Мкб 10 кератоакантома: Кератоакантома — МКБ-10 | Medum.ru

Публикации в СМИ

Предраковые кожные образования — доброкачественные заболевания с высоким риском перерождения в плоскоклеточный рак. К ним относят хронические дерматиты, кератоз, хронический хейлит, старческую или рубцовую атрофию кожи, крауроз. Среди нозологических форм, чаще идёт речь о старческой кератоме, кератоакантоме, лейкоплакии, кожном роге. Ряд заболеваний являются облигатным предраком: пигментная ксеродерма, эритроплакия.

Актинический кератоз — грубое чешуйчатое поражение эпидермиса в областях тела, подверженных постоянному воздействию солнечных лучей • Появляется в течение 3-й или 4-й декады жизни; у 10–20% больных малигнизируется • Если биопсия подтверждает доброкачественность заболевания, лечение состоит в иссечении или криодеструкции • Больным со множественными поражениями показана местная химиотерапия (фторурацил).

МКБ-10. L57.0 Актинический [фотохимический] кератоз

Кератоакантома — доброкачественная эпидермальная опухоль волосяных фолликулов в виде одиночных или множественных шаровидных узлов с кратерообразным углублением в центре, заполненным ороговевшим эпителием • Локализуется на голове, шее и верхних конечностях • Опухоль быстро прогрессирует в течение 2–8 нед с последующим спонтанным разрушением • Лечение — иссечение с гистологическим исследованием.

Невусы (родимые пятна) — гамартомоподобные пороки развития кожи, могут развиваться как из элементов эпидермиса, так и собственно дермы (соединительной ткани, сосудистых элементов или меланоцитов). Они представляют собой пигментированные образования кожи, как правило выступающие над поверхностью. Некоторые невусы (особенно меланоцитарные и диспластические) могут малигнизироваться. Редко перерождаются хорошо очерченные и однородно окрашенные невусы.

Акантоз чернеющий — дерматоз, проявляющийся чаще доброкачественными бородавчатыми ороговевающими разрастаниями складок кожи чёрного цвета, особенно в подмышечных областях, на шее, в паховой и анальной областях. Может быть наследственным (*100600, Â) или приобретённым (в результате эндокринных нарушений, злокачественных новообразований, лекарственным [никотиновая кислота, диэтилстильбэстрол, пероральные контрацептивы, ГК]). Течение хроническое. Лечение этиотропное. Необходимо полное онкологическое обследование. Синонимы: Acanthosis nigricans, пигментно-сосочковая дистрофия кожи, папиллярно-пигментная дистрофия.

МКБ-10 • L83 Acanthosis nigricans

Пигментная ксеродерма (см. Ксеродерма пигментная).
Эритроплакия (болезнь Кейра) развивается редко, чаще у мужчин пожилого возраста на головке полового члена или крайней плоти. Клинически выявляют ограниченный, безболезненный, ярко-красный узел. Вначале узел имеет бархатистую поверхность, а с прогрессированием (в течение длительного времени), появляются папилломатозные образования или изъязвления.

Лечение хирургическое.

МКБ-10. D23 Другие доброкачественные новообразования кожи

Кератоакантома — Клинические рекомендации

Заболевание встречается в возрасте от 14 до 90 лет, пик заболеваемости приходится на промежуток между 45 и 70 годами, 80% пациентов старше 40 лет. Исключение составляет множественная кератоакантома Фергсон-Смита,которая встречается в детском и подростковом возрасте.Мужчины болеют в 3 раза чаще, чем женщины.

Этиология и патогенез неизвестны.Вирусная природа происхождение кератоакантомы,

несмотря на выявление ДНК вируса папилломы человека в тканях опухоли почти в половине случаев,остается спорной.Множественная саморазрешающаяся кератоакантома Фергюсон-Смита наследуется по аутосомно-доминантному типу. Не исключается генетическая предрасположенность и при других формах опухоли.

Предрасполагающими факторами считаются:

• ультрафиолетовое излучение — частая локализация опухолей на открытых участках кожного покрова (лице, верхних отделах туловища, конечностях)
• иммунные нарушения на фоне лечения циклоспорином,инфликсимабом, у лиц, подвергавшихся лучевой терапии и аварийным лучевым воздействиям
• травма — возникновения опухолей в зоне операционных ран,послеожоговых и послеоперационных рубцов,татуировок (особенно при использовании красной туши)
• курение при локализации на слизистой рта
• контакт с химическими веществами (инсектициды, продукты перегонки нефти, деготь)

Считается доказанным, что кератоакантома возникает из гиперплазированного эпителия воронки одного или нескольких, близко расположенных волосяных фолликулов и связанных с ними сальных желез. Появление кератоакантомы на слизистых полости рта предположительно связывают с эктопическими сальными железами.

В настоящее время преобладает мнение,что кератоакантома это доброкачественно протекающий вариант плоскоклеточного рака кожи со спонтанным разрешением.

По международной классификации опухолей кожи ВОЗ (2018) — рак плоскоклеточный по типу кератоакантомы.

Выделяют следующие клинические варианты кератоакантомы:

• солитарная
• типичная
• гигантская
• кератоакантома с периферическим ростом (центробежная)
• бляшковидная
• в виде кожного рога
• подногтевая
• персистирующая
• рецидивная
• мультинодулярная
• множественная
• типа Фергсон-Смита
• типа Гржибовского
• типа Виттен-Зака
• солитарная и множественная в сочетании с иммуносупрессией,синдромом Мюир-Торре,пигментной ксеродермой

Солитарная типичная кератоакантома

Типичная кератоакантома,встречающаяся наиболее часто, начинается с мелкой одиночной плотной полусферической папулы телесного цвета, которая быстро увеличивается до округлого или овального экзофитного узла на широком основании красноватого, иногда с синюшным оттенком цвета, или цвета нормальной кожи размером 0,5-3 см в диаметре. Характерна моллюскоподобная форма элементов.В центре опухоли формируется кратерообразное углубление, заполненное рыхлыми или плотными роговыми массами серо-коричневого цвета (псевдоязва). Периферический высокий валик, окружающий роговую пробку, имеет гладкую поверхность розового или телесного цвета. Кератотические массы легко удаляются, под ними иногда обнаруживаются папилломатозные разрастания. Как правило,типичная кератоакантома — одиночная опухоль,но в некоторых случаях отмечается высыпание нескольких (до 10) элементов. Обычная локализация — участки, подвергающиеся инсоляции (голова, кисти, предплечья, реже — верхние отделы туловища и нижние конечности). Редкие локализации — гениталии, слизистая рта (щеки, твердое небо, язык, десны), конъюнктива и периокулярная область.На конъюнктиве кератоакантома наблюдается в виде беловатого узелка с гиперкератозом в центре и расширенными эписклеральными сосудами вокруг. После фазы активного роста может наступить фаза стабилизации, в течение которой опухоль не изменяется в размерах.Через 3-9 мес обычно наблюдается спонтанная регрессия с исчезновением опухолевого узла и образованием атрофического рубца. В некоторых случаях фаза стабилизации не наступает, и опухоль может достичь гигантских размеров (до 10—20 см в диаметре). Сообщается о возникновение плоскоклеточной карциномы в 5-6 % случаев с метастазами в паращитовидные железы и региональные лимфоузлы.

Гигантская кератоакантома

Клинически идентична классическому типу, но ее размеры превышают 3 см, часто имеет овальную форму и локализуется в основном на тыле кистей, коже носа и щек. Среди больных преобладают женщины. Отличается быстрым ростом и вертикальным распространением, иногда с разрушением подлежащих тканей (могут вовлекаться мимические мышцы лица, сопровождаться прорастанием в черепномозговые нервы). Имеет тенденцию к спонтанной инволюции, хотя и более замедленной, но со значительными анатомическими изменениями.

Центробежная кератоакантома

Редкий вариант, для которого характерен прогрессирующий горизонтальный рост с одновременным заживлением в центре. Начинается с мелких папул, которые медленно эволюционируют до аннулярных или полициклических бляшек с элевирующими краями, иногда имеющими папуло-нодулярные элементы. В центре рубцующихся бляшек могут располагаться плотные пигментированные минипапулы. Такие кератоакантомы преимущественно солитарные, иногда достигают 20 см и более в поперечнике. В отдельных случаях опухоли бывают множественными располагающимися одно- или двусторонне, в основном на конечностях, чаще нижних, хотя локализация может быть любая. Спонтанный регресс наступает через 6-12 месяцев, но в части случаев растягивается на несколько лет. Описаны больные, у которых центробежные кератоакантомы сосуществовали с гигантскими и множественными. Опухоль может симулировать кольцевидную эластолитическую гранулему, перфорирующий серпигинирующий эластоз, гипертрофическую форму красной волчанки, плоскоклеточную карциному, туберкулез, серпигинирующий бугорковый сифилид, глубокие микозы.

Плоская бляшковидная кератоакантома

Характеризуется высыпанием в виде плоской бляшки без резко выраженного кратера и с равномерным распределением кератотических масс по ее поверхности.Встречаются с одинаковой частотой у мужчин и женщин. В среднем продолжительность их эволюции не отличается от типичных опухолей.

Кератоакантома в виде кожного рога

Характеризуется значительными по высоте кератотическими массами, исходящими из кратера и симулирующими кожный рог.

Подногтевая кератоакантома

Редкая агрессивная форма, наблюдавшаяся преимущественно у мужчин среднего возраста. Часто ее развитию предшествует травма. Преобладает поражение I пальца кисти. Опухоль отличается быстрым ростом, болезненностью и деструкцией подлежащей кости. Рентгенологически выявляют чашевидную эрозию кости без признаков склероза и периостальной реакции, по-видимому, развивающуюся в результате компрессии, а не прорастания опухолевой ткани. Узел становится доступным для обозрения после отделения ногтевой пластинки.Имеет сходство с бородавкой и плоскоклеточной карциномой. Спонтанная инволюция наблюдается редко.

Стойкая персистирующая кератоакантома

По клиническим проявлениям не отличается от классической, но ее эволюция может занимать более года

Рецидивная кератоакантома

Может развиваться как после спонтанной инволюции, так и после хирургического удаления разными методами, лазерной деструкции в различные сроки (от нескольких недель до нескольких месяцев). В большинстве случаев обнаруживатся в области первичной опухоли или по соседству и расценивается в качестве реактивного процесса

Мультинодулярная кератоакантома

Редкая форма,которая образуется в результате слияния нескольких близко расположенных кератоакантом. Кратеры, вначале изолированные, со временем также могут сливаться, образуя псевдоязву неправильной формы.

Множественная кератоакантома типа Фергюсон-Смита

Сообщается о спорадических случаях и семейных случаях,при которых прослеживается аутосомно-доминантный тип наследования.Ген, ответственный за развитие заболевания, картируется между D9529 (9q31) и D9S1 (9q22.1 — q22.2). По уточненным данным, спектр мутаций происходит в гене TGFBR1.Первоначальное появление множественных кератоакантом наблюдается в возрасте от 8 до 62 лет, но у большинства больных дебют заболевания в детском и подростковом возрасте. Характеризуется высыпанием деесятков-сотен типичных и атипичных кератоакантом на любых участках кожного покрова, но в основном на конечностях, в том числе — на ладонях и подошвах. Элементы проходят типичную постадийную эволюцию, но одновременно со спонтанным разрешением одних элементов с формированием атрофических рубцов неправильной формы, появляются новые высыпания.Сообщается о случаях сочетания с центробежной кератоакантомой и акрокератозом Гопфа.

Генерализованные эруптивные кератоакантомы Гржибовского

Заболевание обычно развивается в возрасте 50-60 лет с одинаковой частотой у мужчин и женщин.Характеризуется внезапным высыпанием сотен-тысяч миллиарных фолликулярных папул телесного цвета, тесно располагающихся или рассеянно в области лица, верхних отделов туловища, иногда в складках тела. В центре части элементов обнаруживаются гиперкератотические пробки. У отдельных больных отмечается поражение слизистой рта, гортани.Феномен Кёбнера положительный. Лицо часто приобретает маскообразный характер с формированием двустороннего эктропиона . Субъективно отмечается интенсивный зуд.Заболевание протекает хронически в течение неопределенного времени,спонтанный регресс высыпаний наблюдается редко. Случаев инвазивного роста и прогрессирование до плоскоклеточного рака не описано. Зарегистрированы случаи сочетания с типичными солитарными кератоакантомами.

Кератоакантомы множественные Виттен-Зака

Промежуточный тип между кератоакантомами Фергюсон-Смита и Гржибовского. Предполагается наследственный характер заболевания. Характеризуется одновременным высыпанием множественных милиарных и более крупные саморазрешающихся элемнтов.В некоторых случаях наблюдаются узловато-язвенные новобразования среднего и крупного размера и высыпания на слизистой оболочке полости рта.

Кератоакантомы при других заболеваниях

Солитарные и множественные кератоакантомы могут наблюдаться также при синдроме Мюир-Торре и пигментной ксеродерме.

Диагноз ставится на основании клинических проявлений; при солитарных или множественных поражениях выполняют эксцизионную биопсию, при крупных элементах — диагностическую биопсию зоны валика.

На основании результатов патоморфологического исследования различают 3 стадии кератоакантомы:

1. в I стадии (стадия А) наблюдается углубление в эпидермисе, заполненное роговыми массами. В боковых отделах роговые массы окружены дупликату-рой эпидермиса в виде «воротничка». От основания кератотической пробки отходят эпидермальные тяжи в подлежащую дерму, содержащие клетки с гиперхромными ядрами. Зона базальной мембраны сохранна;
2. во II стадии (стадия В) в основании кратера выявляется резко выраженная эпителиальная гиперплазия c проникновением плоскоэпителиальных тяжей глубоко в дерму. Клетки росткового слоя, как правило, бледно окрашены, крупнее, чем в норме, иногда видны митозы и явления дискератоза. В эпидермальных выростах обнаруживают признаки атипии клеток, полиморфизм, нижняя граница их не везде четкая. В дерме определяются отек, воспалительная реакция полиморфного типа с лимфоцитами, нейтрофильными, эозинофильными гранулоцитами с примесью плазмоцитов. Клетки инфильтрата иногда проникают в эпидермальные выросты. Подобную картину можно рассматривать как предрак;
3. в III стадии (стадия С) наблюдается нарушение целостности базальной мембраны с разрастанием эпидермальных выростов вглубь дермы и отшнуровкой комплексов плоскоэпителиальных клеток. Полиморфизм и гиперхроматоз ядер нарастают, дискератоз сменяется патологическим ороговением с образованием «роговых жемчужин», т.е. появляются все признаки плоскоклеточного рака с ороговением. В основании очага выявляется густой воспалительный инфильтрат.

В случаях регрессии кератоакантомы, возможной в I—II ст., роговая пробка уменьшается, структура базального слоя нормализуется, пролиферация эпидермиса прекращается. В инфильтрате появляется большое количество фибробластов с последующей фиброплазией и формированием рубца.Гистологические изменения при множественной кератоакантоме такие же,как при солитарной, однако пролиферация и атипия менее выражены и более четко прослеживается связь с эпителием устьев волосяных фолликулов.

Гистогенез кератоакантомы до последнего времени также представлялся спорным,однако недавно проведенные ИГХ-исследования выявили динамические изменения экспрессии цитокератинов в тканях опухоли на разных стадиях ее эволюции (СК1, СК10, СК14, СК15, СК16 и СК17). Окраска на СК15 (клон С8/144В), СК19 и СК34 негативна на всех стадиях, что позволяет интерпретировать кератоакантому как опухоль фолликулярного происхождения с инфундибулярной / истмической дифференцировкой.

Высокодифференцированный плоскоклеточный рак кожи,обычные бородавки, гигантский контагиозный моллюск, актинический кератоз, кожный рог,базалиома. Множественную форму следует дифференцировать с болезнью Кирле.

Из-за спонтанной инволюции кератоакантомы возможна выжидательная тактика в течение 3-6 месяцев.

• При солитарных опухолях производят хирургическое иссечение, кюретаж, электро-, крио- или лазерную деструкцию (С02, Ег: YAG, аргоновый лазеры). Альтернативные методы :
• 5-фторурациловая мазь
• проспидиновая мазь
• имиквимод
• внутриочаговое введение метотрексата, интерферона-альфа 2а
• При субунгвальных кератоакантомах из-за агрессивного течения иногда требуется ампутация концевой фаланги.
• При рецидивной форме рекомендуют хирургическое иссечение по Mohs, пероральное применение ацитретина, изотретиноина, небольших доз метотрексата коротким курсом, комбинацию лучевой терапии с последующим внутриочаговым введением триамцинолона.
• При центробежной кератоакантоме после хирургического иссечения приходится прибегать к реконструктивным мероприятиям, ароматические ретиноиды применяются более длительно (до 5-6 месяцев), иногда назначают лучевую терапию.
• При множественной кератоакантоме типа Фергюсон-Смита хорошие результаты наблюдаются от внутривенного введения 5-флюороурацила (12 мг/кг/день 5-дневными циклами с 2-дневными интервалами в течение 6 недель)
• При кератоакантомах Гржибовского и Виттена-Зака предпочтение отдается использованию ретиноидов.
• Ацитретин внутрь 50—75 мг 1 р/сут, 4—11 нед.
• При отсутствии эффекта прибегают к назначению циклофосфамида (200 мг/день в течение 3 месяцев с последующим снижением дозы до 100 мг, применяющейся еще в течение месяца; хороший эффект наблюдался от пульс-терапии — 1 г/мес. , на протяжении 6 месяцев).

В последние годы при различных вариантах кератоакантом апробируются фотодинамическая терапия, ингибитор EGFR тирозин-киназы — Эрлотиниб.

Прогноз. Кератоакантома — новообразование, характеризуется быстрым развитием и зачастую спонтанным регрессированием (обычно через 2—6 мес). В отдельных случаях возможна трансформация в плоскоклеточный рак.

Рак кожи > Клинические протоколы МЗ РК

  

  

ТАКТИКА ЛЕЧЕНИЯ НА СТАЦИОНАРНОМ УРОВНЕ

Карта наблюдения пациента, маршрутизация пациента (схемы, алгоритмы)

Пациент → первичный клинический осмотр кожных покровов → терапевт, профильный специалист → обследование, верификация диагноза → ЗНО, подозрение на ЗНО – лечение в ООД по месту жительства или КазНИИОиР.

Немедикаментозное лечение

Режим больного при проведении консервативного лечения – общий. В раннем послеоперационном периоде – постельный или полупостельный (в зависимости от объема операции и сопутствующей патологии). В послеоперационном периоде – палатный.

Диета стол — №15 (либо другой стол в зависимости от сопутствующего заболевания), после хирургического лечения – №15. (либо другой стол в зависимости от сопутствующего заболевания)

Медикаментозное лечение

Хирургическое вмешательство

• При экономном иссечении опухоль иссекают эллипсовидным разрезом, отстоящим на 0,5-2,0см от краев образования под наркозом.

• При локализации рака кожи на пальцах кисти и стопы с прорастанием в соединительную и костную ткань выполняется ампутация, экзартикуляция пальцев.
• При расположении опухоли на коже ушной раковины в верхней или центральной части ампутация ушной раковины.
• При локализации опухоли на коже волосистой части головы с прорастанием в кость черепа выполняется широкое иссечение опухоли кожи с резекцией участка кости черепа, пластика дефекта комбинированными лоскутами

Лимфодиссекция выполняется при наличии метастазов в лимфатических узлах и производится одновременно с удалением первичного опухолевого очага или при выявлении.
Профилактическая лимфодиссекция  не выполняется.

Стандартные хирургические вмешательства на регионарном лимфатическом аппарате при раке кожи

Стандартными хирургическими вмешательствами на лимфатическом аппарате являются: подключично-подмышечно-подлопаточная, подвздошно-пахово-бедренная, классическая радикальная шейная (операция Крайла), модифицированная радикальная шейная лимфодиссекция III типа (футлярно-фасциальная шейная). Пахово-бедренная лимфодиссекция. Операция Дюкена.

Лечение по стадиям

Базальноклеточный рак:

I и II стадии (T1-2N0M0):

• хирургическое удаление опухоли, при необходимости с одномоментным устранением послеоперационного дефекта одним из видов кожной пластики; 

В случае выявления при плановом гистологическом исследовании положительные края резекции показана адъювантная ЛТ или реиссечение. 

• Или лучевая терапия по радикальной программе (разовая суммарная доза подбирается с учетом локализации, размера опухоли, глубины поражения и цитологической или морфологической верификации опухоли). Близкофокусная рентгенотерапия. Дистанционная лучевая терапия на линейных ускорителях.

• Или криотерапия
• Или фотодинамическая терапия

   

III стадия  (T3N0M0):

• широкое иссечение опухоли кожи с одномоментной пластикой послеоперационного дефекта
• при локализации опухоли на конечности, когда имеет место обширное поражение мягких тканей, кости или сосудисто-нервного пучка на большом протяжении, – ампутация конечности;
• При локализации опухоли на коже волосистой части головы с прорастанием в кость черепа выполняется широкое иссечение опухоли кожи с резекцией участка кости черепа, пластика дефекта комбинированными лоскутами

В случае выявления при плановом гистологическом исследовании положительные края резекции показана адъювантная ЛТ. 

• при условно радикальном характере оперативного вмешательства проводится послеоперационная лучевая терапия на ложе удаленной опухоли до СОД 50–70 Гр
• или самостоятельная лучевая терапия по радикальной программе (разовая суммарная доза подбирается с учетом локализации, размера опухоли, глубины поражения и цитологической или морфологической верификации опухоли). Близкофокусная рентгенотерапия. Дистанционная лучевая терапия на линейных ускорителях.
• Или фотодинамическая терапия
• или электрохимиотерапия

​

IV стадия (любая Т любая N M1):

лечение паллиативное или симптоматическое по индивидуальным программам после обсуждения на МДГ (могут использоваться хирургические методы, лучевая терапия, системная химиотерапия, электрохимиотерапия).

Плоскоклеточный рак, метатипический рак, рак придатков кожи:
I стадия:

• хирургическое удаление опухоли;

В случае выявления при плановом гистологическом исследовании положительные края резекции показана адъювантная ЛТ.

• лучевая терапия по радикальной программе (разовая суммарная доза подбирается с учетом локализации, размера опухоли, глубины поражения и цитологической или морфологической верификации опухоли). Близкофокусная рентгенотерапия. Дистанционная лучевая терапия на линейных ускорителях.
• Криотерапия
• Фотодинамическая терапия

II стадия (T2N0M0)

• широкое иссечение опухоли кожи с одномоментной пластикой послеоперационного дефекта + лучевая терапия на зоны регионарного метастазирования

В случае выявления при плановом гистологическом исследовании положительные края резекции показана адъювантная ЛТ. 

• лучевая терапия по радикальной программе (разовая суммарная доза подбирается с учетом локализации, размера опухоли, глубины поражения и цитологической или морфологической верификации опухоли). Близкофокусная рентгенотерапия. Дистанционная лучевая терапия на линейных ускорителях.
• Электрохимиотерапия
• Фотодинамическая терапия

III стадия  (T3N0M0):

• широкое иссечение опухоли кожи с одномоментной пластикой послеоперационного дефекта + лучевая терапия на зоны регионарного метастазирования и послеоперационное ложе опухоли+ химиотерапия
• при локализации опухоли на конечности, когда имеет место обширное поражение мягких тканей, кости или сосудисто-нервного пучка на большом протяжении, – ампутация конечности;
• При локализации опухоли на коже волосистой части головы с прорастанием в кость черепа выполняется широкое иссечение опухоли кожи с резекцией участка кости черепа, пластика дефекта комбинированными лоскутами
• при условно радикальном характере оперативного вмешательства проводится послеоперационная лучевая терапия на ложе удаленной опухоли до СОД 50–70 Гр
• электрохимиотерапия

III стадия (любая T  N1  M0):

• широкое иссечение опухоли кожи с одномоментной пластикой послеоперационного дефекта + лучевая терапия на зоны регионарного метастазирования и послеоперационное ложе опухоли+ химиотерапия;
• электрохимиотерапия + хирургическое лечение

IV стадия (любая Т любая N M1):
лечение паллиативное или симптоматическое по индивидуальным программам после обсуждения на МДГ (могут использоваться хирургические методы, лучевая терапия, системная химиотерапия, электрохимиотерапия).

Томотерапия на томоаппаратах. Одним из вариантов высокотехнологичной лучевой терапии РТМ является Томотерапия – спиральное (гелическое “helical”) облучение, проводимое на специализированных линейных ускорителях – томоаппаратах. При их работе происходит одновременное ротационное движение во время сеанса облучения головки аппарата и лепестков (секторное IMRT) с одновременным поступательным продольным смещением стола. Спиральная томотерапия это сверхточная лучевая терапия управляемая по изображениям (IGRT), с помощью, которой осуществляется прецизионное подведение луча вращающего радиационного пучка к опухоли с одновременной защитой окружающих здоровых тканей, за счет визуализации и локализации анатомическихструктур на протяжении процесса лечения.Используемые в каждом направлении модулированные не только сверхточно фокусируется, но и характеризуется высокой конформностью. Существует много систем, которые позволяют создать сферическое распределение мелких доз, но томотерапия, позволяет изменить форму этой дозы при несферических и даже весьма сложных, вогнутых мишенях. Используются как стандартные методики фракционирования при подведении разовых и суммарных очаговых доз. Однако упор при томотерапии делается на гипофракционирование при РОД<2,5 Гр.

Схемы лекарственной терапии генерализованных форм рака кожи:

А) Цисплатин — 75 мг/м2 в/в 1й день
Доксолек – 50мг/м2 в/в 1й день

В) Цисплатин – 25мг/м2 в/в 1-5й дни
Метотрексат – 15мг/м2 в/в 1,8,15й дни
Блеомицин – 15мг в/в 1,3,5,8,10,12й дни

С) Этопозид – 100мг/м2 в/в 1-3й дни
Цисплатин – 100мг/м2 в/в 1й день
 

Химиопрепараты
Цисплатин-ЛЭНС	50мг 2-3фл
Доксолек	10мг, 50мг 5-10фл
Метотрексат	10мг, 15мг, 50мг, 500мг, 1000мг
Блеомицин	30мг
Этопозид	100мг
Висмодегиб (только при базально-клеточном раке)	150мг

Сопроводительная терапия с целью профилактики и лечения побочных эффектов лекарственной терапии представлено в приложении 1.

Дальнейшее ведение

Профилактика
Профилактика рака кожи заключается, прежде всего, в своевременном выявлении и активном лечении предраковых заболеваний, что требует онкологической настороженности у дерматологов и терапевтов.
При выявлении трансформации предракового дерматоза в рак дерматолог должен направить больного к онкологу, который будет решать вопрос о выборе тактики лечения.
Важная роль принадлежит санитарной пропаганде знаний среди населения о клинических проявлениях новообразования с тем, чтобы больные обращались к врачу в максимально ранние сроки при его возникновении.
Необходимо предупреждение населения о вредных последствиях инсоляции, особенно это касается блондинов со светлой кожей. О недопустимости воздействия УФИ должны быть предупреждены и больные ЗН кожи.
Нужно свести к минимуму применение лучевой терапии по поводу различных заболеваний кожи, в том числе базалиом, особенно у молодых лиц.
Важную роль в профилактике рака кожи играет соблюдение техники безопасности на производстве, где имеются канцерогенные вещества. Лица, занятые на таких производствах, должны подвергаться систематическим медосмотрам.  связи с частой ассоциацией ВПЧ16 и ВПЧ18 с плоскоклеточным раком половых органов, для профилактики генитального рака целесообразно проведение вирусологического обследования на наличие групп риска.
Так как одним из важнейших факторов возникновения карциномы является хроническое повреждение солнечными лучами, прежде всего следует уделить внимание защите от солнца. Важнейшие правила:
— при пребывании на свежем воздухе следует по возможности находиться в тени,
— особенно в солнечные дни следует носить непроницаемую для солнечных лучей одежду, в том числе шляпу с по возможности широкими полями, а также использовать солнцезащитные кремы,
— солнечное излучение наиболее сильно в обед, между 10 и 15 часами. Солнечные ванны в это время наиболее вредны,
— лучевое повреждение могут оказывать также и искусственные ультрафиолетовые лучи (солярии, сварочные работы, УФ-терапия по медицинским показаниям).

Эти правила особенно важны для детей. Кожа у них особенно чувствительна, и дети обычно не могут самостоятельно контролировать свое пребывание под открытым небом.

Также очень важны регулярные контроли у врача-дерматолога, особенно для пожилых людей и людей из групп риска (например, после трансплантации органов), а также для тех, у кого уже были раковые заболевания кожи либо предстадии. Это делает возможным распознание в ранних стадиях, облегчает лечение и улучшает прогноз.

У тех, у кого однажды была базальноклеточная карцинома, существенно повышен риск повторного возникновения новой опухоли. Повторное заболевание развивается примерно у каждого третьего пациента, причём в большинстве случаев новые опухоли образуются в течение ближайших трёх лет. Поэтому ежегодные врачебные контроли в виде клинического осмотра кожи рекомендуются как минимум в течение трёх лет после окончания лечения. Кроме того, пациентам рекомендуется самим внимательно следить за своей кожей и в подозрительных случаях обращаться к врачу.

Программа активного диспансерного наблюдения за больными БКР в условиях ПМСП

 

Выявленные больные после проведенного лечения находятся по поводу БКР под активным диспансерным наблюдением (ДО-11) с целью  раннего выявления рецидива и возможного лечения.
Целесообразно  наблюдать больных  без отягощающих факторов риска не болеем 3 лет. Этого срока наблюдения вполне достаточно для уточнения прогноза и выявления возможного рецидива заболевания. При этом осмотр проводится в первые 2года  4 раза в год, в 3- 1р в год.
Больных с первично-множественным  рецидивирующим раком рекомендуется брать на активное наблюдение сразу пожизненно. Это обусловлено тем, что у больных первично-множественными формами  заболевания число рецидивов в месте лечения опухоли было в 7,8 раза выше, чем у больных с единичной опухолью. Рецидивы  в месте удаления рака у больных  с единичной формой заболевания возникали на протяжении первых 3 лет наблюдения, а с множественной – на 3-5-м годах. В этой группе больных  проводится углубленная ежегодная диспансеризация, направленная на раннее выявление онкологических заболеваний различной локализации.
Пациенты, получившие лечение по поводу плоскоклеточного, метатипического рака и придатков кожи рекомендуется проводить реабилитацию, ориентируясь на общие принципы реабилитации пациентов после проведенных хирургических вмешательств и/или химиотерапии.

Диспансерное наблюдение за излеченными больными:
Рекомендуется соблюдать следующую периодичность и методы наблюдения после завершения лечения по поводу рака кожи: 
В первые 1-2 года физикальный осмотр и сбор жалоб рекомендуется проводить 1 раз в 3 месяца, на на 3 год — 1 раз в 6 месяцев, с 4 года – 1 раз в год или чаще при появлении жалоб. У пациентов с высоким риском рецидива перерыв между обследованиями может быть сокращен. 
Объем обследования: 
1. Анамнез, локальный осмотр  и физикальное обследование  
2. УЗИ периферических лимфоузлов, органов брюшной полости и малого таза 1 раз в 3 месяца 1-2 года, 1 раз в 6 месяцев 3 год, 1 раз в год с 4-года наблюдения. 
3. Рентгенография органов грудной клетки 1 раз в 3 месяца 1-2 года, 1 раз в 6 месяцев 3 год, 1 раз в год с 4-года наблюдения.  
Задачей наблюдения является раннее выявление прогрессирования заболевания с целью раннего начала химиотерапии или хирургического лечения резектабельных метастатических очагов, рецидивных опухолей, а также выявление метахронных опухолей. 
 
ИНДИКАТОРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ И БЕЗОПАСНОСТИ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ, ОПИСАННЫХ В ПРОТОКОЛЕ
•        Объективные признаки отсутствия опухоли, регрессии опухоли, мтс
•        УЗИ данные об отсутствии мтс и рецидива
•        Рентген данные об отсутствии отдаленных мтс
•        Удовлетворительные показатели крови, мочи, биохимии
•        Заживление послеоперационной раны
•        Относительно удовлетворительное состояние больного (-ой)  

Результаты биопсии — Онкология — 4.02.2019

Здравствуйте! Давайте начнем с расшифровки — «рТ1 ICD-O code 8071/3 Код по МКБ — 10 C44.6». ICD-O — International Classification of Diseases for Oncology (международная классификация онкологических болезней, МКБ-О), в рамках которой есть кодированная номенклатура морфологии новообразований. Так вот в этой номенклатуре код 8071/3 означает плоскоклеточный рак ороговевающий БДУ (БДУ — без дополнительных уточнений). Далее у нас идет просто МКБ — 10 (международная классификация болезней — нынче уже 10-го пересмотра), в рамках которой код С44,6 означает ЗНО кожи верхней конечности, включая область плечевого пояса (ЗНО — злокачественное новообразование). То есть тут закодировано в международном формате то, что уже написано в заключении ранее — «высокодифференцированная плоскоклеточная карцинома», правда, с уточнением, что болезнь локализуется на плече. Нам важно, конечно, знать морфологию, что это плоскоклеточный рак, а не базальноклеточный, не меланома, не рак придатков кожи типа злокачественной поромы, злокачественной сирингомы и т.д. Но столь же важная, если даже не более, информация о стадии болезни. Она шифруется по международной классификации TNM (Tumor Nodulus Metasnasis). У нас есть лишь рТ1, где Т это Tumor — характеристика первичной опухоли, а «р» означает послеоперационное заключение. рТ1 соответствует 1 стадии, правда, при условии, что значения N и М (наличие метастазов в узлах (nodulus) и отдаленных метастазов) равны нулю. У Вас, скорее всего, даже и не подозревали, что окажется рак, либо вероятность этого сичтали очень низкой, поэтому на значение N и М просто не проверяли. Ну а теперь, когда мы все расшифровали, становится предельно понятной и дальнейшая тактика. Первое — дообследование, чтобы убедиться, что N и М равны нулю (pT1N0M0). Тогда стадия остается первой, а с учетом того, что (цитирую) «Опухоль удалена в пределах здоровых тканей. Край резекции представлен жировой клетчаткой» никакого дополнительного лечения не требуется, но нужно внесение информации в канцеррегистр, постановка на учет в онкодиспансере и дальнейшая там диспансеризация по стандартной схеме. Ну, если N и М вдруг не равны нулю, то это все значительно меняет, но это уже другая тема. Будем надеяться, что у вас ничего не добавиться к первичной опухоли. Что касается вопроса «Бегом бежать к онкологу? Какие дальнейшие действия» — да, нужно двигаться к онкологу и в онкодиспансер, но не бегом, конечно, спокойным шагом.

(PDF) Иммунологическая реакция при кератоакантоме, спонтанно разрешающейся опухоли кожи

Форрест К. Браун и Е. М. Тан

, проиллюстрированная на рис. 2A (пациент D. E.). Это была область

, показывающая разрушение архитектуры эпидермиса, начиная с

некроза отдельных клеток кератоакантомы и инфильтрации

несколькими мононуклеарными клетками. Окрашивание на IgG было более сильным

в этих областях, чем в тех, которые проиллюстрированы на рис. 1а. В этих

регионах некроза клеток ранней кератоакантомы (рис.2a),

Окрашивание IgG могло наблюдаться в отдельных областях, чтобы иметь

линейную, круглую или многоугольную форму, но в основном

бугорчатый характер. Смежные инвагинации здорового вида

клеток Ka (отмеченные звездочкой) не окрашивались на IgG. Срез аджы

центов был окрашен гематоксилином и эозином (фиг.

2b), и гистологические характеристики клеточной дезинтеграции

были очевидны в области на фиг. 2а, которая окрашивала

для IgG.Поглощение конъюгата aIgG с IgG привело к исчезновению окрашивания

в соседнем отделе этой опухоли

(рис. 2c).

Фиксация опухоли in vivo 1 гМ и С3, показанная в таблице 1

присутствовала только в опухолевой ткани, которая показала фиксацию

IgG и была локализована в кератоакантоме у паттернов

, описанных для IgG. IgA не было обнаружено ни в одной из

биоптатов. Не было окрашивания на IgG, 1 гМ или C3 в

ядрах или цитоплазме клеток.

Фиг. 3a и 3b были биопсии от 2 разных пациентов

, окрашенные античеловеческим фибриноген-фибрином, и представляли

, представляющих наиболее положительные срезы. Окрашивание на фибриноген

фибрин обычно было довольно сильным, и отложения явно составляли

в дерме, но близко к краям акантотических выступов

опухолевой ткани. Не было обнаружено распространения окрашивания фибриноген-фибрином

в межклеточные пространства опухоли, моделирующего окраску

краев клеток. Окрашивание на фибриноген

фибрин не было связано ни с отложением иммуноглобулина

, ни с придатковой структурой, такой как потовые железы.

ОБСУЖДЕНИЕ

Многие новообразования человека обладают опухолеспецифическими антигенами

, которые способны вызывать иммунные ответы у их

хозяев. Было показано, что они включают опосредованные клетками цито

токсические реакции и гуморальные ответы, состоящие из цито

токсичных и опсонизирующих сывороточных антител (2, 3, 7, 8, 9).В опухолях cer

tam, таких как злокачественная меланома и цинома толстой кишки

, иммунофлуоресцентные исследования показали, что гуморальные антитела направлены против антигенных детерминант

на мембранах опухолевых клеток (6, 11). В нынешнем исследовании

ряд особенностей может быть связан с находкой

предыдущих исследователей. Характер in vivo локализации

иммуноглобулинов в ткани кератоакантомы

может быть связан с реакцией с мембранами опухолевых клеток, поскольку

IgG и 1 мкМ явно присутствовали в межклеточных пространствах

опухолей. Одновременное обнаружение C3 компонента

комплемента в большинстве опухолей, окрашенных на IgG и

1 гМ, подтверждает вероятность реакций антиген-антитело

, происходящих на этих участках с фиксацией или активацией комплемента

.

Другой особенностью было наблюдение, что фиксация IgG на

мембранах опухолевых клеток или межклеточных пространствах происходила при

в пределах переднего края опухолей в областях, близких

к дерме и часто прилегающих к микроабсцессам.

Фиксация IgG с комплементом в этих сайтах

может способствовать разрушению опухолевых клеток с продвигающегося края.

Такая возможность не исключает участия клеточных

опосредованных иммунных реакций. Николау и др. !. (13) показали

, что пациенты с кератоакантомой демонстрировали отсроченные кожные реакции типа

на прививку клеток кератоакантомы

и Nairn el a !. (12) показали как гуморальную анти-

-опосредованную телом, так и опосредованную лимфоцитами цитотоксичность

по отношению к опухолевым клеткам при раке кожи. Нам не удалось продемонстрировать стратегическую реакцию

с срезами опухолевых клеток с использованием сывороток kerato

acanthoma в непрямой иммунофлуоресцентной технологии

nique. Однако мы не разделили опухолевые клетки, и

заставили их реагировать в суспензии с сывороткой, как это было сделано

Nairn.

Фибриноген или фибрин были зафиксированы в тканях дермы, близко

к краям некоторых акантотических выступов опухоли, но

не проникал в межклеточные пространства самой опухолевой ткани

.Не было обнаружено морфологической связи между отложениями фибрина

и участками, показывающими фиксацию IgG, 1 мкМ или C3

.

Кератоакантома может рассматриваться как пример

«эксперимента природы» (5) и предоставляет уникальную возможность для изучения механизмов регулирования новообразования, которое

разрастается, а затем спонтанно регрессирует

и разрешается. . Текущие исследования предполагают, что часть объяснения

спонтанной регрессии может быть связана с

vivo реакцией антител и комплемента с мембранами опухолевых клеток

.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

И. Бендл, Б., и Грам, Дж. Х. Новые концепции происхождения плоскоклеточного рака

Клеточные карциномы кожи. Proc. Natl. Cancer Conf., 6: 471-481,

1970.

2. Bubenik, J., Perlmann, P., Helmstein, K., and Moberger, G. Cellular

и гуморальные иммунные ответы на мочевой пузырь человека.

цином. Междунар. J. Cancer, 5: 310-319, 1970.

3. Дибл, В., Джереб, Б., Стьернсвард, Дж., О’Тул, К., и Ахстром, Л.

Клеточный иммунитет к нефробластоме. Междунар. J. Cancer, 7: 277-284,

1971.

4. Фроммхаген Л. Х. Растворимость и другие физико-химические свойства

эртис человеческого γ-глобулина, меченного изотиоцианатом флуоресцеина.

J. lmmunol., 95: 442-445, 1965.

5. Габриэльсен, А. Э., Купер, М. Д., Петерсон, Р. Д. А., и Гуд,

,

Р. А. Заболевания, связанные с первичным иммунологическим дефицитом. В: P. A.

Miescher and H. J. Mller-Eberhard (ред.), Учебник иммуно-патологии

, Вып. 2. С. 385-405. Нью-Йорк: Грюн и Страттон, 1969.

6. Голд П., Голд М. и Фридман С. 0. Клеточное расположение автомобиля

Киноэмбриональные антигены пищеварительной системы человека. Рак

Res., 28: 1331-1333,1968.

7. Хеллстрем, И., Хеллстрем, К. Э., Пис, Г. Э. и Янг, Дж. П. 5. Cellu

и гуморальный иммунитет к различным типам новообразований человека.

Nature, 220: 1352-1354, 1968.

8. Джагарламуди, С. М., Ост, Дж. К., Тью, Р. Х., и Маккханн, К. Ф.

Обнаружение цитотоксического клеточного иммунитета против опухоли in vitro.

Специфические антигены с помощью радиоизотопного метода. Proc. Natl. Акад. Sci.

США, 68: 1346-1350, 1971.

9. Кляйн, Г. Иммунологические исследования опухолей человека. Дилеммы

Экспериментатор. Israel J. Med. Sci., 7: 111-131, 1971.

10. Lever, W.F. Гистопатология кожи, под ред. 4. С. 514-517.Phila

delphia: JB Lippincott Co., 1967.

11. Lewis, MG. Ikonopisov, RL, Nairn, RC, Phillips, TM,

Fairley, GH, Bodenham, DC, and Alexander, P.

2032 ИССЛЕДОВАНИЕ РАКА, ТОМ. 33

Американская ассоциация исследований рака Авторские права © 1973, 11 июля 2011 г. cancerres.aacrjournals.orgЗагружено с

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Характеристика новой спонтанно иммортализованной и инвазивно растущей линии кератиноцитов кожи человека HaSKpw

Развитие клеточной линии HaSKpw

Первичные кератиноциты были выделены из полной толщины кожи взрослого человека и помещены с высокой плотностью клеток на питающий слой, как описано в разделе «Материалы». и методы.Первый проход достиг 90% слияния через 8 дней. После пассажа 8 клетки постоянно замораживали и хранили. Клетки были успешно пассированы с использованием стандартного протокола субкультивирования ЭДТА / трипсин (0,05% / 0,4%). Эти клетки продолжали расти, не проявляя признаков задержки роста или даже не вступая в клеточный кризис, что свидетельствует о раннем приобретении неограниченного потенциала роста. Во время последующего пассирования кератиноциты становились независимыми от питающей опоры и с этого момента культивировались в среде FAD с 10% FCS в соотношении деления 1:10.Поскольку клетки HaSKpw представляли генетически нестабильную массовую популяцию, вероятно, состоящую из ряда субпопуляций, клетки были клонированы на этапе 22, при этом клон номер 7 (HaSkpwC7) далее размножался и использовался в предстоящих экспериментах.

Для определения идентичности / уникальности этой вновь созданной линии кератиноцитов кожи были созданы профили коротких тандемных повторов (STR) из пассажа 1, 7 и 33, последний представляет клетки HaSKpwC7. Полученный STR-профиль оказался уникальным и имеет человеческое происхождение и не соответствует ни одной из следующих баз данных: ATCC (США), HPACC (Великобритания), JCRB (Япония), RIKEN (Япония), KCLB (Корея) и DSMZ (Германия). ).Профиль приведен в таблице 1 вместе с профилем STR спонтанно иммортализованной линии кератиноцитов человека HaCaT. Новая клеточная линия оказалась отрицательной на гепатиты B и C, ВИЧ 1 и 2, а также на микоплазму. Клеточная линия была названа HaSKpw, что указывает на ее происхождение; взрослый человек спонтанно иммортализовал кератиноциты, p 53 w ild t ype (см. ниже).

Таблица 1 STR-профиль (с различным специфическим для человека генетическим сайтом) клеточных линий HaSKpwC7 и HaCaT.

Клетки HaSKpw демонстрируют повышенную теломеразную активность и стабильную длину теломер

Теломеразная активность, и с этой остановкой, зависящая от пролиферации потеря теломер является важным механизмом выживания, т. е. имеет важное значение для бессмертия ¹³ . Клетки HaCaT, которые развивались в результате выживания одного клона, проявляли высокий уровень теломеразной активности при первом анализе при втором пассаже ¹⁴ . Таким образом, повышающая регуляция активности теломеразы, вероятно, была первоначальным событием, позволившим клеткам выжить в этой моноклональной популяции.Клеточная линия HaSKpw развивалась во время последующего размножения основной массы без какого-либо очевидного кризиса. Следовательно, это может означать, что иммортализация была не редким событием для отдельной клетки, а скорее из-за внутренней предрасположенности всей клеточной популяции. Ранее мы показали, что нормальные кератиноциты кожи человека (NHEK) являются теломеразоположительными in vivo, но что теломераза подавляется во время пассирования in vitro ¹⁵ . Выполняя анализ TRAP (протокол амплификации теломерных повторов), мы теперь показываем статус активности теломеразы в различных пассажах клеток HaSKpw (рис. 1А). В соответствии с нашими предыдущими результатами на NHEK, также клетки HaSKpw показали лишь небольшую активность теломеразы во время первых 4 пассажей. Однако на пятом пассаже активность теломеразы увеличивалась, достигая максимума вокруг пассажа 10. Однако по сравнению с клетками HaCaT уровень активности теломеразы оставался сниженным (примерно на 10%) и в более поздних пассажах HaSKpw, а также в клетках HaSKpwC7 ( Рис. 1А).

Рисунок 1

Кератиноциты HaSKpw активируют теломеразу во время иммортализации.( A ) Анализ TRAP от различных пассажей клеток HaSKpw во время процесса иммортализации. Видно постепенное увеличение активности теломеразы с увеличением числа пассажей (1, 3, 4, 5, 15, 16 и 19). Клетки HaCaT в разведении 1:10 добавляли в качестве положительного контроля и добавляли обработанный РНКазой лизат HaCaT (C), NHDF (F) и буфер для лизиса (L) в качестве отрицательного контроля. IC внутреннего контроля. ( B ) Теломеразная активность зависит от наличия полноразмерного варианта сплайсинга hTERT. Анализ экспрессированных вариантов сплайсинга hTERT в кератиноцитах HaSKpw во время иммортализации. Варианты сплайсинга идентифицировали с использованием кДНК, полученной из клеточной линии на указанных пассажах. Праймеры амплифицируют либо полноразмерную, либо α- или β-изоформу hTERT. Затем фрагменты идентифицировали на 2% агарозном геле. Маркер (M), числа обозначают пассажи клеток HaSKpw во время иммортализации. Начиная с пассажа 9 и далее становится обнаруживаемым вариант сплайсинга полной длины (457 п.н.). GAPDH использовали в качестве контроля загрузки.( C ) Длину теломер измеряли для клеток HaSKpwC7 на пассажах 7, 12 и 17 и сравнивали с клетками HaCaT пассажей 35, 40 и 45. Длину теломер измеряли в трех биологических повторностях с тремя техническими повторностями для каждой точки измерения. . Линии обозначают медианное значение, ячейки от 25 до 75 процентилей, а усы — от 5 до 95 процентилей. Длина теломер стабильна при субкультивировании. Значимость рассчитывалась с помощью теста Anova и апостериорного теста Тьюки; *** р <0. 001.

Один из механизмов регулирования hTERT — альтернативное сращивание ¹⁶ . Помимо единственного функционального полноразмерного транскрипта, ген hTERT демонстрирует ряд вариантов сплайсинга с формой α-сплайсинга, демонстрирующей доминантно-отрицательный эффект на активность теломеразы, и формой β-сплайсинга, конкурирующей с полноразмерным hTERT за связывание с hTR, и что способ подавления активности теломеразы. В то время как нормальные клетки преимущественно экспрессируют супрессивные варианты hTERT, переключение сплайсинга на полноразмерный активный транскрипт было описано как характерное для рака ¹⁷ .При исследовании различных пассажей клеток HaSKpw с помощью ОТ-ПЦР клетки HaSKpw раннего пассажа, если вообще экспрессировали ß-вариант сплайсинга. Начиная с прохода 9 и далее, профиль сращивания с полной длиной (fl), α-, α / ß- и ß-формой сращивания был виден с заметным fl hTERT, стабилизирующимся вокруг прохода 12. (Рис. 1B). В совокупности это показывает, что переключение на стабильный «высокий» уровень теломеразной активности произошло во время пассажа массовой популяции между пассажами 9 и 12, что неоднократно подтверждалось, и есть соблазн предположить, что это было связано или даже было причиной достижения неограниченного роста, т. е.е. увековечение.

В клетках HaCaT теломераза поддерживает постоянную длину теломер ~ 3 т.п.н. также на протяжении длительного пассирования. Чтобы определить, будет ли более низкая теломеразная активность клеток HaSKpw также достаточна для стабилизации, длина теломер была исследована для клеток HaSKpwC7 и HaCaT с помощью кПЦР с интервалами пассажа 5. Количественная оценка показала, что средняя длина теломер составляет 4,3 ± 0,12 т.п.н. для HaSKpwC7 и 3,0 ±. 0,20 т.п.н. для клеток HaCaT соответственно. Это продемонстрировало, что клетки HaSKpwC7 и HaCaT незначительно различаются по длине теломер.Важно отметить, что длина отдельных теломер сохранялась неизменной при непрерывном размножении, тем самым подтверждая достаточную функциональную теломеразу также для клеток HaSKpwC7.

Клетки HaSKpw гиподиплоидны с несколькими сложными транслокациями

Активность теломеразы, как предполагается, важна для стабильности генома. Соответственно, клетки HaCaT с их высокой теломеразной активностью показали довольно стабильную комбинацию генотипов / хромосом с отдельными маркерами хромосом, характеризующих клеточную линию, также во время длительного культивирования ^11,18,19 . Примечательно, что в то время как клетки HaCaT быстро становились гипотетраплоидными, цитогенетический анализ клеток HaSKpw продемонстрировал довольно стабильный псевдодиплоидный кариотип (рис. 2A, C). Полиплоидизация произошла лишь позже в субпопуляции, которая так и не достигла доминирования. Анализ M-FISH клеток HaSKpw на пассаже 22 выявил несколько доминантных аберраций. Большинство метафаз содержали 3 маркерные хромосомы t (3; 20), i (8q) и i (15q). Кроме того, каждая метафаза содержала до 12 дополнительных хромосомных аберраций со многими сложными транслокациями, содержащими от 2 до 6 частей и часто затрагивающими хромосому 20 (рис.2А, Б). На более поздних пассажах (≥ 30 пассажа) появилась новая маркерная хромосома (t (14; 20)), в то время как частота дополнительных сложных перестроенных хромосом была снижена.

Рисунок 2

Эволюция кариотипа во время генерации клеточной линии HaSKpw. ( A ) Генетическое развитие схематично представлено, и M-FISH-анализ был выполнен с клетками HaSKpw на разных уровнях пассажа. Выделены: ( A ) репрезентативный кариотип клеток HaSKpw на пассаже 22, время клонирования клеток, а также ( B ) примеры транслокационных хромосом клеток HaSKpw, несущих дополнительные части хромосомы 20.Выделены также: ( C ) репрезентативный кариотип клеток HaSKpwC7 и ( D ) примеры транслокационных хромосом клеток HaSKpwC7, повторно гибридизированных с зондом PNA для окрашивания теломер. Обратите внимание на внутрихромосомные теломеры, вероятно происходящие из хромосомы 20. ( E ) Частотный анализ распространения метафаз из клеток HaSKpwC7 (пассаж 8-13) и клеток HaCaT (пассаж 36-41), что указывает на среднее число хромосом 42 и 74 соответственно.

В надежде на генетически более стабильную субпопуляцию, клетки HaSKpw были клонированы на 22-м пассаже, а клетки HaSKpwC7 были дополнительно исследованы.Помимо исходных маркерных хромосом, эти клетки показали новые маркеры (t (9; 20; 11; 20), t (5; 8), t (7; 11) и t (14;?) (Рис. 2C) как а также многие часто очень сложные транслокационные хромосомы (до 8 хромосомных частей) (рис. 2D). Дополнительное окрашивание теломер продемонстрировало наличие частых внутрихромосомных теломер с высокой ассоциацией хромосомы 20, что позволяет предположить, что большинство внутрихромосомных теломер в этих сложных хромосомных перестройках произошли от крайне нестабильной хромосомы 20 (рис.2D). Обратите внимание, что также клетки HaSKpwC7 оказались гиподиплоидными со средним числом хромосом 42 (рис. 2E). Вместе это демонстрирует, что, несмотря на отчетливую геномную нестабильность, клетки HaSKpwC7 остаются псевдодиплоидными, что противоречит клеткам HaCaT, и свидетельствует о различных генетических регуляторных сигналах, характеризующих эти две клеточные линии.

Клетки HaSKpw имеют один функциональный аллель p53 дикого типа

Одной из характеристик раковых клеток кожи являются УФ-зависимые мутации гена p53 ^12,20 .В соответствии с этими наблюдениями, клетки HaCaT обнаруживают УФ-индикативные мутации в обоих аллелях гена p53, и эти мутации присутствовали уже в самых ранних пассажах, что указывает на спектр приобретенных in vivo мутаций ²¹ . Для определения статуса p53 клеток HaSKpw кодирующую часть геномного локуса p53 клеток HaSKpwC7 амплифицировали и пять ампликонов секвенировали с помощью «секвенирования по Сэнгеру» (рис. 3). Кроме того, последовательность мРНК, кодирующая p53 клеток HaCaT и HaSKpwC7, была клонирована и секвенирована.Таким образом, мы смогли подтвердить две УФ-индикативные мутации p53 для клеток HaCaT. Для клеток HaSKpwC7 анализ последовательности мРНК p53 не выявил мутаций. Однако, помимо одного аллеля с последовательностью р53 дикого типа, клетки HaSKpwC7 проявляли гетерозиготный полиморфизм в положении кДНК 1151 (Q328 → *; dbSNP: rs764735889). Этот полиморфизм стоп-кодонов приводит к усеченному и неоперабельному белку приблизительно 34,8 кДа (фиг. S1). Кроме того, гомозиготный полиморфизм (417C → G; R72 → P; dbSNP: rs1042522), присутствующий примерно у 35% человеческой популяции, был обнаружен в HaSKpwC7, а также в клетках HaCaT (рис.3 и дополнительный рис. S1). Этот полиморфизм расположен в богатом пролином домене p53 и, как полагают, коррелирует со снижением апоптоза и связан с повышенным риском рака ²² .

Рисунок 3

Анализ локуса p53 в клетках HaSKpw. Локус гена p53, расположенный на хромосоме 17, секвенировали по 5 перекрывающимся ампликонам ( A ), охватывающим экзоны 2–11 и включающим большинство последовательностей интронов. ( B ) Секвенирование мРНК p53 выявило гомозиготный полиморфизм C – G в положении 417 нуклеотида и гетерозиготный полиморфизм в положении 1151 нуклеотида от C к T, что приводит к усеченной версии p53.Анализ проводился с клетками HaSKpwC7 (пассаж 10) и HaCaT (пассаж 39) соответственно.

Эти данные показывают, что, хотя клетки HaCaT представляют собой кератиноциты с мутантным и, следовательно, дисфункциональным p53, клетки HaSKpwC7 экспрессируют wt p53 и представляют кератиноциты с функциональным белком p53.

Клетки HaSKpwC7 и HaCaT схожи по своим пролиферативным свойствам, но различаются по времени удвоения популяции

В качестве первого шага к пониманию биологического поведения клеток HaSKpwC7 мы изучили их характеристики роста в сравнении с клетками HaCaT. Наши результаты демонстрируют, что как HaSKpw, так и HaCaT показывают лаг-фазу приблизительно 48 часов, в то время как во время фазы экспоненциального роста линия клеток HaCaT показывает более быстрый рост клеток со временем удвоения популяции 28,0 часа по сравнению с рассчитанным временем удвоения популяции 43,4 часа. для клеток HaSKpwC7 (рис. 4А). Чтобы понять эту разницу более подробно, мы проанализировали распределение клеточного цикла экспоненциально растущих культур с помощью проточной цитометрии. Измерение содержания ДНК путем количественного окрашивания ДНК с использованием йодида пропидия (рис.4B), мы не смогли обнаружить значительных различий в профилях клеточного цикла клеток HaCaT и HaSKpwC7 (рис. 4C). В то время как клетки HaCaT показали более выраженную S-фазу на гистограмме, клетки HaSKpwC7 показали более выраженный пик G2. Этот анализ также подтвердил больший размер генома клеток HaCaT по сравнению с клетками HaSKpwC7. Судя по интенсивности пика G1, клетки HaCaT имеют геном примерно в 1,45 раза больше, чем клетки HaSKpwC7 (рис. 4B) (что хорошо отражает гипотетраплоидное и псевдодиплоидное состояние клеток HaCaT и HaSKpwC7, соответственно, ( также рис.2).

Рисунок 4

Характеристики роста клеток HaCaT и HaSKpwC7. ( A ) Кривая роста клеток HaCaT и HaSKpwC7. Клетки подсчитывали и нормализовали. Точки представляют собой средние значения трех повторений трех независимых экспериментов, а полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение. ( B ) Распределение клеточного цикла для обеих клеточных линий. В то время как клетки HaSKpwC7 демонстрируют близкий к диплоидному размеру геном, клетки HaCaT демонстрируют 1,4-кратное увеличение размера генома без существенных различий в распределении фаз клеточного цикла.( C ) Изображения клеток с положительной фазой S, идентифицированных с помощью импульсной маркировки EdU (зеленый), для клеток HaCaT (вверху) и клеток HaSKpwC7 (внизу). Количественное определение положительных по S-фазе клеток в обеих клеточных линиях, составленное для каждой клеточной линии из трех независимых биологических повторов (средние значения и стандартное отклонение). ( D ) Изображение клеток HaCaT (вверху) и клеток HaSKpwC7 (внизу), окрашенных анти-h4S10p (красный) для идентификации митотических клеток. Количественная оценка митотических фракций основана на размере клеток и средней интенсивности h4S10p, собранных из двух биологических повторов (среднее значение и стандартное отклонение).Все анализы были выполнены с клетками HaSKpwC7 пассажа 9–14 и клетками HaCaT пассажа 37–43.

Чтобы получить более полное представление о распределении клеточного цикла, мы выполнили импульсное мечение обеих клеточных линий с использованием импульсов EdU (5-этинил-2′-дезоксиуридин) в течение 30 минут для идентификации клеток в S-фазе. Впоследствии клетки окрашивали с использованием химии Click-IT и анализировали с использованием визуализации с высоким содержанием. На рисунке 4С показаны клетки HaCaT и HaSKpwC7, где отмеченные зеленым цветом клетки представляют клетки в S-фазе.Впоследствии клетки стробировали для получения высокой интенсивности сигнала EdU и уровней DAPI ниже пика G2, чтобы исключить клетки, которые покинули S-фазу и перешли в G2. Количественное сравнение двух клеточных линий выявило незначительную разницу с 32% клеток в S-фазе для HaCaT и 26% для клеток HaSKpwC7 соответственно. Затем мы сосредоточились на подробном анализе митотических клеток, где мы использовали антитело, специфичное для фосфорилирования h4S10 (гистон h4 серин 10). Экспоненциально растущие клетки окрашивали антителом против h4S10p (рис.4D). Визуализация высокого содержания идентифицировала митотические клетки по их маленьким размерам ядер (<100 мкм ² ) в сочетании с их высокими уровнями h4S10p. Мы обнаружили более высокую долю митотических клеток для клеток HaCaT (5,6 ± 2,2%) по сравнению с клетками HaSKpwC7 (4,7 ± 1,5%) (рис. 4D), хотя и без статистической значимости.

Таким образом, хотя клетки HaSKpwC7 демонстрируют значительно увеличенное время удвоения популяции по сравнению с клетками HaCaT, две линии клеток кератиноцитов человека не показывают значительных различий в профиле клеточного цикла, распределении S-фазы или митотическом индексе.

HaSKpwC7 и HaCaT имеют сравнимую эффективность посева, но различаются по плотности клеток и подвижности клеток, что отражено их десмосомными связями.

Затем мы изучили способность клеток HaSKpwC7 производить потомство, выполнив тест эффективности посева. Посев 500 клеток либо в обычные чашки для культивирования клеток, либо в чашки, покрытые поли-L-лизином, клеткам HaSKpwC7 и HaCaT давали возможность вырасти в колонии в течение 10 дней, прежде чем они были окрашены и подсчитаны. На рис. 5А показан профиль покрытия клеток HaSKpwC7 и HaCaT при различных условиях покрытия.Эффективность посева для обеих клеточных линий на обоих субстратах составляла от 20 до 30% (фиг. 5B) без статистически значимых различий между клеточными линиями и субстратами. Колонии HaCaT оказались более компактными по сравнению с колониями HaSKpwC7. Количественная оценка показывает значительно больше клеток на мм ² в колониях HaCaT по сравнению с колониями HaSKpwC7. Интересно, что покрытие из поли-1-лизина снижает плотность клеток в колониях HaCaT, но не в колониях HaSKpwC7 (рис. 5D), демонстрируя, что субстрат определяет закрепление тесно связанных между собой клеток HaCaT, но, по-видимому, несущественно для менее тесно связанные между собой клетки HaSKpwC7.

Рисунок 5

Эффективность посева и образование колоний: ( A ) Клетки HaCaT и HaSKpwC7 высевали на обычные или покрытые поли-L-лизином чашки для культивирования клеток, выращивали в течение 10 дней и колонии окрашивали метиленовым синим. ( B ) Количественная оценка эффективности посева для трех биологических повторов (среднее и стандартное отклонение) не показывает существенных различий. ( C ) Морфологические различия колоний, образованных клетками HaCaT и HaSKpwC7 в увеличенных областях колоний.Несмотря на некоторую неоднородность плотности клеток, особенно для клеток HaCaT при посеве на разные субстраты, морфология клеток HaSKpwC7 сильно варьируется, при этом более крупные клетки образуют менее плотные колонии клеток. ( D ) Для количественной оценки плотности клеток было проанализировано 30 случайно выбранных полей для каждого условия и подсчитано количество клеток (на мм ² ). На обоих субстратах клетки HaCaT показывают значительно более высокую плотность клеток по сравнению с клетками HaSKpwC7, хотя покрытие поли-1-лизином вызывало значительное снижение плотности клеток в колониях HaCaT.Статистическая значимость была проверена с помощью теста ANOVA, включая пост-тест Бонферрони, на уровне значимости p = 0,05. ( E ) Иммунофлуоресцентное обнаружение компонентов десмосом в клетках HaCaT и HaSKpwC7. Пять различных компонентов десмосом были количественно определены с использованием иммунофлуоресцентного обнаружения в сочетании с скринингом высокого содержания. Верхний ряд показывает результаты окрашивания на десмоглеин 1–4, а также на десмоплакин в клетках HaCaT, а нижний ряд показывает соответствующие окрашивания в клетках HaSKpwC7.Обратите внимание, что время экспозиции для Desmoglein 1 было в три раза выше, чем для других окрашиваний. Все изображения представлены с одинаковыми справочными таблицами для одного и того же окрашивания. ( F ) Количественная оценка десмосом с помощью анализа изображений с высоким содержанием. В то время как десмоглеин 1 едва обнаруживается и немного выше в клетках HaSKpwC7, все другие протестированные уровни десмоглеина и десмоплакина значительно выше в клетках HaCaT (*** p <0,0001, критерий суммы рангов Вилкоксона). Все анализы были выполнены с клетками HaSKpwC7 пассажей 9-14 и клетками HaCaT пассажей 37-43.

Одним из наиболее важных межклеточных адгезионных соединений для кератиноцитов являются десмосомы (например, Ref. ²³ ). Поэтому мы стремились определить роль десмосом в разной «компактности» клеток HaCaT и HaSKpwC7. Основными компонентами этого комплекса белков клеточного соединения являются десмоглеин (Dsg) и десмоплакин (Dsp) ²⁴ . Поскольку концентрация Ca ²⁺ имеет решающее значение для образования десмосом, мы инкубировали обе клеточные линии в равной концентрации 1.4 мМ Ca ²⁺ в течение 48 часов перед тем, как количество десмосомных белков оценивали с помощью количественной иммунофлуоресценции. В то время как Dsg1 едва обнаруживался в обеих клеточных линиях (рис. 5E, F), Dsg2, Dsg3 и Dsg4 экспрессировались обеими клеточными линиями, хотя уровни сигнала были выше в HaCaT по сравнению с клетками HaSKpwC7, причем Dsg3 был самым сильным и показывал типичный паттерны десмосом (рис. 5E, средний верхний ряд). Напротив, Dsg4 обычно экспрессируется на более высоких уровнях только в частично стратифицированных клетках HaCaT ²⁵ .Подобно Dsg3, десмоплакин 1 и 2 был обнаружен в клетках HaSKpwC7 на значительно более низком уровне. В клетках HaSKpwC7 количество десмосомных белков сильно снижается при перинуклеарном окрашивании на Dsg2. Это хорошо соответствует тому, что наблюдается в cSCC, в частности, также в акантолитических опухолях ^26,27 . Мембранно-специфический паттерн десмосом наблюдали только в культурах HaCaT. Вместе это убедительно свидетельствует о том, что присутствие десмосомных белков сильно снижается в клетках HaSKpwC7 и, таким образом, хорошо коррелирует с ограниченным межклеточным прикреплением, характерным для клеток HaSKpwC7.

Различие в прикреплении и межклеточном соединении побудило нас провести дальнейший анализ подвижности клеток HaSKpwC7 и HaCaT с помощью анализа ненаправленной подвижности. Живые клетки окрашивали красителем SiR-ДНК далеко красных живых клеток и снимали изображения с 15-минутными интервалами в течение нескольких дней. Ячейки были разделены на категории «с соседом» (+) или «без соседа» (-) в зависимости от присутствия другой ячейки в радиусе 35 мкм (рис. 6A). Затем в рамках этих категорий отслеживалось общее пройденное расстояние отдельных ячеек.Анализы показали, что только 20% клеток HaSKpwC7 имели «соседа» клетки в пределах диаметра 35 мкм по сравнению с 80% в культурах HaCaT, подтверждая прочное межклеточное прикрепление клеток HaCaT и снижение контактов клеток HaSKpwC7.

Рисунок 6

Анализ миграции клеток и заживление царапин: ( A ) Отслеживание движения клеток HaCaT и HaSKpwC7 с (+) и без (-) соседних клеток в радиусе 35 мкм. Изображены клетки и соответствующие им дорожки движения в течение 18 часов (72 кадра, желтые линии) через 36 часов.( B ) Коробчатая диаграмма скорости клеток HaCaT и HaSKpwC7 (n> 25 треков) с соседними клетками и без них, указано в мкм / мин). Скорость рассчитывалась исходя из общего расстояния, которое каждая ячейка преодолела за 36-часовой эксперимент. ( C ) Изображения скретч-анализов, выполненных на конфлюэнтных клетках HaCaT и HaSKpwC7, инкубированных в среде, содержащей митомицин C (10 мкМ). Царапины вставлялись, и изображения делались с 30-минутными интервалами с помощью 20-кратного воздушного объектива. Измеренные области отмечены красным для клеток HaSKpwC7 и синим для клеток HaCaT.( D ) Примеры графиков для зависимого от времени уменьшения относительного размера царапин обработанных или необработанных митомицином C (пунктирные линии) клеток с их соответствующей линейной регрессией (сплошные линии), рассчитанной только для линейных частей графика. ( E ) Коробчатая диаграмма скорости закрытия царапины, рассчитанная на основе линейных регрессий каждого анализа закрытия царапины (n> 6). Скорость указана в мкм / мин. ( F ) Камерный анализ Бойдена с использованием дермальных фибробластов в качестве хемоаттрактанта в нижней камере.Клетки HaCaT и HaSKpwC7 высевали поверх мембраны с размером пор 8 мкм и инкубировали в течение 48 часов перед окрашиванием Гимза. Слева — обзор с малым увеличением (объектив × 5), справа-справа — вид с большим увеличением (× 20). В то время как только небольшое количество клеток HaCaT мигрировало через поры, значительно большее количество клеток HaSKpwC7 было обнаружено на дне мембраны. ( G ) Количественная оценка анализа камеры Бойдена. Мигрировавшие клетки оценивали вручную в 10 случайно выбранных полях на реплику с использованием 5-кратного увеличения объектива.Были проанализированы две независимые повторы. Коробчатые диаграммы представляют 25-75-й процентиль, а центральная полоса представляет собой медианное значение. Значимость проверялась с помощью t-критерия. Все анализы проводили с клетками HaSKpwC7 между пассажами 9 и 14 и с клетками HaCaT между пассажами 37 и 43.

Мы также наблюдали, что скорость клеточного движения для клеток HaSKpwC7 была выше, чем для клеток HaCaT. Более того, на эту скорость повлияло появление «соседей» (рис. 6Б). Для ячеек HaSKpwC7 наличие «соседей» снизило среднюю скорость с 0.От 92 мкм / мин (для изолированных клеток) до 0,76 мкм / мин (с другой ячейкой в ​​непосредственной близости). Изолированные клетки HaCaT двигались со средней скоростью 0,17 мкм / мин, тогда как клетки с «соседями» имели скорость 0,24 мкм / мин.

Чтобы выяснить, будет ли это иметь функциональные последствия, мы провели анализ заживления царапин. Царапину вводили в конфлюэнтные культуры клеток HaSKpwC7 и HaCaT, и процесс закрытия промежутка визуализировали каждые 30 минут в течение 24 часов. Чтобы различать движение клеток и пролиферацию клеток, в половине культур добавляли ингибитор репликации митомицин С (рис.6С). Результаты указывают на значительно более высокую эффективность закрытия царапины для клетки HaSKpwC7 при инкубации с митомицином C (+) (1,97 × 10 ^–3 мкм / мин) по сравнению с необработанными клетками (-) с 1,49 × 10 ^–3 мкм / мин. (Рис. 6C – E). Для клеток HaCaT эффективность миграции в целом была снижена, а также разница между митомицином (+) и (-) была ниже, со средней скоростью 0,77 × 10 ^–3 мкм / мин при обработке митомицином C и 0,52 × 10 ^{— 3} мкм / мин без митомицина С соответственно.Это прямое сравнение двух линий кератиноцитов показывает очень значительную повышенную скорость закрытия царапины для HaSKpwC7 в обоих условиях и тем самым подтверждает их повышенную подвижность (Рис. 6A, B).

В качестве следующего шага мы проанализировали миграционные свойства / инвазивный потенциал обеих клеточных линий с помощью анализа камеры Бойдена. При использовании кондиционированной среды из нормальных фибробластов кожи человека в качестве хемоаттрактанта было обнаружено, что обе клеточные линии способны проходить через поры 8 мкм. При этом мы выяснили, что HaCaT в среднем имеет 12.9 ± 2,4 клеток на поле зрения, клетки HaSKpwC7 показали значительное увеличение потенциала миграции с 80,1 ± 7,5 клеток на поле зрения (рис. 6F, G). Вместе оба исследования подчеркивают повышенную подвижность клеток HaSKpwC7 по сравнению с клетками HaCaT и демонстрируют, что это имеет функциональные последствия, как показано в анализах заживления ран и инвазии in vitro.

В то время как анализ камеры Бойдена должен имитировать способность к инвазивному росту, считается, что рост мягкого агара отражает потенциал роста опухоли ²⁸ .Поэтому мы затем протестировали клетки HaCaT и HaSKpwC7 на их способность образовывать колонии в мягком агаре. Интересно, что обе клеточные линии не смогли образовать колонии независимо от того, сколько клеток было засеяно и какая концентрация агара была использована (данные не показаны). Поскольку мы столкнулись с отсутствием корреляции между ростом мягкого агара и канцерогенностью у голых мышей для серии клеток карциномы, уже ранее ²⁹ , возникает соблазн предположить, что рост мягкого агара не является ценным параметром роста для эпидермальных клеток.

Клетки HaSKpwC7 демонстрируют дифференциальную экспрессию генов по сравнению с клетками HaCaT

Поскольку клетки HaSKpwC7 и HaCaT различаются по своей генетике и, следовательно, вероятно, также будут различаться по профилю экспрессии / молекулярной регуляции, мы затем сравнили профиль экспрессии генов HaSKpwC7 и HaCaT. клеток путем выполнения анализа дифференциальной экспрессии генов с использованием массива шариков Illumina HumanHT-12 v4. Анализировали три биологических повтора на каждую клеточную линию. После нормализации и проверки было идентифицировано 11380 транскриптов, которые были экспрессированы выше фонового уровня в обеих или одной из двух клеточных линий.Из этих 11380 транскриптов 390 были сверхэкспрессированы в клетках HaCaT, а 462 были сверхэкспрессированы в клетках HaSKpwC7 (фиг. 7A, B). Затем мы выбрали 25 наиболее сверхэкспрессированных транскриптов (с точки зрения кратности изменения и скорректированных значений p) в клетках HaCaT и HaSKpwC7, соответственно, и сравнили их уровни экспрессии в двух клеточных линиях и трех повторах.

Рисунок 7

Анализ дифференциальной экспрессии в клетках HaCaT и HaSKpwC7. ( A ) Был проведен анализ экспрессии РНК, и дифференциально экспрессируемые гены в двух клеточных линиях HaCaT (пассаж 38) и HaSKpwC7 (пассаж 9) представлены в виде графика вулкана. Красные точки представляют собой значительно сверхэкспрессированные гены в клетках HaSKpwC7, а синие точки представляют собой сверхэкспрессированные гены в клетках HaCaT. Серые точки представляют гены, экспрессия которых незначительно повышена (предел: 1,3 FC с скорректированными значениями p <0,01). ( B ) Диаграмма Венна, показывающая общее количество значительно экспрессируемых генов и количество сверхэкспрессированных генов в клетках HaCaT и HaSKpwC7, соответственно. ( C ) Тепловая карта показывает преобразованные log10 значения необработанной экспрессии, полученные для 25 верхних сверхэкспрессированных генов в HaSKpwC7 (вверху) и 25 верхних сверхэкспрессированных генов в клетках HaCaT (внизу).На тепловой карте показаны необработанные уровни экспрессии генов, а также их изменчивость. Серые полосы представляют собой соответствующие рассчитанные кратные изменения после нормализации. Основные данные представлены в дополнительной таблице 3. Обогащение онтологии генов с точки зрения биологических процессов транскриптов, представленных в клетках HaSKpwC7 ( D ) и HaCaT ( E ). Кластеры сортируются с увеличением соотношения генов, размер точек представляет размер группы, а цветовая кодировка отображает скорректированное значение p для вычисления обогащения (значения p <0.01 и размер группы> 5).

В то время как большинство генов, которые демонстрировали сильные изменения в экспрессии, демонстрировали переключение с низкого на высокий или наоборот (рис. 7C), мы также обнаружили значительную дерегуляцию в генах, которые были экспрессированы на среднем уровне (желтый цвет на тепловой карте) . Среди основных дерегулируемых генов мы обнаружили транскрипты, участвующие в формировании эпидермиса, кератинизации и экспрессии кератина. Полный список дифференциально экспрессируемых генов представлен в дополнительной таблице 2.Наиболее заметным является чрезмерная экспрессия эпидермальных генов KRT6B / C и KRT34 ^30,31,32 в клетках HaSKpwC7, тогда как в клетках HaCaT эти гены экспрессируются на низком уровне. Вместо этого клетки HaCaT сверхэкспрессировали простые кератины эпителия KRT7 и KRT19 ³³ . Интересно, что гены LOX, важные для кератинизации и терминальной дифференцировки в коже человека ³⁴ , также по-разному экспрессировались в двух клеточных линиях, демонстрируя незначительную экспрессию в клетках HaCaT, но сверхэкспрессию в клетках HaSKpwC7.

Затем мы проанализировали все дифференциально экспрессируемые гены с точки зрения их кластеризации, специфичной для пути, с помощью clusterProfiler ³⁵ . Полный набор экспрессируемых транскриптов использовали в качестве генной вселенной. Анализ онтологии генов выявил несколько кластеров генов, связанных с пролиферацией, адгезией и перемещением клеток, что хорошо соответствует описанным выше различиям в миграции клеток (рис. 6) и морфологии роста (рис. 5). Кроме того, они объясняют, почему клетки HaCaT становятся более компактными и с меньшей подвижностью по сравнению с клетками HaSKpwC7.Вторая большая группа дифференциально регулируемых генов попадает в кластер эпидермального развития, образования кожи и ороговения. Этот кластер, по-видимому, сверхэкспрессируется как в HaSKpwC7, так и в HaCaT (Fig. 7D-E), хотя задействованы разные транскрипты, и они хорошо демонстрируют свое происхождение и принадлежность к тканям.

Экспрессия микроРНК в HaCaT и HaSKpwC7 показывает различия в терминах клеточной дифференцировки

Хорошо известно, что ряд микроРНК играет ключевую роль в регуляции эпидермальной дифференцировки и гомеостаза.Чтобы лучше понять описанную выше дифференциальную регуляцию, мы решили проанализировать транскрипцию 23 кандидатных miРНК с потенциальными функциями в дифференцировке кожи и канцерогенезе кожи в клетках HaCaT и HaSKpwC7 с помощью технологии Fireplex (Abcam). Пять miRNA с очень низкой экспрессией были исключены из анализа (представлены в виде прозрачных графиков на фиг. 8). Среди оставшихся 18 кандидатов пять показали разные базальные уровни транскрипции (HaSKpwC7 по сравнению с клетками HaCaT). Два, hsa-miR-155-5p (+ 3.77 раз) и hsa-miR-21-5p (1,7 раза), как было обнаружено, активируются в клетках HaSKpwC7. Напротив, hsa-mir-203a-3p (- 5,16 раза), hsa-mir-34a-5p (- 1,89 раза) и hsa-mir-429 (- 2,33 раза) подавлялись (рис. 8) .

Фиг. 8 Экспрессия

микроРНК в клетках HaCaT по сравнению с клетками HaSKpwC7. Необработанные значения экспрессии Log10 23 уровней экспрессии miRNA в клетках HaCaT (синий) и HasKpwC7 (красный), измеренные с помощью анализа FirePlex. Пять miRNA были исключены из дальнейшего анализа из-за слишком низкого уровня экспрессии для надежной количественной оценки (тусклые столбцы).Пять miRNA демонстрируют дифференциальную экспрессию со кратностью изменения> 1,5 (серый фон), две из которых имеют значение p <0,01 (**; t-критерий Стьюдента). Клетки HaSKpwC7 анализировали между пассажами 11 и 14, клетки HaCaT анализировали между пассажами 39 и 41.

Примечательно, что более высокая экспрессия hsa-miR-155-5p и hsa-miR-21-5p также была обнаружена в келоидных кератиноцитах. ³⁶ . Таким образом, для клеток HaSKpwC7 можно предположить, что их повышенная экспрессия свидетельствует о более высоком онкогенном потенциале. Кроме того, более высокая экспрессия hsa-mir-203a-3p, hsa-mir-34a-5p и hsa-mir-429 в клетках HaCaT указывает на более высокий потенциал дифференцировки, снижение миграции и инвазии по сравнению с клетками HaSKpwC7 ^37,38 .

Клетки HaSKpwC7 демонстрируют измененную дифференцировку эпидермиса и инвазивный рост при реконструкции ткани

Чтобы определить функциональные последствия фенотипических и генотипических различий, выявленных in vitro, мы исследовали клетки HaSKpwC7 и HaCaT на предмет их способности к развитию и поддержанию эпителиоподобного эпителия в 3D органотипические культуры.Как мы показали ранее, NHEK генерируют эквиваленты кожи, идеально воспроизводящие нормальный эпидермис человека in situ ³⁹ . Точно так же клетки карциномы кожи демонстрируют свой канцерогенный потенциал в кожных эквивалентах, прорываясь через базальную мембрану и инвазивно прорастая в нижележащий кожный эквивалент, аналогично тому, что наблюдается в ксенотрансплантатах у голых мышей ³⁹ .

Для тестирования клеток HaSKpwC7 и HaCaT мы получили дермальные эквиваленты фибробластов, которые были дополнены клетками HaSKpwC7 или HaCaT ³⁹ .Ткани выращивали в течение 3 и 6 недель соответственно, прежде чем они были подготовлены для гистологического и иммуногистохимического анализов (рис. 9). В течение 3 недель клетки HaSKpwC7 и HaCaT образовали многослойный, хотя и неорганизованный, эпителий с массивным паракератотическим роговым слоем.

Фигура 9

Органотипические культуры, полученные с клетками HaCaT и HaSKpwC7. Органотипические культуры на основе дермального компартмента человеческого фибробласта (пассаж 8) и эпителия, полученного из клеток HaCaT (пассаж 39) или HaSKpwC7 (пассаж 17).( A — D ) Гистология HaCaT и HaSKpwC7 3-недельных ( A , B ) и 6-недельных культур ( C , D ). Обратите внимание, что клетки HaSKpwC7 демонстрируют инвазивный рост в оба момента времени. ( E — L ). Иммунофлуоресцентное окрашивание кератинов, специфичных для дифференцировки (K10) ( E — H ) и K2 ( I — L ), оба зеленого цвета. Окрашивание ядер проводили с помощью DAPI (синий). Шкала 50 мкм.

В отличие от эпителия HaCaT, эпителий HaSKpwC7 был менее плотно упакован и преимущественно образован большими кератиноцитами с обильной бледной эозинофильной (стекловидной) цитоплазмой, что указывает на измененный метаболизм.Однако наиболее заметно то, что клетки HaSKpwC7 вторглись в нижележащий кожный эквивалент. Этот неожиданный туморогенный фенотип оказался стабильным также через 6 недель (рис. 9A – D) и представил общий признак клеток HaSKpwC7 также в дальнейшем.

Более поздний момент времени также характеризовался некоторым акантолизом. Это контрастирует с эпителием HaCaT, который со временем нормализуется, в результате чего организация тканей становится более похожей на эпидермис. Это также подтвердилось при исследовании маркеров ранней (Keratin 10, K10) и поздней (Keratin 2, K2) дифференцировки эпидермиса (рис. 9E – L). В то время как в эпителии HaCaT экспрессия и распределение более близко напоминали таковые в нормальном эпидермисе человека, экспрессия маркеров эпидермальной дифференцировки была довольно снижена в эпителии HaSKpwC7 6-недельного возраста, оставляя поверхностный эпителий в значительной степени недифференцированным. Интересно, что островки инвазивных клеток оставались строго положительными по дифференцировочно-специфическому кератину 10, демонстрируя, что их потенциал к эпидермальной дифференцировке не теряется и, следовательно, не является причиной усиления инвазивного роста.

Таким образом, с клетками HaSKpw мы создали уникальную клеточную модель, которая спонтанно иммортализовалась и в своих ранних пассажах использовалась как представители нормальных кератиноцитов кожи человека ⁴⁰ — спонтанно приобретающих неопределенный и инвазивный потенциал роста во время последующего пассирования.

(кератоакантомы) у людей и в модельной системе животных

МОЛЕКУЛЯРНАЯ И КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ, февраль 1988 г. , стр. 786-793 Т. 8, № 2 0270-7306 / 88 / 020786-08 $ 02.00 / O Copyright C 1988, Американское общество микробиологов Активация H-ras в доброкачественных an d самообслуживании Регресс в g Sk в опухолях ( Keratoac an thomas ) в И человек и животное Модель Система ХАВЬЕР ЛЕОН, 1т HIDEKO KAMINO, 2 JACOB J.ШТЕЙНБЕРГ, И ЭНДЖЕЛ ПЕЛЛИЦЕР *, Отделение патологии, и d , Центр Капля и C , », < strong> an d Департамент дерматологии, 2 Медицинский центр Нью-Йоркского университета, 550 First Avenue, New York, New York 10016 Получено 6 августа 1987 г. / принято 23 ноября 1987 г. in участие онкогенов ras в онкогенезе было исследовано в кератоак и томах, которые являются доброкачественными an d саморегрессии в g sk в опухолях, оба в гул < strong> an s an d in a соответствующий in g an Imal модельная система. Я (аратоак и тома был введен в уши кроликов путем многократного применения 7,12-диметилбенз (а) ан фрацена. Около 60% опухолевых ДНК продуцировали tr an сформированные очаги после tr an -сфекции in клетками NIH 3T3, an d у всех из них ген tr an sform in g был идентифицирован Саузерном < strong> an d Нозерн (РНК) гибридизация.Эксперименты по иммунопреципитации показали, что tr an sform в g кролика H-ras prote in несет мутацию в кодоне 61. . Кроме того, активированный ген H-ras был обнаружен в гуле кератоаке и томе нами < strong> in ga тест на туморогенез голых мышей после tr an -фекции опухолевой ДНК in клетками NIH 3T3. Это первое сообщение об активации ras в доброкачественной an опухоли. Ген tr an sform in g hum an H-ras обнаружил po in t мутацию в кодон 61, который приведет к получению leuc in e вместо глутамма в e, присутствующем < strong> в нормальном генном продукте.F in d in g активации ras в опухолях, которые не только доброкачественные, но и сами регрессируют в g in указывает на то, что активированных ras-генов недостаточно для in ta неопластического фенотипа, хотя они, вероятно, играют роль в ранние стадии онкогенеза. Члены семейства генов ras (H-ras, K-ras, an d N-ras) были обнаружены активированными в примерно 15% человеческих an опухолей tr an методами заражения. Эта активация является результатом мутаций po in t в последовательности трески in g (3). Недавние сообщения показали более высокую частоту мутации ras в каркасе толстой кишки в омах (7, 16). Хотя ras-гены являются наиболее часто обнаруживаемыми онкогенами в гене an c an cer, существуют разногласия относительно того, является ли активация ras an раннее событие в развитии опухоли (вероятно, играет в причинную роль в в образовании опухоли) или вторичное an d позднее событие.В качестве экспериментального подхода к этой проблеме было описано несколько an модельных систем, которые приводят к воспроизводимой активации ras-генов в < / strong> экспериментально в индуцированных опухолях у крыс или мышей (23). Таким образом, tr an sform в g генов H-ras были обнаружены в туши молочной железы в омах (12, 46), sk в папилломах и d каркасе в томах (2, 3, 6), an d опухоли печени (41, 54).Tr an sform в g K-ras an d гены N-ras были обнаружены в < / strong> лимфомы тимуса (22), опухоли почек (47), an d sk в туше в омах (44). Высокая частота активации ras, обнаруженная в этих имальных моделях, убедительно свидетельствует об участии активированного онкогена в развитие соответствующей в г опухоли, а д в некоторой в ст an ces, результаты также in указывают на то, что активация ras происходит на ранней стадии туши (3, 8 , 56). Однако другие отчеты, похоже, in указывают на активацию ras в клетках после того, как они стали неопластическими, или на dur при прохождении клеток (1, 49, 51) . Sk in carc in ogenesis предлагает удобную модель для экспериментального подхода к проблеме роли генов ras в патогенез c an cer из-за доступности для лечения туберкулеза in ogen an d из-за развития опухоли c an легко контролировать.Мы выбрали sk in опухоли, названные keratoac an thomas, потому что (i) они являются доброкачественными опухолями, которые претерпевают полную спонтанную регрессию, несмотря на an * Соответствует в г автору. t Нынешний адрес: Departamento de Biologia Molecular, Facultad de Medic in a, 39011 S an t an d er. , Спа в .t Нынешний адрес: Отделение патологии, Albert E in ste in College of Medic in e, Bronx, New York 10461. 786 в ее относительно быстрой скорости роста (21) an d (ii) повторные применения 7,12-диметилбенз (a) an фрацен (DMBA) в sk in кроличьих ушах, как сообщалось, в саморегрессии в g опухолях морфологически an d гистологически идентичен гуму an keratoac an thomas (20, 36, 37).Таким образом, кератоак и тома представляют собой уникальную модель, поскольку они могут позволить идентифицировать онкогены, которых недостаточно, чтобы вызвать та рост опухоли . Следовательно, мы поставили перед собой задачу в исследовать, являются ли эти саморегрессивные в g опухолями в определенной форме. в g генах в оба гудят an s d кроличью модель.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Опухоли. Внутренние лица ушей новозеландских d кроликов были покрыты с содержанием 1% (вес / vol) DMBA в смесь l an ола в an d m < Strong> в еральном масле (1: 1) два раза в неделю в течение 8-10 недель. После умерщвления an imal опухоли удаляли.Часть опухоли (около одной трети) была зафиксирована в формальном в d встроенном в парафе в , и d секциях были в добавлен гематоксил в < / strong> -eos в . Остальную часть опухоли использовали для выделения ДНК. Hum an keratoac an thomas были получены в отделении дерматологии Медицинского центра Нью-Йоркского университета, an < / strong> d обрабатывается аналогичным образом . Опухоль HK3 была удалена из левого виска у 47-летнего пациента мужского пола. Извлечение ДНК d tr an заражения.Высокомолекулярные ДНК из опухолей получали, как описано ранее (15, 35). ДНК из опухолей кроликов были преобразованы в in в клетки NIH 3T3 методом соосаждения фосфатом кальция (53). Через 3–4 недели три an сформированные очаги были обнаружены an d exp an d < / strong> изд. ДНК из опухолей человека an были cotr an инфицированы неоплазмидой pIBW3 (25) in в клетки NIH 3T3.Tr an инфицированные клетки отбирали с помощью an тибиотика G418 (GIBCO Laboratories; 400, мкг / мл) an d in использовал in обнаженных мышей, как описано ранее (15). Обычно вводили клеток размером 5 x 10 футов, рост опухоли и d отслеживали в течение 8 недель. Гибридизации нуклеиновых кислот.ДНК, расщепленную соответствующими ферментами, подвергали электрофорезу в 4% агарозе-50%

SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Укажите свой трафик, обновив свой пользовательский агент и включив в него информацию о компании.

Чтобы узнать о передовых методах эффективной загрузки информации с SEC.gov, в том числе о последних документах EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC. gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации свяжитесь с opendata @ sec.губ.

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.5dfd733e.1640850198.3146140c

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная услуга оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 USC §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других пользователей к SEC.содержание правительства. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период. Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.губ. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC. gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

YAP / TAZ: многообещающая цель для лечения плоскоклеточного рака

Введение

Путь бегемота был впервые обнаружен у дрозофилы в 1990-х годах.Этот сигнальный путь очень консервативен. Он регулирует размер органов и поддерживает гомеостаз во время пролиферации и апоптоза клеток. ^1,2 Как основные нижестоящие эффекторы пути Hippo, YAP и его паралог TAZ ³ негативно регулируются путем Hippo из-за их фосфорилирования ² и их неспособности проникнуть в ядро. ⁴ За последние два десятилетия в ряде исследований было обнаружено четыре белка, включая Wart (Wts), ⁵ каркасный белок Salvador (Sav), ^6,7 Hippo (Hpo), ^1,8–10 и Mats, ¹¹ как центральная часть пути Drosophila Hippo. На основании этого в 2005 г. был открыт йорки (Yki), коактиватор транскрипции, действующий как партнер по связыванию Wts. ² У дрозофилы базовая киназа Hippo связывает и фосфорилирует Salvador, затем расположенные ниже киназы Warts и Mats, которые способствуют фосфорилированию Yki и локализуют его в цитоплазме, ингибируют транскрипцию генов-мишеней. ¹⁰ Напротив, нефосфорилированный Yki переносится в ядро ​​и связывается с фестончатым (Sd), ^12,13 , который индуцирует транскрипцию нижележащих генов, включая гены, регулирующие рост клеток и апоптоз, такие как циклин E, клетки ингибитор смерти Diap1 и dmyc. ^8,14 Гомологичный белок Yki у млекопитающих представляет собой транскрипционно активный YAP, идентифицированный в 1994 году. ¹⁵ TAZ, паралог YAP был идентифицирован в 2000 году как белок, который связывается с белком 14-3-3. ³ С момента открытия YAP / TAZ они стали критическими регуляторами раннего эмбрионального развития и взрослых органов, управляя транскрипцией генов, которые способствуют пролиферации клеток, выживанию клеток и поддержанию стволовых клеток. ^16,17 Следовательно, низкая активность YAP / TAZ может привести к дефектам развития, дефектной репарации и атрофии органов.Напротив, аномально высокая активность YAP / TAZ способствует чрезмерному росту клеток и образованию опухолей. В этом обзоре мы представим обзор сети путей Hippo, функций YAP / TAZ и их регулирования. Мы также обсудим роль YAP / TAZ в плоскоклеточном раке.

Путь бегемота у млекопитающих

Подобно пути Drosophila Hippo, путь Hippo млекопитающих также рассматривается как путь супрессора опухоли, регулируемый каскадом зависимых от фосфорилирования протеинкиназ.У дрозофилы каскад киназ в основном включает STE20-подобную протеинкиназу млекопитающих (MST1 / 2), супрессор больших опухолей 1/2 (LATS1 / 2), гомологию Сальвадора1 человека (SAV1) и активатор киназы MOB (MOB), которые являются гомологичными. на Hpo, Wts, Sav и Mats соответственно. ¹ Киназная цепь может контролировать активность расположенного ниже эффектора YAP / TAZ (рис. 1). Активированный MST1 / 2 связывается с регуляторным белком SAV1, который способствует фосфорилированию LATS1 / 2 и MOB, а затем фосфорилированию YAP / TAZ по остатку серина-127. ^18,19 Этот зависимый от фосфорилирования процесс ведет к цитоплазматическому удержанию взаимодействия белков YAP / TAZvia 14-3-3, ^7,20-25 и его убиквитинизации и деградации (Рис. 1). ²⁶ После инактивации пути Hippo дефосфорилированный YAP / TAZ перемещается в ядро ​​и связывается с фактором транскрипции TEAD, чтобы индуцировать экспрессию генов, участвующих в пролиферации клеток, антиапоптозе и трансформации эпителиально-мезенхимальных клеток (Рисунок 1) . ^27–29 Недавние исследования Lamar et al. Показали, что связывание с семейством TEAD является важным шагом для YAP для выполнения своих функций. ³⁰ Мутация ключевых сайтов, связанных со связывающими доменами TEAD или YAP, будет ингибировать YAP-индуцированную экспрессию гена и его функции. ³⁰ Помимо связывания TEAD, YAP / TAZ может также связываться с другими факторами транскрипции, такими как Smad, связанные с RUNT факторы транскрипции (Runx1 / 2), P63 / P73, эритробластный онкоген B4 (ErbB4), ³¹ T фактор транскрипции -box5 (TBX5), ³² и Pax3. ^33,34 Наконец, он участвует в пролиферации, дифференцировке и апоптозе клеток.Другое исследование показало, что различные цитокины, включая фактор роста соединительной ткани (CTGF), цистеин-рихангиогенный индуктор 61 (CYR61), анкириновый повторяющийся домен 1 (ANKRD1), бакуловирусный белок 5, содержащий повторы IAP (BIRC5), ¹⁸ нейротрофических клеток головного мозга. фактор и фактор роста фибробластов 1 работали в качестве субстратов для стимуляции YAP. CTGF действует как прямой ген-мишень для YAP, способствуя пролиферации клеток и закреплению для независимого роста. ³⁵ Недавно Ким и др. Показали, что YAP / TAZ также функционирует как транскрипционный ко-репрессор, способствуя выживанию клеток путем репрессии индуцируемого повреждением ДНК транскрипта 4 (DDIT4) и связанного с TNF лиганда, индуцирующего апоптоз (Trail), опосредованного гистоном. комплекс деацетилазы (NuRD). ³⁶

Рисунок 1 Регуляция пути бегемота. Обзор регуляции транскрипции с помощью YAP / TAZ в клетках млекопитающих. Ядро пути передачи сигналов Hippo включает киназы MST1 / 2 и LATS1 / 2, которые действуют как активные димеры с SAV1 и MOB1, соответственно. Чтобы сделать возможным фосфорилирование YAP и TAZ, фосфорилирование YAP / TAZ создает сайт связывания 14-3-3, который способствует цитоплазматической локализации YAP / TAZ, что приводит к задержке и деградации цитоплазмы YAP / TAZ.YAP и TAZ перемещаются в ядро ​​и служат коактиваторами транскрипции для TEAD, чтобы координировать пролиферацию и антиапоптотические программы, когда путь передачи сигналов Hippo инактивирован. Сокращения: YAP, Да-ассоциированный белок; TAZ, коактиватор транскрипции с PDZ-связывающим мотивом.

Путь Hippo, наблюдаемый у млекопитающих, в основном регулируется несколькими входными факторами восходящего сигнала, такими как WW, белок 1, содержащий домен C2 (KIBRA / WWC1), нейрофибромин2 (Nf2) и белок 6, содержащий домен FERM ( willin / FRMD6). ³⁷ Недавно было обнаружено, что передача сигналов G-белкового рецептора (GPCR) действует как восходящий сигнал пути Hippo. Было показано, что стимуляция G12 / 13-связанных рецепторов или Gs-связанных рецепторов может ингибировать или активировать Lats1 / 2, тем самым активируя или ингибируя YAP / TAZ, чтобы влиять на пролиферацию и миграцию клеток. ³⁸

ЯП / ТАЗ и его положение

Состав ЯП / ТАЗ

YAP является коактиватором транскрипции пути Hippo и способствует экспрессии генов за счет усиления активности факторов транскрипции.Он имеет два подтипа: YAP1 и YAP2. YAP содержит несколько доменов и специфических аминокислотных последовательностей, включая TEAD-связывающую область (образованную 94-м серином, S94), два WW-домена (состоящие из аминокислот 172–204 и 231–263), N-концевой пролин-богатый домен, С-концевой PDZ-связывающий мотив, Sh4-связывающий мотив, домен спиральной спирали и домен активации транскрипции (рис. 2). TAZ гомологичен YAP и имеет те же домены и функции, что и YAP. ³ Однако он лишен богатого пролином домена, второго WW-домена и Sh4-связывающего мотива (Рис. 2).Предыдущее исследование продемонстрировало, что домен WW специфически распознает мотивы PpxY (P — пролин, x — любая аминокислота и y — тирозин), тем самым контролируя локализацию и активность YAP / TAZ. ³⁹ C-конец YAP / TAZ может точно идентифицировать домен PDZ, который состоит из 80–90 аминокислот и присутствует во многих белках. ⁴⁰

Рисунок 2 Сооружения ЯП и ТАЗ. YAP имеет богатую пролином ( P -богатую) область на N-конце, домен связывания фактора транскрипции TEAD, домен (ы) WW в середине, за которым следует мотив связывания домена 3 гомологии Src (Sh4 BM ), спирально-спиральный мотив (CC) и PDZ-связывающий мотив на С-конце.TAZ имеет такую ​​же доменную организацию, что и YAP, но лишен богатого пролином домена, второго WW-домена и Sh4-связывающего мотива. Сокращения: YAP, Да-ассоциированный белок; TAZ, коактиватор транскрипции с PDZ-связывающим мотивом.

Влияние YAP / TAZ на пролиферацию клеток и апоптоз

Предыдущие исследования показали, что YAP / TAZ является онкобелком, вызывающим пролиферацию клеток. У Drosophila сверхэкспрессия yki (гомолог YAP у Drosophila) приводит к чрезмерному разрастанию крыльевых дисков третьего возраста. ² Исследователи установили, что мыши, которые сверхэкспрессируют YAP, обладали более высокой митогенной активностью в кератиноцитах и ​​более толстым базальным слоем, суперслоем и роговым слоем, присутствующими на эпидермисе, чем у мышей дикого типа. Напротив, мыши с нокаутом мутантного гена YAP показали заметное усыхание эпидермиса и замедленное заживление ран. ⁴¹ Когда кожа была поранена, уровень белка YAP в кератиноцитах увеличивался и впоследствии индуцировал пролиферацию клеток. ⁴¹ Другое исследование показало, что пролиферация была ингибирована в клеточной линии рака легкого A549, трансфицированной геном MST1, что было связано с высоким уровнем фосфорилирования YAP. ⁴² Было также замечено, что при повреждении печени, вызванном холестазом, высокая экспрессия YAP способствовала пролиферации гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков и приводила к меньшему повреждению печени. ⁴³ Условный нокаут гена YAP / TAZ приводит к подавлению регенерации гепатоцитов и некрозу печени. ⁴³ Интересно, что высокие концентрации желчной кислоты могут действовать как вышестоящие активаторы пути Hippo, активировать транскрипционную активность YAP и стимулировать пролиферацию гепатоцитов и туморогенез. ⁴⁴

Напротив, YAP / TAZ оказывает ингибирующее действие на апоптоз. У дрозофилы белок Yki ингибирует апоптоз клеток за счет снижения активности связанного с апоптозом гена-жнеца (rpr), связывания P53 со стимулирующим апоптоз белка P53-1 (ASPP1) и активации дефектной инволюции головы (hid). ⁴⁵ Предыдущее исследование также подтвердило антиапоптозный эффект YAP / TAZ в клетках карциномы, показав, что ядра клеток гепатоцеллюлярной карциномы и внутрипеченочных клеток холангиокарциномы богаты YAP и ингибитором апоптотического белка, сурвивином, транскрипция которого зависит от YAP / TAZ. . ⁴⁶

Сигнальные пути YAP / TAZ

YAP / TAZ в пути Hippo может играть роль в пролиферации клеток и запрограммированной смерти, регулируя или регулируя различные пути передачи сигналов. YAP / TAZ тесно связан с Wnt / β-катенином, ⁴⁷ TGF-β / SMAD, ⁴⁸ Notch ^49,50 и путём P13 / AKT. ^51,52

Barry et al. Обнаружили, что YAP ограничивает ядерную транслокацию растрепанных (DVL) и регенерацию кишечных клеток. ⁴⁷ Это ингибирование было вызвано DVL-опосредованной инактивацией сигнального пути Wnt. ⁴⁷ В исследовании, основанном на онкогенезе и развитии, было обнаружено, что Smad3 / YAP / TEAD / p300 может образовывать комплексы для увеличения экспрессии CTGF, способствовать пролиферации злокачественных стромальных клеток и секреции внеклеточного матрикса. ⁴⁸ YAP / TAZ также может взаимодействовать с сигнальным путем Notch для регулирования гомеостаза кишечника. В нормальных условиях в кишечных криптах экспрессировался только Hes-1, ген-мишень сигнального пути Notch. ⁴⁹ Активация YAP и экспрессия Hes-1 была расширена и распределена во всем хориоэпителии, что свидетельствует о том, что YAP-опосредованная экспансия кишечных клеток-предшественников, по крайней мере, частично зависела от активации сигнала Notch. ^49,50 Путь PI3K / AKT может взаимодействовать с сигнальным путем Hippo / YAP для регулирования пролиферации клеток и запрограммированной гибели клеток. ⁵¹ Сообщалось, что Pik3cb, один из генов, кодирующих PI3k, может быть напрямую активирован YAP / TAZ через TEAD, чтобы способствовать транскрипции PI3K и активации AKT. ⁵² Этот механизм также был подтвержден на кардиомиоцитах крыс, поскольку YAP-опосредованная активация PI3K / AKT способствует его пролиферации и снижает запрограммированную гибель клеток. ⁵²

Роль YAP / TAZ в плоскоклеточном раке

Как нижележащая функция пути Hippo, YAP / TAZ может индуцировать активацию генов-мишеней, связанных с пролиферацией, инвазией и метастазированием раковых клеток. Следовательно, YAP / TAZ играет роль онкогена в ряде злокачественных опухолей, таких как легкие, ⁵³ печени, ⁵⁴ гинекологические, ^55,56 желудочно-кишечные, ^57,58 и злокачественные опухоли кожи. ⁵⁹ Среди злокачественных новообразований кожи наиболее распространенными формами являются плоскоклеточный рак (SCC), базальноклеточный рак (BBC) и меланома. Исследования показывают, что как у человека, так и у мышей BBC, YAP и TAZ были ядерными и сильно экспрессировались. ^59,60 Между тем условная делеция YAP и TAZ в мышиных моделях BCC предотвращала образование опухоли. ⁵⁹ Передача сигналов YAP также ускоряла развитие BBC через ось c-JUN / AP1, ⁶⁰ положительные регуляторные взаимодействия с передачей сигналов Hedgehog / GLI2, ⁶¹ и его нижестоящий от богатого цистеином белка 61 (CCN1) и рост соединительной ткани коэффициент (CCN2). ⁶² Что касается меланомы, недавние статьи описывают высокую экспрессию TAZ / YAP, которая способствует ее прогрессированию, связанному со стимуляцией белка 1, связанного с рецепторами липопротеинов низкой плотности (LRP1), и влияет на послеоперационную выживаемость пациентов. ^63,64 Новые данные также свидетельствуют о том, что YAP напрямую опосредует уклонение от цитотоксических Т-клеточных иммунных ответов в BRAFi-устойчивых клетках меланомы за счет активации PD-L1, а нацеливание на YAP-опосредованное уклонение от иммунитета может улучшить прогноз пациентов с меланомой. ⁶⁵ Все больше и больше свидетельств показывают, что плоскоклеточный рак (SCC), который возникает в различных органах, покрытых плоскоклеточным эпителием, не только ограничивается кожей, был инициирован и определен YAP / TAZ. Здесь мы сосредоточимся на SCC и суммируем влияние YAP / TAZ на онкогенез и прогрессирование нескольких распространенных SCC.

Плоскоклеточный рак кожи

Гомозиготный мутант мыши по гену, кодирующему 14-3-3σ, демонстрирует серьезные дефекты кожи, такие как толстый эпидермис, высокая пролиферация базального и остистого слоев, а также отсутствие зернистости и рогового слоя, что сопровождается усилением ядерной локализации YAP в эпидермальных клетках. ⁶⁶ Это исследование продемонстрировало, что YAP / TAZ как находящаяся ниже молекула 14-3-3σ блокирует его связывание с изоформами 2 4-3-3 и не может секвестрировать в цитоплазме из-за мутанта 14-3-3σ. ⁶⁶ Накопление YAP / TAZ в ядре вызывает непрерывную экспансию предшественников, ингибирование дифференцировки в эпидермисе и образование плоскоклеточного рака кожи (CSCC). ⁶⁶ Было обнаружено, что YAP / TAZ высоко экспрессируется как в мышиных, так и в человеческих CSCC и демонстрирует повышенную экспрессию в раненой коже. ⁶⁷ Когда YAP / TAZ был отключен, пролиферация клеток, отмеченная положительным результатом Ki67, снижается. ⁶⁷

YAP / TAZ может активировать сигнальный путь EGFR / RAS, индуцируя экспрессию амфирегулина (AREG) во время транскрипции, тем самым активируя его нижестоящие пути P13K / AKT и ERK. ⁶⁸ Два последних пути участвуют в регуляции роста, выживания и миграции клеток на CSCC. ⁶⁸ Белок S100A7 высоко экспрессируется при псориазе, дифференцированном SCC и поражениях кератоакантомы. ⁶⁹ В клеточной линии SCC A431 YAP может ингибировать экспрессию белка S100A7 путем связывания с TEAD1. Хотя YAP имеет меньшую экспрессию белка по сравнению с S100A7, исследователи полагают, что оба белка могут способствовать пролиферации клеток и ингибировать дифференцировку клеток. Более того, белок S100A7 может заменять YAP для поддержания выживаемости клеток. ^69,70

Плоскоклеточный рак пищевода

Рак пищевода — один из наиболее распространенных видов рака желудочно-кишечного тракта. ⁷¹ Патологический тип рака пищевода — это в основном плоскоклеточная карцинома пищевода (ESCC). ⁷² Muramatsu et al. Обнаружили, что эффект YAP в ESCC зависит от уровня его экспрессии, а истощение YAP ингибирует пролиферацию клеток, что сопровождается увеличением транскрипции CDKN1A / p21 и снижением транскрипции BIRC5 / сурвивин. ⁷³ Клинические наблюдения показали, что накопление ядер или сверхэкспрессия YAP были связаны с плохим прогнозом для пациентов с ESCC. ⁷³ Другое клиническое исследование 142 случаев ESCC и 29 случаев нормальной ткани пищевода показало, что расположение YAP в ядре было намного больше в ESCC, чем в нормальной ткани пищевода. ⁷⁴ Более того, одномерный анализ показал, что обогащение ядерной YAP было связано с диаметром опухоли, экспрессией Ki67, гистологической степенью (1-2 против 3), патологической категорией T (1 против 2-4) и патологической стадией TNM (стадия 1). по сравнению с 2–4) у пациентов с ESCC, что указывает на то, что накопление YAP / TAZ в ядрах коррелирует с выживаемостью пациентов и прогнозом. ⁷⁴

Плоскоклеточный рак головы и шеи

Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) является наиболее распространенным злокачественным новообразованием головы и шеи. Из-за его анатомического расположения и соседнего отношения все аспекты лечения опухоли ограничены, что серьезно влияет на качество жизни пациентов. ⁷⁵ Оценка экспрессии YAP с помощью технологии иммуногистохимического тканевого чипа показала, что экспрессия YAP в HNSCC была значительно выше, чем в доброкачественной ткани и предраковых поражениях, и более низкая дифференцировка опухоли была наряду с более высокой экспрессией YAP. ⁷⁵ Недавнее исследование показало, что комплекс ACTL6A / P63 подавляет WWC1, чтобы активировать YAP / TAZ и способствовать онкогенезу в HNSCC. Также было замечено, что ACTL6A и активированный путь YAP / TAZ дают плохой прогноз при первичном HNSCC. ⁷⁶ Эксперимент Ванга и др. Показал, что уровень ядерного YAP / TAZ в фибробластах, связанный с периневральной инвазией, был выше, чем в строме нормальной слизистой оболочки, предполагая, что программы транскрипции, опосредованные YAP / TAZ в фибробластах, могут вносить свой вклад. периневральной инвазии в HNSCC. ⁷⁷ Интересно, что недавнее исследование показало, что повышающая регуляция кольцевой РНК, circPVT1 вместе с мутацией TP53 приводит к повышенной пролиферации клеточных линий HNSCC за счет образования комплекса mut-p53 / YAP / TEAD. ⁷⁸

Плоскоклеточный рак полости рта

Геномный анализ показал, что YAP / TAZ усиливается и сверхэкспрессируется при плоскоклеточной карциноме полости рта (OSCC). ⁷⁹ Hiemer et al. Продемонстрировали, что накопление YAP / TAZ в ядре способствует пролиферации, выживанию и миграции клеток OSCC in vitro и требуется для роста и метастазирования OSCC in vivo . ⁸⁰ Недавние исследования показали, что уровень экспрессии YAP был выше в тканях OSCC, чем в соседних нормальных тканях, и YAP мог управлять транскрипцией генов bcl-2 и c-myc, что впоследствии приводило к пролиферации клеток OSCC и устойчивости к апоптозу. ⁸¹ Экспрессия TAZ была значительно выше в клетках и образцах плоскоклеточной карциномы полости рта (TSCC) языка, чем в незлокачественных клетках и нормальной слизистой оболочке языка. ⁸² Увеличение экспрессии TAZ в TSCC было значимо связано с размером опухоли, патологической степенью, клинической стадией, экспрессией Ki-67, снижением общей и безрецидивной выживаемостью. ⁸²

Плоскоклеточный рак шейки матки

Рак шейки матки — одно из самых распространенных злокачественных новообразований женской репродуктивной системы. Хорошо известно, что наиболее распространенным гистологическим типом рака шейки матки является плоскоклеточная карцинома, и ее начало представляет собой непрерывный процесс развития от плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии шейки матки до инвазивного рака. ⁸³ Liu et al. Сообщили, что по сравнению с нормальными тканями, YAP значительно увеличился в шейке матки SCC и положительно коррелировал с дифференцировкой опухоли, метастазами в лимфатические узлы и ранним рецидивом. ⁸⁴

Терапевтический потенциал в отношении YAP / TAZ при плоскоклеточном раке

На основании вышеупомянутых исследований ясно, что YAP / TAZ, который высоко экспрессируется в SCC, ^{68,73,75,80,84} имеет онкогенную функцию. Следовательно, стратегия против YAP / TAZ может предотвратить или, по крайней мере, замедлить прогрессирование SCC. К счастью, сообщалось, что некоторые ингибиторы эффективны при лечении SCC посредством прямого и косвенного ингибирования активации YAP / TAZ. Экспериментальные данные продемонстрировали, что вертепорфин, одобренная FDA фотодинамическая терапия, ингибирует взаимодействие YAP-EAD и подавляет индуцированный YAP избыточный рост раковых клеток in vivo или in vitro. ^85,86 Кроме того, отчет показал, что вертепорфин также активирует путь Hippo и секвестрирует YAP в цитоплазме, повышая регуляцию 14-3-3. ⁸⁷ Был определен ряд путей для стимулирования деятельности YAP / TAZ. Некоторые из них могут быть использованы в качестве мишени для лечения YAP-зависимого рака, например рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR). ⁸⁸ Сообщалось, что вирусный GPCR ингибировал киназы пути Hippo от Lats1 / 2 до Gq / 11 и G12 / 13, что приводило к активации YAP / TAZ. ⁸⁹ Нацеливание на нижестоящие гены YAP / TAZ, такие как CYR61 и CTGF, также является стратегией лечения SCC, необходимого для YAP / TAZ-зависимого прогрессирования рака. ^90,91

Заключение и перспективы на будущее

Путь Hippo играет ключевую роль в развитии млекопитающих и контроле размера органов. YAP и TAZ являются коактиваторами транскрипции, которые негативно регулируются путем Hippo. Активация YAP / TAZ способствует образованию и прогрессированию опухоли. Последующее исследование показало, что YAP / TAZ сверхэкспрессируется при значительном количестве раковых заболеваний человека, особенно в SCC, происходящих из разных органов. Следовательно, нацеливание на ингибирование активации YAP / TAZ могло бы быть эффективным подходом к лечению рака, управляемого YAP / TAZ. Существует несколько стратегий прямого нацеливания на YAP / TAZ-TEAD, включая нацеливание на вышестоящие сигнальные молекулы и нижестоящие гены-мишени YAP / TAZ.Однако побочные эффекты этих методов лечения остаются неясными. Более того, нет исследований, показывающих, что ингибирование YAP / TAZ может предотвратить рост метастатического рака.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами Китайского национального фонда естественных наук (81570344, Ин Синь), Программы Нормана Бетьюна Университета Цзилинь (2015225, Инь Синь и 2015203, Синь Цзян), Центра науки провинции Цзилинь. и технологических фондов (201

200JC — Синь Цзян), а также Комиссия по здравоохранению и планированию семьи фондов провинции Цзилинь (2016Q034 — Инь Синь).

Раскрытие

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в этой работе.

Список литературы

1. Удан Р.С., Канго-Сингх М., Ноло Р., Тао С., Гальдер Г. Бегемот способствует остановке распространения и апоптозу в пути Сальвадор / Бородавки. Нат Клетка Биол . 2003. 5 (10): 914–920. DOI: 10.1038 / ncb1050

2. Хуанг Дж., Ву С., Баррера Дж., Мэтьюз К., Пэн Д. Путь передачи сигналов Hippo координирует клеточную пролиферацию и апоптоз путем инактивации Йорки, гомолога дрозофилы YAP. Ячейка . 2005. 122 (3): 421–434. DOI: 10.1016 / j.cell.2005.06.007

3. Канаи Ф., Мариньяни П.А., Сарбасова Д. и др. TAZ: новый коактиватор транскрипции, регулируемый взаимодействиями с 14-3-3 и белками домена PDZ. Эмбо J . 2000. 19 (24): 6778–6791. DOI: 10.1093 / emboj / 19. 24.6778

4. Yu FX, Guan KL. Путь бегемота: регуляторы и правила. Genes Dev . 2013. 27 (4): 355–371. DOI: 10.1101 / gad.210773.112

5. Джастис Р. У., Зилиан О., Вудс Д. Ф., Нолл М., Брайант П. Дж..Ген бородавок-супрессоров опухолей дрозофилы кодирует гомолог киназы миотонической дистрофии человека и необходим для контроля формы и пролиферации клеток. Genes Dev . 1995. 9 (5): 534–546. DOI: 10.1101 / gad.9.5.534

6. Канго-Сингх М. Шарпей опосредует остановку пролиферации клеток во время роста имагинального диска у дрозофилы. Разработка . 2002. 129 (24): 5719–5730.

7. Тапон Н., Харви К.Ф., Белл Д.В. и др. salvador способствует как выходу из клеточного цикла, так и апоптозу у дрозофилы и мутирует в линиях раковых клеток человека. Ячейка . 2002. 110 (4): 467–478.

8. Харви К.Ф., Пфлегер К.М., Харихаран И.К. Ортолог Mst дрозофилы, гиппопотам, ограничивает рост и пролиферацию клеток и способствует апоптозу. Ячейка . 2003. 114 (4): 457–467.

9. Панталаччи С., Тапон Н., Леопольд П. Партнер Сальвадора Гиппо способствует апоптозу и выходу из клеточного цикла у дрозофилы. Нат Клетка Биол . 2003. 5 (10): 921–927. DOI: 10.1038 / ncb1051

10. Wu S, Huang J, Dong J, Pan D. Hippo кодирует протеинкиназу семейства Ste-20, которая ограничивает пролиферацию клеток и способствует апоптозу в сочетании с Salvador и бородавками. Ячейка . 2003. 114 (4): 445–456.

11. Lai ZC, Wei X, Shimizu T, et al. Контроль пролиферации клеток и апоптоза с помощью моб в качестве супрессора опухолей, матов. Ячейка . 2005. 120 (5): 675–685. DOI: 10.1016 / j.cell.2004.12.036

12. Zhang L, Ren F, Zhang Q, Chen Y, Wang B., Jiang J. Семейство TEAD / TEF зубчатых транскрипционных факторов опосредует передачу сигналов Hippo в контроле размера органов. Dev Cell . 2008. 14 (3): 377–387. DOI: 10.1016 / j.devcel.2008.01.006

13.Го Т., Лу И, Ли П и др. Новый партнер гребешков регулирует передачу сигналов гиппопотама посредством противодействия активности гребешков-йорков. Ячейка Res . 2013. 23 (10): 1201–1214. DOI: 10.1038 / cr.2013.120

14. Томпсон Б.Дж., Коэн С.М. Путь Hippo регулирует микроРНК bantam, чтобы контролировать пролиферацию клеток и апоптоз у дрозофилы. Ячейка . 2006. 126 (4): 767–774. DOI: 10.1016 / j.cell.2006.07.013

15. Судол М. Yes-ассоциированный белок (YAP65) представляет собой богатый пролином фосфопротеин, который связывается с доменом Sh4 продукта протоонкогена Yes. Онкоген . 1994. 9 (8): 2145–2152.

16. Yu FX, Zhao B, Guan KL. Путь бегемота в контроле размера органов, гомеостазе тканей и раке. Ячейка . 2015; 163 (4): 811–828. DOI: 10.1016 / j.cell.2015.10.044

17. Fu V, Plouffe SW, Guan KL. Путь бегемота в развитии органов, гомеостазе и регенерации. Curr Opin Cell Biol . 2017; 49: 99–107. DOI: 10.1016 / j.ceb.2017.12.012

18. Piccolo S, Dupont S, Cordenonsi M. Биология YAP / TAZ: передача сигналов бегемота и не только. Physiol Ред. . 2014. 94 (4): 1287–1312. DOI: 10.1152 / Physrev.00005.2014

19. Чжао Б., Туманэн К., Гуань К.Л. Путь Hippo в контроле размера органов, регенерации тканей и самообновлении стволовых клеток. Нат Клетка Биол . 2011; 13 (8): 877–883. DOI: 10.1038 / ncb2303

20. Hong AW, Meng Z, Guan KL. Путь бегемота в регенерации кишечника и заболеваниях. Нат Рев Гастроэнтерол Гепатол . 2016; 13 (6): 324–337. DOI: 10.1038 / nrgastro.2016.59

21. Чан Э. Х., Нусиайнен М., Чаламаласетти Р. Б., Шафер А., Нигг Э. А., Силле Х. Х.Ste20-подобная киназа Mst2 активирует киназу Lats1, супрессор больших опухолей человека. Онкоген . 2005. 24 (12): 2076–2086. DOI: 10.1038 / sj.onc.1208445

22. Hwang E, Ryu KS, Paakkonen K, et al. Структурное понимание димерного взаимодействия доменов SARAH из белков семейства Mst1 и RASSF в пути апоптоза. Proc Natl Acad Sci U S A . 2007. 104 (22): 9236–9241. DOI: 10.1073 / pnas.0610716104

23. Ni L, Zheng Y, Hara M, Pan D, Luo X. Структурная основа Mob1-зависимой активации каскада ядер киназы Mst-Lats в передаче сигналов Hippo. Genes Dev . 2015; 29 (13): 1416–1431. DOI: 10.1101 / gad.264929.115

24. Хао Й, Чун А., Чунг К., Рашиди Б., Ян X. Подавитель опухоли LATS1 является негативным регулятором онкогена YAP. Дж. Биол. Хим. . 2008. 283 (9): 5496–5509. DOI: 10.1074 / jbc.M7000

25. Шумахер Б., Скварчинска М., Роуз Р., Оттманн С. Структура фосфопептидного комплекса 14-3-3 сигма-YAP при разрешении 1,15 А. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun . 2010; 66 (Pt 9): 978–984.DOI: 10.1107 / S17443025479

26. Чжао Б., Ли Л., Туманэн К., Ван С.Й., Гуань К.Л. Скоординированное фосфорилирование Lats и CK1 регулирует стабильность YAP через SCF (бета-TRCP). Genes Dev . 2010. 24 (1): 72–85. DOI: 10.1101 / gad.1843810

27. Го Л., Тэн Л. ЯП / ТАЗ для лечения рака: возможности и проблемы (обзор). Инт Дж. Онкол . 2015; 46 (4): 1444–1452. DOI: 10.3892 / ijo.2015.2877

28. Zhao B, Ye X, Yu J, et al. TEAD опосредует YAP-зависимую индукцию гена и контроль роста. Genes Dev . 2008. 22 (14): 1962–1971. DOI: 10.1101 / gad.1664408

29. Lei QY, Zhang H, Zhao B, et al. TAZ способствует пролиферации клеток и эпителиально-мезенхимальному переходу и ингибируется путем гиппопотама. Mol Cell Biol . 2008. 28 (7): 2426–2436. DOI: 10.1128 / MCB.01874-07

30. Ламар Дж. М., Стерн П., Лю Х., Шиндлер Дж. В., Цзян З. Г., Хайнс Р. О.. Мишень пути Hippo, YAP, способствует метастазированию через домен взаимодействия TEAD. Proc Natl Acad Sci U S A .2012; 109 (37): E2441–50. DOI: 10.1073 / pnas.1212021109

31. Komuro A, Nagai M, Navin NE, Sudol M. WW-домен, содержащий белок YAP, ассоциируется с ErbB-4 и действует как активатор котранскрипции для карбоксиконцевого фрагмента ErbB-4, который перемещается в ядро. Дж. Биол. Хим. . 2003. 278 (35): 33334–33341. DOI: 10.1074 / jbc. M305597200

32. Murakami M, Nakagawa M, Olson EN, Nakagawa O. Белок домена WW TAZ является критическим коактиватором TBX5, фактора транскрипции, участвующего в синдроме Холта-Орама. Proc Natl Acad Sci U S A . 2005. 102 (50): 18034–18039. DOI: 10.1073 / pnas.050

02

33. Мандерфилд Л.Дж., Энглека К.А., Агаджанян Х. и др. Pax3 и передача сигналов от гиппопотама координируют экспрессию гена меланоцитов в нервном гребне. Cell Rep . 2014; 9 (5): 1885–1895. DOI: 10.1016 / j.celrep.2014.10.061

34. Halder G, Johnson RL. Передача сигналов бегемота: контроль роста и не только. Разработка . 2011; 138 (1): 9–22. DOI: 10.1242 / dev.045500

35. Чжао Б., Ли Л., Лей Ц., Гуань К.Л.Путь Hippo-YAP в контроле размера органов и туморогенезе: обновленная версия. Genes Dev . 2010. 24 (9): 862–874. DOI: 10.1101 / gad.10

36. Ким М., Ким Т., Джонсон Р.Л., Лим Д.С. Транскрипционная корепрессорная функция трансдукторов пути гиппопотама YAP и TAZ. Cell Rep . 2015; 11 (2): 270–282. DOI: 10.1016 / j.celrep.2015.03.015

37. Харви К.Ф., Чжан X, Томас Д.М. Путь бегемота и рак человека. Нат Рев Рак . 2013. 13 (4): 246–257. DOI: 10.1038 / nrc3458

38. Yu FX, Zhao B, Panupinthu N, et al. Регуляция пути Hippo-YAP с помощью передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками. Ячейка . 2012; 150 (4): 780–791. DOI: 10.1016 / j.cell.2012.06.037

39. Уэбб С., Упадхьяй А., Джунтини Ф. и др. Структурные особенности и лиганд-связывающие свойства тандемных WW-доменов из YAP и TAZ, ядерных эффекторов пути Hippo. Биохимия . 2011. 50 (16): 3300–3309. DOI: 10.1021 / bi2001888

40. Эрнст А., Эпплтон Б. А., Иварссон Ю. и др.Структурный портрет семейства доменов PDZ. Дж Мол Биол . 2014. 426 (21): 3509–3519. DOI: 10.1016 / j.jmb.2014.08.012

41. Schlegelmilch K, Mohseni M, Kirak O, et al. Yap1 действует ниже альфа-катенина, чтобы контролировать распространение эпидермиса. Ячейка . 2011. 144 (5): 782–795. DOI: 10.1016 / j.cell.2011.02.031

42. Сюй СМ, Лю У.В., Лю СиДжей, Вэнь Си, Лу Х.Ф., Ван Ф.С. Сверхэкспрессия Mst1 подавляла рост немелкоклеточного рака легкого человека in vitro и in vivo. Cancer Gene Ther .2013. 20 (8): 453–460. DOI: 10.1038 / cgt.2013.40

43. Bai H, Zhang N, Xu Y, et al. Да-ассоциированный белок регулирует реакцию печени после перевязки желчных протоков. Гепатология . 2012. 56 (3): 1097–1107. DOI: 10.1002 / hep.25769

44. Анакк С., Бхосале М., Шмидт В.А., Джонсон Р.Л., Файнголд М.Дж., Мур Д.Д. Желчные кислоты активируют YAP, способствуя канцерогенезу в печени. Cell Rep . 2013. 5 (4): 1060–1069. DOI: 10.1016 / j.celrep.2013.10.030

45. Чжан В., Коэн С.М. Путь Hippo действует через p53 и микроРНК, чтобы контролировать пролиферацию и экспрессию проапоптотических генов во время роста ткани. Biol Open . 2013. 2 (8): 822–828. DOI: 10.1242 / bio.20134317

46. Бай Х., Гайед М.Ф., Лам-Химлин Д.М. и др. Экспрессия Yes-ассоциированного белка модулирует экспрессию сурвивина при первичных злокачественных новообразованиях печени. Хум Патол . 2012. 43 (9): 1376–1385. DOI: 10.1016 / j.humpath.2011.12.001

47. Барри Э. Р., Морикава Т., Батлер Б. Л. и др. Ограничение роста стволовых клеток кишечника и регенеративный ответ YAP. Природа . 2013. 493 (7430): 106–110. DOI: 10.1038 / природа11693

48. Fujii M, Toyoda T, Nakanishi H, et al. TGF-бета взаимодействует с дефектами пути Hippo, чтобы стимулировать рост злокачественной мезотелиомы человека. J Exp Med . 2012. 209 (3): 479–494. DOI: 10.1084 / jem.20111653

49. Zhou D, Zhang Y, Wu H, et al. Протеинкиназы Mst1 и Mst2 сдерживают пролиферацию стволовых клеток кишечника и онкогенез толстой кишки путем ингибирования избытка Yes-ассоциированного белка (Yap). Proc Natl Acad Sci U S A . 2011; 108 (49): E1312 – E1320.DOI: 10.1073 / pnas.1110428108

50. Camargo FD, Gokhale S, Johnnidis JB, et al. YAP1 увеличивает размер органа и разрастает недифференцированные клетки-предшественники. Курр Биол . 2007. 17 (23): 2054–2060. DOI: 10.1016 / j.cub.2007.10.039

51. Heinemann A, Cullinane C, De Paoli-Iseppi R, et al. Ингибиторы HDAC синергетически вызывают апоптоз меланомы и подавляют передачу сигналов AKT и YAP. Онкотоваргет . 2015; 6 (25): 21507–21521. DOI: 10.18632 / oncotarget.4242

52.Lin Z, Zhou P, von Gise A, et al. Pi3kcb связывает сигнальные пути Hippo-YAP и PI3K-AKT, способствуя пролиферации и выживанию кардиомиоцитов. Circ Res . 2015; 116 (1): 35–45. DOI: 10.1161 / CIRCRESAHA.115.304457

53. Лау А.Н., Кертис С.Дж., Филмор С.М. и др. Клетки, распространяющие опухоль, и активность Yap / Taz способствуют прогрессированию и метастазированию опухоли легких. Эмбо J . 2014; 33 (5): 468–481. DOI: 10.1002 / embj.201386082

54. Перра А., Ковалик М.А., Гисо Э. и др. Активация YAP является ранним событием и потенциальной терапевтической мишенью при развитии рака печени. Дж Гепатол . 2014. 61 (5): 1088–1096. DOI: 10.1016 / j.jhep.2014.06.033

55. Xia Y, Chang T, Wang Y, et al. YAP способствует онкогенезу раковых клеток яичников и указывает на плохой прогноз для пациентов с раком яичников. PLoS One . 2014; 9 (3): e91770. DOI: 10.1371 / journal.pone.0091770

56. Wu Q, Li J, Sun S, et al. YAP / TAZ-опосредованная активация метаболизма серина и регуляция метилирования имеет решающее значение для прогрессирования рака молочной железы с дефицитом LKB1. Biosci Rep .2017; 37 (5): BSR20171072. DOI: 10.1042 / BSR20171072

57. Zhou GX, Li XY, Zhang Q, et al. Эффекты сигнального пути бегемота при раке желудка человека. Asian Pac J Cancer Prev . 2013. 14 (9): 5199–5205.

58. Wang Y, Xie C, Li Q, Xu K, Wang E. Клиническое и прогностическое значение Yes-ассоциированного белка при колоректальном раке. Биол опухолей . 2013. 34 (4): 2169–2174. DOI: 10.1007 / s13277-013-0751-x

59. Дебони М., Санчес-Данес А., Рорив С. и др.YAP и TAZ необходимы для инициации базальноклеточного и плоскоклеточного рака. EMBO Rep . 2018; 19: 7. DOI: 10.15252 / embr.201845809

60. Maglic D, Schlegelmilch K, Dost AF, et al. Передача сигналов YAP-TEAD способствует развитию базальноклеточной карциномы через ось c-JUN / AP1. Эмбо J . 2018; 37: 17. DOI: 10.15252 / embj.201798642

61. Акладиос Б., Мендоса Рейносо В., Каин Дж. Э. и др. Положительные регуляторные взаимодействия между передачей сигналов YAP и Hedgehog в гомеостазе кожи и развитии BCC в коже мышей in vivo. PLoS One . 2017; 12 (8): e0183178. DOI: 10.1371 / journal.pone.0183178

62. Quan T, Xu Y, Qin Z, et al. Повышенный YAP и его нижестоящий нацелены на CCN1 и CCN2 в базально-клеточной карциноме: влияние на пролиферацию кератиноцитов и активацию стромальных клеток. Ам Дж. Патол . 2014. 184 (4): 937–943. DOI: 10.1016 / j.ajpath.2013.12.017

63. Guo P, Kang S, Zhao F. Высокая экспрессия TAZ / YAP способствует прогрессированию злокачественной меланомы и влияет на послеоперационную выживаемость пациентов. Аптека . 2018. 73 (11): 662–665. DOI: 10.1691 / ph.2018.8499

64. Xiong H, Yu Q, Gong Y, et al. Да-ассоциированный белок (YAP) способствует онкогенезу в клетках меланомы за счет стимуляции белка 1, связанного с рецепторами липопротеинов низкой плотности (LRP1). Научная репутация . 2017; 7 (1): 15528. DOI: 10.1038 / s41598-017-14764-4

65. Ким М.Х., Ким С.Г., Ким С.К. и др. YAP-индуцированная экспрессия PD-L1 вызывает уклонение от иммунитета в BRAFi-устойчивой меланоме. Cancer Immunol Res .2018. doi: 10.1158 / 2326-6066.CIR-17-0320

66. Sambandam SAT, Kasetti RB, Xue L, Dean DC, Lu Q, Li Q. 14-3-3sigma регулирует пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, модулируя клеточную локализацию Yap1. Дж Инвест Дерматол . 2015; 135 (6): 1621–1628. DOI: 10.1038 / jid.2015.42

67. Эльбедиви А., Винсент-Мистиан З.И., Спенсер-Дене Б. и др. Передача сигналов интегринов регулирует YAP и TAZ, чтобы контролировать гомеостаз кожи. Разработка . 2016; 143 (10): 1674–1687. DOI: 10.1242 / дев.133728

68. Jia J, Li C, Luo S, et al. Да-ассоциированный белок способствует развитию плоскоклеточного рака кожи человека через активацию RAS. Дж Инвест Дерматол . 2016; 136 (6): 1267–1277. DOI: 10.1016 / j.jid.2016.02.005

69. Li Y, Kong F, Wang J, et al. Индукция S100A7 подавляется YAP через путь Hippo в клетках A431. Онкотоваргет . 2016; 7 (25): 38133–38142. DOI: 10.18632 / oncotarget.9477

70. Li Y, Kong F, Shao Q, et al.Активность подавляется S100A7 посредством p65 / NFkappaB-опосредованной репрессии DeltaNp63. Mol Cancer Res . 2017; 15 (12): 1752–1763. DOI: 10.1158 / 1541-7786.MCR-17-0349

71. Торре Л.А., Брей Ф., Сигель Р.Л., Ферли Дж., Лорте-Тьелент Дж., Джемаль А. Глобальная статистика рака, 2012. CA Cancer J Clin . 2015; 65 (2): 87–108. DOI: 10.3322 / caac.21262

72. Ямана Х. Молекулярная биология плоскоклеточного рака пищевода. Нихон Риншо . 2011; 69 (Приложение 6): 51–56.

73. Мурамацу Т., Имото И., Мацуи Т. и др. YAP является кандидатом онкогена для плоскоклеточного рака пищевода. Канцерогенез . 2011. 32 (3): 389–398. DOI: 10,1093 / carcin / bgq254

74. Йео М.К., Ким С.Х., Ким Дж.М. и др. Корреляция экспрессии фосфорилированного и нефосфорилированного Yes-ассоциированного белка с клинико-патологическими параметрами плоскоклеточного рака пищевода в корейской популяции. Anticancer Res . 2012. 32 (9): 3835–3840.

75.Ge L, Smail M, Meng W. и др. Да-ассоциированная экспрессия белка в узловых метастазах плоскоклеточной карциномы головы и шеи. PLoS One . 2011; 6 (11): e27529. DOI: 10.1371 / journal.pone.0027529

76. Салади С.В., Росс К., Караайваз М. и др. ACTL6A коамплифицируется с p63 в плоскоклеточной карциноме, чтобы управлять активацией YAP, регенеративной пролиферацией и плохим прогнозом. Раковые клетки . 2017; 31 (1): 35–49. DOI: 10.1016 / j.ccell.2016.12.001

77. Ван Й, Герстен А., Молейриньо С., Ганн-Мур Ф. Дж., Рейнольдс П. А., Пристовский МБ.Фибробласты плоскоклеточного рака головы и шеи, связанные с периневральной инвазией, имеют высокую ядерную экспрессию Да-ассоциированного белка (YAP). Акад. Патол . 2015; 2 (4): 2374289515616972. DOI: 10.1177 / 2374289515616972

78. Вердучи Л., Феррайуоло М., Саккони А. и др. Онкогенная роль circPVT1 в плоскоклеточной карциноме головы и шеи опосредуется мутантным транскрипционно-компетентным комплексом p53 / YAP / TEAD. Биология генома . 2017; 18 (1): 237. DOI: 10.1186 / s13059-017-1368-y

79.Снайдерс А.М., Шмидт Б.Л., Фридлянд Дж. И др. Редкие ампликоны связаны с частым нарушением регуляции путей спецификации клеточных судеб при плоскоклеточной карциноме полости рта. Онкоген . 2005. 24 (26): 4232–4242. DOI: 10.1038 / sj.onc.1208601

80. Hiemer SE, Zhang L, Kartha VK, et al. YAP / TAZ-регулируемая молекулярная сигнатура связана с плоскоклеточной карциномой полости рта. Mol Cancer Res . 2015; 13 (6): 957–968. DOI: 10.1158 / 1541-7786.MCR-14-0580

81. Chen X, Gu W, Wang Q, et al.C-MYC и BCL-2 опосредуют регулируемый YAP онкогенез в OSCC. Онкотоваргет . 2018; 9 (1): 668–679. DOI: 10.18632 / oncotarget.23089

82. Wei Z, Wang Y, Li Z, et al. Сверхэкспрессия эффекторного ТАЗ пути Hippo в плоскоклеточной карциноме языка: корреляция с клинико-патологическими особенностями и прогнозом пациентов. Int J Stomatol Occlusion Med . 2013. 42 (10): 747–754. DOI: 10.1111 / jop.12062

83. Сильверберг С.Г., Иоффе О.Б. Патология рака шейки матки. Рак J .2003. 9 (5): 335–347.

84. Лю Т., Лю И, Гао Х, Мэн Ф, Ян С., Лу Г. Клиническое значение гиперэкспрессии да-ассоциированного белка при карциноме шейки матки: дифференциальные эффекты, основанные на гистотипах. Int J Гинекольный рак . 2013. 23 (4): 735–742. DOI: 10.1097 / IGC.0b013e31828c8619

85. Лю-Читтенден Ю., Хуанг Б., Шим Дж. С. и др. Генетическое и фармакологическое нарушение комплекса TEAD-YAP подавляет онкогенную активность YAP. Genes Dev . 2012. 26 (12): 1300–1305.DOI: 10.1101 / gad.192856.112

86. Brodowska K, Al-Moujahed A, Marmalidou A, et al. Клинически используемый фотосенсибилизатор вертепорфин (VP) ингибирует YAP-TEAD и рост клеток ретинобластомы человека in vitro без активации светом. Exp Eye Res . 2014; 124: 67–73. DOI: 10.1016 / j.exer.2014.04.011

87. Wang C, Zhu X, Feng W, et al. Вертепорфин подавляет функцию YAP за счет активации 14-3-3 сигма, секвестрирующей YAP в цитоплазме. Am J Cancer Res . 2016; 6 (1): 27–37.

88. Чжоу X, Ван З., Хуан В., Лэй Ц.Й. Рецепторы, сопряженные с G-белком: преодоление разрыва между внеклеточными сигналами и путём Hippo. Acta Biochim Biophys Sin (Шанхай) . 2015; 47 (1): 10–15. DOI: 10.1093 / abbs / gmu108

89. Liu G, Yu FX, Kim YC, et al. Вирус герпеса, связанный с саркомой Капоши, способствует онкогенезу, модулируя путь Hippo. Онкоген . 2015; 34 (27): 3536–3546. DOI: 10.1038 / onc.2014.281

90. Hsu YL, Hung JY, Chou SH, et al.Ангиомотин снижает прогрессирование рака легких за счет секвестрации онкогенных YAP / TAZ и снижения экспрессии Cyr61. Онкоген . 2015; 34 (31): 4056–4068. DOI: 10.1038 / onc.2014.333

91. Кан В., Хуанг Т., Чжоу Ю. и др. miR-375 участвует в пути Hippo, воздействуя на ось YAP1 / TEAD4-CTGF в канцерогенезе желудка. Смерть клетки . 2018; 9 (2): 92. DOI: 10.1038 / s41419-017-0134-0

% PDF-1.4 % 1 0 объект > эндобдж 8 0 объект /Заголовок /Предмет / Автор /Режиссер / Ключевые слова / CreationDate (D: 20211203115435-00’00 ‘) / CrossMarkDomains # 5B1 # 5D (www.tandfonline.com) / CrossmarkDomainExclusive (ложь) / CrossmarkMajorVersionDate (14 августа 2008 г.) / ModDate (D: 20160127102829 + 01’00 ‘) / PDFВерсия (1.4) / doi (10.1080 / 2162402X.2015.1051922) >> эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 объект > эндобдж 5 0 объект > ручей DOI: 10.1080 / 2162402X.2015.1051922application / pdf

Хиггс, Брэндон

10.1080 / 2162402X.2015.1051922 http://dx.doi.org/10.1080/2162402X.2015.10519222008-08-14true10.1080/2162402X.2015.1051922

www.tandfonline.com

10.1080 / 2162402X.2015.10519222008-08-14false

www.tandfonline.com

Microsoft® Word 20102015-05-27T16: 49: 23 + 05: 302016-01-27T10: 28: 29 + 01: 002016-01-27T10: 28: 29 + 01: 003-Heights (TM) PDF Security Shell 4.5. 24.1 (http://www.pdf-tools.com) 1.4uuid: 7ba8c1c5-afe3-4154-bd0c-a375408154b9uuid: 36a79495-ddb0-479e-b4ff-21039c27ffb4 конечный поток эндобдж 6 0 объект > эндобдж 7 0 объект > эндобдж 9 0 объект > эндобдж 10 0 объект > эндобдж 11 0 объект > эндобдж 12 0 объект > эндобдж 13 0 объект > эндобдж 14 0 объект > эндобдж 15 0 объект > эндобдж 16 0 объект > эндобдж 17 0 объект > эндобдж 18 0 объект > эндобдж 19 0 объект > эндобдж 20 0 объект > эндобдж 21 0 объект > эндобдж 22 0 объект > эндобдж 23 0 объект > эндобдж 24 0 объект > эндобдж 25 0 объект > эндобдж 26 0 объект > эндобдж 27 0 объект > эндобдж 28 0 объект > эндобдж 29 0 объект > эндобдж 30 0 объект > эндобдж 31 0 объект > эндобдж 32 0 объект > эндобдж 33 0 объект > эндобдж 34 0 объект > эндобдж 35 0 объект > эндобдж 36 0 объект > эндобдж 37 0 объект > эндобдж 38 0 объект > эндобдж 39 0 объект > эндобдж 40 0 объект > эндобдж 41 0 объект > эндобдж 42 0 объект > эндобдж 43 0 объект > эндобдж 44 0 объект > эндобдж 45 0 объект > эндобдж 46 0 объект > эндобдж 47 0 объект > эндобдж 48 0 объект > эндобдж 49 0 объект > эндобдж 50 0 объект > эндобдж 51 0 объект > эндобдж 52 0 объект > эндобдж 53 0 объект > эндобдж 54 0 объект > эндобдж 55 0 объект > эндобдж 56 0 объект > эндобдж 57 0 объект > эндобдж 58 0 объект > эндобдж 59 0 объект > эндобдж 60 0 объект > эндобдж 61 0 объект > эндобдж 62 0 объект > эндобдж 63 0 объект > эндобдж 64 0 объект > эндобдж 65 0 объект > эндобдж 66 0 объект > эндобдж 67 0 объект > эндобдж 68 0 объект > эндобдж 69 0 объект > эндобдж 70 0 объект > эндобдж 71 0 объект > эндобдж 72 0 объект > эндобдж 73 0 объект > эндобдж 74 0 объект > эндобдж 75 0 объект > эндобдж 76 0 объект > эндобдж 77 0 объект > эндобдж 78 0 объект > эндобдж 79 0 объект > эндобдж 80 0 объект > эндобдж 81 0 объект > эндобдж 82 0 объект > эндобдж 83 0 объект > эндобдж 84 0 объект > эндобдж 85 0 объект > эндобдж 86 0 объект > эндобдж 87 0 объект > эндобдж 88 0 объект > эндобдж 89 0 объект > эндобдж 90 0 объект > эндобдж 91 0 объект > эндобдж 92 0 объект > эндобдж 93 0 объект > эндобдж 94 0 объект > эндобдж 95 0 объект > эндобдж 96 0 объект > эндобдж 97 0 объект > эндобдж 98 0 объект > эндобдж 99 0 объект > эндобдж 100 0 объект > эндобдж 101 0 объект > эндобдж 102 0 объект > эндобдж 103 0 объект > эндобдж 104 0 объект > эндобдж 105 0 объект > эндобдж 106 0 объект > эндобдж 107 0 объект > эндобдж 108 0 объект > эндобдж 109 0 объект > эндобдж 110 0 объект > эндобдж 111 0 объект > эндобдж 112 0 объект > эндобдж 113 0 объект > эндобдж 114 0 объект > эндобдж 115 0 объект > эндобдж 116 0 объект > эндобдж 117 0 объект > эндобдж 118 0 объект > эндобдж 119 0 объект > эндобдж 120 0 объект > эндобдж 121 0 объект > эндобдж 122 0 объект > эндобдж 123 0 объект > эндобдж 124 0 объект > эндобдж 125 0 объект > эндобдж 126 0 объект > эндобдж 127 0 объект > эндобдж 128 0 объект > эндобдж 129 0 объект > эндобдж 130 0 объект > эндобдж 131 0 объект > эндобдж 132 0 объект > эндобдж 133 0 объект > эндобдж 134 0 объект > эндобдж 135 0 объект > эндобдж 136 0 объект > эндобдж 137 0 объект > эндобдж 138 0 объект > эндобдж 139 0 объект > эндобдж 140 0 объект > эндобдж 141 0 объект > эндобдж 142 0 объект > эндобдж 143 0 объект > эндобдж 144 0 объект > эндобдж 145 0 объект > эндобдж 146 0 объект > эндобдж 147 0 объект > эндобдж 148 0 объект > эндобдж 149 0 объект > эндобдж 150 0 объект > эндобдж 151 0 объект > эндобдж 152 0 объект > эндобдж 153 0 объект > эндобдж 154 0 объект > эндобдж 155 0 объект > эндобдж 156 0 объект > эндобдж 157 0 объект > эндобдж 158 0 объект > эндобдж 159 0 объект > эндобдж 160 0 объект > эндобдж 161 0 объект > эндобдж 162 0 объект > эндобдж 163 0 объект > эндобдж 164 0 объект > эндобдж 165 0 объект > эндобдж 166 0 объект > эндобдж 167 0 объект > эндобдж 168 0 объект > эндобдж 169 0 объект > эндобдж 170 0 объект > эндобдж 171 0 объект > эндобдж 172 0 объект > эндобдж 173 0 объект > эндобдж 174 0 объект > эндобдж 175 0 объект > эндобдж 176 0 объект > эндобдж 177 0 объект > эндобдж 178 0 объект > эндобдж 179 0 объект > эндобдж 180 0 объект > эндобдж 181 0 объект > эндобдж 182 0 объект > эндобдж 183 0 объект > эндобдж 184 0 объект > эндобдж 185 0 объект > эндобдж 186 0 объект > эндобдж 187 0 объект > эндобдж 188 0 объект > эндобдж 189 0 объект > эндобдж 190 0 объект > эндобдж 191 0 объект > эндобдж 192 0 объект > эндобдж 193 0 объект > эндобдж 194 0 объект > эндобдж 195 0 объект > эндобдж 196 0 объект > эндобдж 197 0 объект > эндобдж 198 0 объект > эндобдж 199 0 объект > эндобдж 200 0 объект > эндобдж 201 0 объект > эндобдж 202 0 объект > эндобдж 203 0 объект > эндобдж 204 0 объект > эндобдж 205 0 объект > эндобдж 206 0 объект > эндобдж 207 0 объект > эндобдж 208 0 объект > эндобдж 209 0 объект > эндобдж 210 0 объект > эндобдж 211 0 объект > эндобдж 212 0 объект > эндобдж 213 0 объект > эндобдж 214 0 объект > эндобдж 215 0 объект > эндобдж 216 0 объект > эндобдж 217 0 объект > эндобдж 218 0 объект > эндобдж 219 0 объект > эндобдж 220 0 объект > эндобдж 221 0 объект > эндобдж 222 0 объект > эндобдж 223 0 объект > эндобдж 224 0 объект > эндобдж 225 0 объект > эндобдж 226 0 объект > эндобдж 227 0 объект > эндобдж 228 0 объект > эндобдж 229 0 объект > эндобдж 230 0 объект > эндобдж 231 0 объект > эндобдж 232 0 объект > эндобдж 233 0 объект > эндобдж 234 0 объект > эндобдж 235 0 объект > эндобдж 236 0 объект > эндобдж 237 0 объект > эндобдж 238 0 объект > эндобдж 239 0 объект > эндобдж 240 0 объект > эндобдж 241 0 объект > эндобдж 242 0 объект > эндобдж 243 0 объект > эндобдж 244 0 объект > эндобдж 245 0 объект > эндобдж 246 0 объект > эндобдж 247 0 объект > эндобдж 248 0 объект > эндобдж 249 0 объект > эндобдж 250 0 объект > эндобдж 251 0 объект > эндобдж 252 0 объект > эндобдж 253 0 объект > эндобдж 254 0 объект > эндобдж 255 0 объект > эндобдж 256 0 объект > эндобдж 257 0 объект > эндобдж 258 0 объект > эндобдж 259 0 объект > эндобдж 260 0 объект > эндобдж 261 0 объект > эндобдж 262 0 объект > эндобдж 263 0 объект > эндобдж 264 0 объект > эндобдж 265 0 объект > эндобдж 266 0 объект > эндобдж 267 0 объект > эндобдж 268 0 объект > эндобдж 269 ​​0 объект > эндобдж 270 0 объект > эндобдж 271 0 объект > эндобдж 272 0 объект > эндобдж 273 0 объект > эндобдж 274 0 объект > эндобдж 275 0 объект > эндобдж 276 0 объект > эндобдж 277 0 объект > эндобдж 278 0 объект > эндобдж 279 0 объект > эндобдж 280 0 объект > эндобдж 281 0 объект > эндобдж 282 0 объект > эндобдж 283 0 объект > эндобдж 284 0 объект > эндобдж 285 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageB / ImageI] >> эндобдж 286 0 объект > ручей x ڝ X͎6) H ~ 6E {EN} גͤ E ~ $? QN ~ rO% L% ‘~ / Ӈ ~ q: K) WbD ޹ sÙP.