разрешением (IVIS ™ Caliper, Perkin Elmer), продемонстрировала устойчивое, зависящее от концентрации VLp-RB700 значительное увеличение сигнала флуоресценции Lp, меченного NBD-DSPE, как в культивированных EC и Mac (Рисунки 1 (c) и 1 (e) и Рисунки 1 (d) и 1 (f)). (a)
Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.