Мартинка стоматология отзывы: Детская стоматологическая клиника «Мартинка» (Доктор Мартин) — 4 врача, 56 отзывов | Москва

Буллезный пемфигоид

Мы провели метаанализ, чтобы найти потенциальную связь между LP и HCV, включая все исследования в ранее опубликованных метаанализах [136–138] и новые исследования [139–143], в которых изучалась распространенность HCV у пациентов с LP. по сравнению с контрольной популяцией.Согласно объединению данных 64 исследований, у пациентов с LP в 5,58 раз больше шансов иметь сопутствующую инфекцию HCV, чем в контрольной популяции (95% ДИ: 3,72–8,38).

В попытке исследовать роль HPV в патогенезе OLP Syrjänen et al. [144] провели метаанализ. Они обнаружили статистически значимые и значимые отношения шансов для ВПЧ в целом и ВПЧ-16 (5,12 (95% ДИ: 2,40–10,93) и 5,61 (95% ДИ: 2,42–12,99), соответственно). Это открытие предполагает, что ВПЧ имеет более высокую распространенность среди пациентов с OLP, чем в нормальной популяции; он может играть роль в злокачественной трансформации очагов OLP [145].Эрозивный OLP и гипертрофический CLP рассматриваются как основные подтипы со злокачественным потенциалом [20, 146].

Систематический поиск выявил три исследования [189–191], в которых сравнивалась распространенность передаваемого при переливании вируса или теновируса Torque (TTV) у LP по сравнению с пациентами из контрольной группы или здоровыми добровольцами. TTV — единственный представитель Anelloviridae [192]. После выполнения метаанализа с использованием двух исследований [190, 191] не было существенной разницы между LP и здоровыми контрольными группами (отношение шансов 1.13 [95% ДИ: 0,67–1,89],). Fehér et al. [190] недавно показали, что TTV геногруппы 1, а не TTV в целом, значительно чаще встречается у пациентов с OLP (10,1%) по сравнению с контрольной группой (1,4%). Эта группа предположила, что TTV геногруппы 1 коррелирует с иммуновоспалительным ответом у пациентов с OLP. Они также оценили подтипы и генотипы TTV у вышеупомянутых пациентов и отметили некоторые различия в поражениях OLP и образцах нормальной кожи у одних и тех же пациентов [193].

В то время как вирус ветряной оспы редко встречается у пациентов с OLP [194, 195], недавнее исследование отметило значительную роль вируса в zosteriform LP, но не в линейном LP [196].

Пациенты с LP имеют повышенный риск развития дислипидемии с скорректированным отношением шансов 2,85 (95% ДИ 1,33–5,09;) [197]. Однако пациенты с гипергликемией и / или артериальной гипертензией не входят в группу риска [197].

5. Качество жизни

Анкеты качества жизни — это простые и практичные инструменты для количественной оценки воздействия болезни на основе восприятия пациента. Существует большое количество общих и связанных с дерматологией вопросников качества жизни, включая Индекс качества жизни дерматологов (DLQI), который является широко используемым инструментом качества жизни для конкретных дерматологов [276].LP был сопоставим с псориазом по индексу качества жизни дерматологов (DLQI) 9,60 ± 7,32 против 9,50 ± 6,10, соответственно. Кроме того, пациенты с OLP имели значительно более высокий показатель DLQI по сравнению с пациентами с CLP (13,27 ± 8,05 против 7,47 ± 6,11) [277]. Профиль воздействия на здоровье полости рта (OHIP) — это опросник по качеству жизни из 49 пунктов для оценки социального воздействия заболеваний полости рта, основанный на теоретической иерархии результатов для здоровья полости рта [278]. Было обнаружено, что OLP оказывает значительное влияние на психологический дискомфорт и социальную инвалидность, используя опросник OHIP, состоящий из 49 пунктов [279].Кроме того, OLP, по-видимому, оказывает большее влияние на качество жизни пациентов, чем рецидивирующий афтозный стоматит, но меньшее влияние по сравнению с буллезными заболеваниями полости рта [280]. Также существует корреляция между усилением боли, оцениваемой по шкале визуальных аналогов, и плохим качеством жизни, связанным со здоровьем полости рта, у пациентов с LP [281]. Пациенты с эрозивным OLP или генерализованным LP могут иметь плохое качество жизни из-за связанной с ними боли и дискомфорта.

5.1. Прогноз

Обычно поражения ХЛП разрешаются в течение от 6 месяцев до года.Однако гипертрофический вариант, если его не лечить, имеет тенденцию сохраняться годами. Нелеченый ретикулярный OLP имеет хронический или прогрессирующий характер, обычно без полного разрешения. LP также может иметь повторяющийся паттерн. Пациенты с эрозивной LP могут испытывать изменения в локализации и тяжести заболевания с нарастанием и убыванием циклов одновременного заживления и формирования поражения. Хотя генерализованный LP имеет тенденцию к заживлению быстрее, чем другие варианты, у него более высокая вероятность рецидива [2]. LPP может прогрессировать по своему течению с разрушением волосяных фолликулов, что приводит к атрофической рубцовой алопеции [43].

5.2. Канцерогенная трансформация

Канцерогенный потенциал поражений OLP был давней темой дискуссий. Когда потеря гетерозиготности и микросателлитная нестабильность были исследованы как два основных показателя злокачественной трансформации, OLP не отличался от доброкачественной фибромы, но значительно отличался от дисплазии полости рта низкой степени, дисплазии полости рта высокой степени и SCC полости рта [282 ]. Vered et al. ясно предположил широко распространенный провоспалительный ответ, а не протуморигенный ответ [283].Подобно другим злокачественным новообразованиям, пожилые люди подвержены повышенному риску развития SCC [284] и, как правило, имеют более тяжелые формы заболевания [285].

Эпидемиология OLP и присущий ему риск плоскоклеточного рака полости рта остается плохо определенным. Вопрос, на который еще предстоит ответить, заключается в том, является ли связанный риск злокачественной трансформации внутренним признаком поражений OLP или результатом иммунного ответа пациента или генетического фона. Не существует надлежащего суррогатного биомаркера злокачественной трансформации OLP.Shi et al. предположили, что совместная экспрессия подопланина и переносчика АТФ-кассеты G2 (ABCG2) является более высоким прогностическим маркером со значительным отношением шансов (25,24, 95% ДИ: 4,48–142,27) [284]. К сожалению, подопланин не является чувствительным или специфическим, так как он может экспрессироваться даже в нормальной коже [286]. Кроме того, ABCG2 экспрессируется в различных органах и играет важную роль в восстановлении тканей [287] в дополнение к химиорезистентности различных опухолей [288]. Другой маркер, c-Jun, член семейства активирующих факторов транскрипции протеина-1, присутствовал у 11 из 12 пациентов с LP и у всех пациентов с SCC, в то время как у нормальных пациентов он не экспрессировался заметно. Эти факторы транскрипции способствуют пролиферации клеток и, таким образом, могут указывать на канцерогенный потенциал LP [289]. Эти отчеты следует интерпретировать с осторожностью из-за небольшого размера выборки и отсутствия перспективного последующего наблюдения. Литература по-прежнему не дает окончательных выводов в этом отношении, за исключением того факта, что кажется невероятным, что OLP по своей природе канцерогенен [290].

Частота злокачественной трансформации LP вульвы и LP пищевода составляет 1,1% [73] и 5,5% [76] соответственно.В когортном исследовании без здорового контроля и без корректировки отношения шансов для предраковых вирусных заболеваний у 8 из 327 пациентов с OLP (2,4%) развился оральный SCC в ранее пораженных областях. Интересно, что это не коррелировало с иммуносупрессивной терапией у этих пациентов [291]. Коэффициент трансформации поражений OLP варьируется от 0,8% в американской популяции [20] до более 5% в итальянской когорте [292]. Это соотношение не превышает 1% для OLP в течение 5 лет [293]. Тем не менее, этот оценочный показатель не соответствует распространенности OLP и рака полости рта.Действительно, распространенность OLP 1% и скорость трансформации 0,2% в год означают, что почти каждый пероральный SCC должен возникать в результате поражения OLP. Следовательно, эта теория была опровергнута, поскольку у пациентов с ПКР полости рта было обнаружено несколько сопутствующих поражений OLP [293–296]. Дальнейшее исследование того, является ли хроническая LP предраковым заболеванием, потребует крупномасштабных проспективных когортных исследований с долгосрочным периодом наблюдения.

6. Выводы

LP является заболеванием, опосредованным Т-клетками. Распространенность LP составляет менее 5% без явной сексуальной склонности.Хронический и часто эрозивный характер ЛП может иметь пагубные последствия для качества жизни пациентов. Эрозивно-язвенные поражения OLP имеют тенденцию становиться болезненными и хроническими, а LP вульвы может мешать половому акту и может быть связана со значительными психологическими и физическими заболеваниями. ВГС и ВПЧ более распространены у пациентов с LP по сравнению с нормальной популяцией. Канцерогенный потенциал поражений OLP остается дискуссионным.

Сокращения

Конфликт интересов

Конфликт интересов отсутствует.

Благодарности

Авторы искренне благодарят доктора Джона Харриса за его ценные исправления. Они действительно признательны доктору Питеру Линчу и доктору Омиду Заргари за предоставленные фотографии для этой рукописи. Они также хотели бы поблагодарить доктора Ирину Лейкину за ее вклад в перевод русской литературы.

Отзывы клиентов AutoNation Volkswagen Spokane Valley, WA

Беги, не уходи от этого дилера. Продавец, Кам, был очень дружелюбным и оставил хорошее впечатление, пока не пришло время заплатить за машину, которую я решил купить.Я отложил примерно 1/3 и сказал им, что хотят выплатить остаток в течение 5-10 дней, поскольку это необходимо, чтобы переместить немного денег, чтобы заплатить за это. Они не держали чек в течение нескольких дней, пока я не позвонил им и не попросил внести депозит. Сказал, что я должен заполнить все финансовые документы. в любом случае. Сказал им, что продал акции и мне нужно их рассчитаться, чтобы перевести деньги на мой текущий счет, а это займет 4-5 дней, продал акции в понедельник. Вернулся через 3 дня, чтобы расплатиться, и мне сказали, что я не могу. так как они отправили документы в банк, но ОНИ НЕ МОГУТ СКАЗАТЬ МНЕ, В КОТОРОЙ БАНК ЭТО ПОЕХАЛО, так что я мог пойти туда и оплатить 70-мильную поездку в один конец, потраченную зря.Все еще жду, когда они скажут мне, в каком банке и где расплачиваться. Купил его во вторник вечером, попытался расплатиться в пятницу утром. Мне сказали, что они свяжутся со мной, как только узнают, куда он пошел. Было утро пятницы, а теперь вторник, полдень, по-прежнему ни слова Они продолжали рекламировать тот факт, что это «сертифицированный подержанный автомобиль» и что мне пришлось пройти тщательный осмотр — одна из причин, по которой я купил машину и передал другую идентичную машину с пробегом на 10 000 миль меньше по той же цене. Последний документ, который мне дал финансовый специалист, был «как есть» без гарантии, затем он сказал, что у него 60-дневная гарантия.Сертифицированная гарантия VW включает 2 года гарантии на 24 000 миль. Так что я был введен в заблуждение, ВЕРОЯТНО, МОЙ ПЛОХО, ЗА НЕ ЗАДАВАЕМ ДОСТАТОЧНЫХ ВОПРОСОВ Их сертифицировано НЕ СЕРТИФИЦИРОВАНО VW, так что остерегайтесь этого маленького предмета. Моя следующая машина будет от Дэйва Смита, который будет держать чек в течение нескольких дней, и с ним так же дружелюбно и легко иметь дело, как с Auto Nation, Они действительно держали чек в течение 3 дней, пока я не позвонил им, чтобы сдать депозит, они готовы пойти немного дальше, чем Auto Nation, чтобы сделать клиента счастливым. Auto Nation оправдывается тем, что они слишком большие, так что думаю, они такие большие, что им больше не нужен мой бизнес.Каждый отрицательный отзыв GM советует позвонить ему на этот форум и сообщить его номер телефона. Номер для компьютерного справочника, а не для личного пользования. оставил голосовую почту, не получил обратного звонка, поэтому, очевидно, не очень заинтересован в решении проблем, например, надеясь, что ему никто не позвонит, то же самое и в финансовом отделе. Вот это объявление через неделю. Я до сих пор не знаю, где я могу расплатиться за машину. График времени, 15 ноября, пт, вторник, ночь. Купленный автомобиль потратил 6500 долларов на 14 997 VW Passat 18 ноября. Пт. Утром пытался расплатиться, мне сказали, что я не могу, так как документы уже отправлены в банк.Они сразу же отправляют все документы, так как они такие большие. Мне сказали, что они пришлют мне электронное письмо с информацией о банке, я могу пойти и расплатиться. Поскольку они не знали, куда это делось, Трудно в это поверить. Ни в коем случае они не знают, куда это делось. 21 ноября, в понедельник вечером, все еще не были уведомлены. 22 ноября, вторник, утром, пытался дозвониться до генерального менеджера, который разместил свой номер на странице обзора в Facebook. Возьмите компьютер и спросите, как мне направить звонок. Наконец, подключитесь к голосовой почте для GM, в которой говорится, что его нет в офисе с 17 ноября по 20 ноября и он вернется в понедельник 21 ноября, поэтому оставьте мой номер и дождитесь обратного звонка. Похоже, он разместил свой номер в Facebook, чтобы попытаться сделать вид, будто он заботится и надеется, что никто не попытается позвонить ему, 22 ноября, вторник, днем ​​попытаться позвонить в финансовый отдел, сказал только одному человеку, и он был занят, снова оставил голосовое сообщение. 23 ноября, до сих пор нет обратного звонка от GM или Финансов, так что бросаем и публикуем этот обзор. Рейтинг с 5 звезд снизился до 1 звезды (без звезды) за одну неделю из-за отсутствия обслуживания клиентов, честности и отсутствия общения, так что снова бегите, не уходите .. 13 декабря. Через 10 минут после публикации выше.Не знаю, было ли это результатом публикации или проблем с администратором из-за того, что телефонные звонки не были возвращены, и не с кем поговорить. Сегодня 13 декабря был первый день, когда машину удалось погасить в кредитном союзе. Autonation так спешила выбросить бумагу, что Credit Union пришлось вернуть ее им в первый раз, потому что документы не были завершены. Кредитный союз профинансировал ссуду 13 декабря. Я выплатил ее 13 декабря и в итоге заплатил дополнительно 32 доллара за привилегию. Совершил 3 поездки в Спокан и окупился за 3-ю поездку.после нескольких телефонных звонков, чтобы узнать, получили ли они документы и профинансировали ли ссуду. Однако обратный выкуп Diesel прошел гладко и легко, и средства были на моем счете утром во вторник после оформления документов в субботу 10 декабря. Покупка не зависела от завершения обратного выкупа, как и средства для независимой оплаты покупки Passat на замену Diesel Jetta TDI.

(PDF) Полимерные носители для систем доставки при лечении хронических заболеваний пародонта

Полимеры 2020,12, 1574 16 из 21

4.

Lim, S.Y .; Dafydd, M .; Ong, J .; Ord-McDermott, L .; Борд-Дэвис, Э .; Пески, К .; Уильямс, Д .; Sloan, A .;

Херд, К.М. Мукоадгезивные тонкие пленки для одновременной доставки микробицидных и противовоспалительных препаратов

при лечении заболеваний пародонта. Int. J. Pharm. 2020,573, 118860. [CrossRef]

5.

Joshi, D .; Garg, T .; Гоял, А.К .; Рат, Г. Передовые подходы к доставке лекарств против периодонтита. Препарат Делив.

2016,23, 363–377.[CrossRef] [PubMed]

6.

Zamani, F .; Jahanmard, F .; Ghasemkhah, F .; Amjad-Iranagh, S .; Багерзаде, Р .; Амани-Тегеран, М .; Латифи, М.

Глава 7 Нановолокно и материалы с наночастицами как системы доставки лекарств; Наноструктуры для доставки лекарств;

Andronescu, E., Grumezescu, A., Eds .; Эльзевир: Амстердам, Нидерланды, 2017; С. 239–270.

7.

Гаурав, штат Нью-Джерси; Shamama, K.J .; Zeenat, J .; Sushama, I .; Farhan, T .; Roop, J.A .; Хар К. Современные подходы к лечению пародонтита

.Drug Discov. Сегодня 2008, 13, 932–943.

8.

Hamed, R .; AbuRezeq, A .; Таравне, О. Разработка гидрогелей, олеогелей и бигелей в качестве местных средств доставки лекарств

при пародонтите. Drug Dev. Ind. Pharm. 2018,44, 1488–1497. [CrossRef]

9.

Greenstein, G .; Полсон, А. Роль местной доставки лекарств в лечении заболеваний пародонта:

Всесторонний обзор. J. Periodontol. 1998, 69, 507–520. [CrossRef]

10.

Ансельмо, А.C .; Митраготри, С. Обзор клинического и коммерческого воздействия систем доставки лекарств.

J. Controll. Выпуск 2014,190, 15–28. [CrossRef]

11.

Stewart, S.A .; Dom

№

nguez-Robles, J .; Donnelly, R.F .; Ларранета, Э. Имплантируемые полимерные устройства для доставки лекарств

устройств: классификация, производство, материалы и клиническое применение. Полимеры

2018

, 10, 1379. [CrossRef]

12.

Wang, B.; Wang, S .; Zhang, Q .; Deng, Y .; Li, X .; Peng, L .; Zuo, X .; Piao, M .; Куанг, X .; Sheng, S .; и другие. Последние достижения

в системах доставки лекарств на основе полимеров для местных анестетиков. Acta Biomater.

2019

, 15, 55–67.

[CrossRef] [PubMed]

13.

de la Portilla, F .; Pereira, S .; Molero, M .; De Marco, F .; Perez-Puyana, V .; Герреро, А .; Romero, A.

Микроструктурная, механическая и гистологическая оценка модифицированных матов на основе альгината.J. Biomed.

Матер. Res. A 2016,104, 3107–3114. [CrossRef] [PubMed]

14.

Нгвулука, Северная Каролина; Ochekpe, N.A .; Аруома, О. Натураполицевтика: наука об использовании природных полимеров

для доставки лекарств. Полимеры 2014,6, 1312–1332. [CrossRef]

15.

Garg, V .; Chawla, K .; Павар, С. Система локальной доставки лекарств, контролируемая нанотехнологиями, для лечения пародонтита

c. J. Adv. Med. Med. Res. 2018,26, 1–17. [CrossRef]

16.

Агравал, П. Значение полимеров в системе доставки лекарств. J. Фармаконадзор.

2014

, 3, e127. [CrossRef]

17.

Dong, Z .; Sun, Y .; Chen, Y .; Liu, Y .; Tang, C .; Ку, X. Инъекционный адгезивный гидрогель через микрокапсулу

сшивку для лечения пародонтита. ACS Appl. Биол. Матер. 2019,2, 5985–5994. [CrossRef]

18.

Paster, B.J .; Boches, S.K .; Galvin, J.L .; Ericson, R.E .; Lau, C.N .; Леванос, В.А .; Sahasrabudhe, A .; Dewhirst, F.E.

Бактериальное разнообразие поддесневого налета человека. J. Bacteriol. 2001, 183, 3770–3783. [CrossRef]

19.

Дарво Р. П. Периодонтит: полимикробное нарушение гомеостаза хозяина. Nat. Rev. Microbiol.

2010

, 8,

481–490. [CrossRef] [PubMed]

20.

Kumar, P.S .; Gri ff en, A.L .; Moeschberger, M.L .; Лейс, Э.Дж. Идентификация пародонтальных патогенов-кандидатов

и полезных видов с помощью количественного клонального анализа 16S.J. Clin. Microbiol.

2005

, 43, 3944–3955. [CrossRef]

21.

Kumar, P.S .; Leys, E.J .; Bryk, J.M .; Martinez, F.J .; Moeschberger, M.L .; Gri en, A.L. Изменения состояния здоровья пародонта

связаны со сдвигом бактериального сообщества, что оценивается с помощью количественного клонирования 16S и секвенирования

. J. Clin. Microbiol. 2006,44, 3665–3673. [CrossRef]

22.

Lu, Q .; Jin, L .; Darveau, R.P .; Самаранаяке, Л.П. Экспрессия

β

-дефенсинов-1 и -2 пептидов

человека при нерешенном хроническом периодонтите.J. Periodontal Res. 2004, 39, 221–227. [CrossRef]

23.

Zeng, H .; Wu, H .; Sloane, V .; Jones, R .; Yu, Y .; Lin, P .; Gewirtz, A.T .; Нейш, А. Flagellin / TLR5 ответы

в эпителии выявляют взаимосвязанную активацию воспалительного и апоптотического путей. Являюсь. J. Physiol. Гастроинтест.

Liver Physiol. 2006, 290, 96–108. [CrossRef] [PubMed]

24.

Eskan, M.A .; Hajishengallis, G .; Кинан, Д.Ф. Дифференциальная активация эпителиальных клеток десен человека и

моноцитов с помощью Porphyromonas gingivalisfibriae.Заражение иммунной. 2007, 75, 892–898. [CrossRef]

25.

Lu, Y.C .; Yeh, W.C .; Охаши, П.С. Путь передачи сигнала LPS / TLR4. Цитокин

2008

, 42, 145–151. [CrossRef]

[PubMed]

26.

Ryu, J.K .; Kim, S.J .; Rah, S.H .; Kang, J.I .; Jung, H.E .; Ли, Д .; Lee, H.K .; Lee, J.O .; Парк, Б.С.; Yoon, T.Y .; и другие.

Реконструкция каскада передачи LPS выявляет структурные детерминанты внутри LBP, CD14 и TLR4-MD2

для эффективного распознавания и передачи LPS.Иммунитет 2017,46, 38–50. [CrossRef]

Профили биомаркеров слюнных систем, вызванных системным заболеванием, в мышиных моделях меланомы и немелкоклеточного рака легкого

Абстрактные

Фон

Слюна (жидкости полости рта) — это новая биожидкость, предназначенная для выявления клинических заболеваний. Хотя обоснование применения для лечения заболеваний полости рта (например, рака полости рта) интуитивно понятно, обоснование и взаимосвязь между системными заболеваниями и биомаркерами слюны неясны.

Методология / основные результаты

В этом исследовании мы использовали мышиные модели меланомы и немелкоклеточного рака легкого и сравнили профили транскриптомных биомаркеров мышей с опухолью и контрольных мышей. Анализ микроматрицы показал, что транскриптомы слюны были значительно изменены у мышей с опухолью по сравнению с контрольной группой. Значительное совпадение транскриптомов опухолей мышей, сыворотки, слюнных желез и слюны предполагает, что биомаркеры слюны имеют множественное происхождение.Кроме того, мы определили, что экспрессия двух групп значительно измененных факторов транскрипции (TF) Runx1, Mlxipl, Trim30 и Egr1, Tbx1, Nr1d1 в ткани слюнных желез мышей с меланомой потенциально может быть ответственной за 82,6% активируемых экспрессия гена и 62,5% подавленной экспрессии гена, соответственно, в слюне мышей с меланомой. Мы также показали, что эктопическая продукция фактора роста нервов (NGF) в ткани опухоли меланомы в качестве медиатора, высвобождаемого опухолью, может индуцировать экспрессию TF Egr-1 в слюнной железе.

Выводы

В совокупности наши данные подтверждают вывод о том, что при развитии системного заболевания в профиле биомаркеров слюны могут произойти значительные изменения. Хотя происхождение индуцированных заболеванием биомаркеров слюны может быть как системным, так и местным, стимуляция слюнной железы медиаторами, высвобождаемыми из удаленных опухолей, играет важную роль в регулировании профилей суррогатных биомаркеров слюны.

Образец цитирования: Gao K, Zhou H, Zhang L, Lee JW, Zhou Q, Hu S и др.(2009) Профили биомаркеров слюнных систем, вызванных системными заболеваниями, в моделях меланомы и немелкоклеточного рака легких на мышах. PLoS ONE 4 (6): e5875. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005875

Редактор: Бенджамин Рич, Гарвардский институт медицины, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 5 января 2009 г .; Принята к печати: 16 мая 2009 г .; Опубликовано: 11 июня 2009 г.

Авторские права: © 2009 Gao et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было поддержано грантами NIH RO1 DE017170 и R21 CA126733 D.T.W. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Слюна содержит широкий спектр белков / пептидов, нуклеиновых кислот, электролитов и гормонов, которые происходят из множества местных и системных источников. Биохимические и физико-химические свойства слюны поддерживают ее важные функции для здоровья полости рта, такие как переваривание пищи, антибактериальная активность и поддержание целостности зубов [1], [2]. Например, ксеростомия — это заболевание полости рта, вызванное дисфункцией слюнных желез, которое сопровождается снижением или отсутствием секреции слюны и является причиной обширного кариеса и мукозита.

Диагностически ряд открытий, сделанных за последнее десятилетие, вызвал интерес к использованию слюны в качестве источника биомаркеров. Растворимый фрагмент c-erbB-2 обнаруживался в слюне пациентов с раком молочной железы, но не обнаруживался у здоровых людей или пациентов с доброкачественными опухолями [3]. Уровни гормонов (например, кортизола, окситоцина) и лекарств (например, цисплатина, никотина, метадона) в слюне отражают их концентрацию в сыворотке [4], [5], [6]. В 2004 году определение ВИЧ по слюне было одобрено Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA).

Значительный толчок к развитию научной основы и инфраструктуры исследований по диагностике слюны произошел шесть лет назад, когда Национальный институт стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR) сделал значительные инвестиции в развитие использования слюны в качестве диагностического инструмента. С тех пор слюна превратилась в биожидкость, пригодную для трансляционного и клинического применения. Следует отметить созревание протеома слюны, первого инструмента в наборе диагностических инструментов для диагностики на основе слюны.Теперь мы знаем, что в слюне человека содержится 1166 белков, функции которых варьируются от структурного связывания до участия в различных биологических процессах [7]. С тех пор появился второй диагностический ресурс слюны — транскриптом слюны. Используя транскриптом слюны в качестве диагностического инструмента, набор из 185 мРНК был идентифицирован как «нормальные основные транскрипты слюны» (NSCT) [8]. Более того, было продемонстрировано, что транскриптом слюны является клинически дискриминационным для выявления рака полости рта и синдрома Шегрена (СС).Комбинация семи биомаркеров транскриптов слюны ( IL8, IL1B, DUSP1, HA3, OAZ1, S100P и SAT ) может использоваться для различения слюны пациентов с плоскоклеточным раком полости рта (OSCC) и контрольной группы с 91%. чувствительность и специфичность [9]; тогда как пять протеомных маркеров слюны (M2BP, CD59, каталаза, MRP-14 и Profilin) ​​в совокупности демонстрируют 93% чувствительность и специфичность соответственно для выявления рака полости рта с использованием слюны [10]. Другое исследование показало, что 27 мРНК и 16 пептидов в образцах слюны пациентов с СС были значительно повышены или понижены [11].Технология транскриптома слюны недавно была продвинута до экзонного уровня с возможностью всестороннего профилирования транскриптома слюны с использованием технологии, основанной на экзонах [12].

Использование слюны в качестве биожидкости для клинической диагностики дает множество преимуществ. Сбор образцов прост, неинвазивен и не вызывает беспокойства у пациентов. Использование слюны также предлагает рентабельный подход для крупномасштабных экранов [6].

Подтверждено использование слюны для выявления заболеваний полости рта, но ее использование при системных заболеваниях в значительной степени неясно.Хотя в отчетах описывается обнаружение биомаркеров системного рака в слюне (например, c-erb2 у пациентов с раком груди), механизмы, лежащие в основе этого явления, остаются необоснованными. Целью этого исследования было изучение научных данных и обоснование использования слюны для выявления системных заболеваний. Мы использовали сингенные модели опухолей мышей для развития опухолей, удаленных от ротовой полости, и использовали транскриптом слюны в качестве считывания профиля биомаркеров (рис. 1). Транскриптом слюны был признан научно достоверным и подтвержденным источником биомаркеров в слюне [8], [9], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17] ], что позволяет проводить высокопроизводительный анализ и считывать показания, необходимые для исследований.

Рис. 1. Блок-схема экспериментов на животных.

Мышей (либо мышей C57BL / 6, либо мышей DBA / 2) случайным образом делили на две группы следующим образом: контрольную группу (контрольные мыши) и группу опухоли (мыши-опухоли) (15 животных на группу). PBS вводили контрольным мышам, тогда как мышам в группе опухоли вводили опухолевые клетки. На формирование опухоли ушло ~ 3 недели. У каждой мыши собирали слюну, слюнную железу, сыворотку и опухолевые ткани. По пять мышей объединили в одну группу и обработали для профилирования их транскриптома с помощью экспрессионных микрочипов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005875.g001

Результаты

Значительные вызванные заболеванием различия между профилями биомаркеров транскриптома слюны у мышей с опухолями и у контрольных мышей

Чтобы оценить, изменяется ли профиль биомаркера транскриптома слюны при развитии удаленной опухоли, мы провели анализ микроматрицы, чтобы сравнить профили биомаркера транскриптома в слюне контрольных мышей (три группы, по 5 мышей в каждой группе) с опухолью (меланома или легкое). ) мышей (три группы по 5 мышей в каждой) (рис.1). Необходимо иметь пять мышей в каждой опухоли или контрольной группе, чтобы собрать достаточно слюны для выделения РНК. Критерии выбора биомаркера были установлены как кратное изменение> 2 и P <0,05. Мы идентифицировали 152 известных гена со значительным повышением регуляции и 359 известных генов с пониженной регуляцией (рис. 2A, таблица S3 и S4) в слюне мышей с меланомой по сравнению с контрольными мышами. Точно так же мы обнаружили 290 транскриптов с достоверной активацией и 784 транскрипта со значительным подавлением (рис.2В, таблица S5 и S6) в слюне мышей с раком легкого по сравнению с контрольными мышами.

Рис. 2. Профили экспрессии слюны на мышиных моделях меланомы и рака легких.

A , Кластерный анализ 152 известных генов с повышенной регуляцией (представляющих 225 наборов проб, левая панель) и 359 известных генов с пониженной регуляцией (представляющих 403 набора проб, правая панель), дифференциально экспрессируемых в слюне мышей с меланомой по сравнению с контролем мышей (значение P <0,05; кратное изменение ≥2). Профили экспрессии стандартизированы, чтобы иметь нулевое среднее значение и стандартное отклонение единицы.Красный и зеленый цвет представляют соответственно высокий и низкий уровни экспрессии после стандартизации. B , Кластерный анализ 290 наборов зондов с повышенной активностью и 784 наборов зондов с пониженной регуляцией, дифференциально экспрессируемых в слюне мышей с карциномой легкого по сравнению с контрольными мышами (значение P <0,05; кратное изменение ≥2). C и D , перекрытие дифференцированной экспрессии генов между моделью меланомы и моделью рака легкого. C , перекрытие 225 активированных генов в модели меланомы и 290 активированных генов в модели рака легких. D , перекрытие 403 генов с пониженной регуляцией в модели меланомы и 784 генов с пониженной регуляцией в модели рака легкого.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005875.g002

Мы также перекрыли дифференцированную экспрессию генов в слюне мышей с меланомой и мышей с раком легких. Сравнивая повышенную или понижающую регуляцию генов слюны в двух моделях, мы обнаружили, что 11 активируемых (рис. 2C) и 17 подавляемых (рис. 2D) транскриптов существуют в обеих моделях.Однако, учитывая различный генетический фон и линии раковых клеток в двух моделях мышей, неудивительно, что только часть общих измененных генов перекрывалась (4,8% (11/225) или 3,8% (11/290) с повышенной регуляцией). гены в модели меланомы или модели рака легкого, соответственно; 4,2% (17/403) или 2,1% (17/784) транскриптов в двух моделях, соответственно).

Множественные источники способствуют изменению профиля мРНК слюны, вызванному опухолью

Чтобы изучить возможные источники, способствующие изменению транскриптома слюны у мышей в ответ на системное заболевание, мы отфильтровали данные профилей экспрессии мышей с меланомой (опухоль, сыворотка, слюнная железа и слюна), чтобы выбрать «присутствующую» мРНК с P значение <0.001 и значение интенсивности> 200. В модели меланомы 20175, 5493, 19904 и 306 транскриптов были идентифицированы в опухоли, сыворотке, слюнной железе и слюне соответственно (рис. 3A). После перекрытия всех присутствующих генов из опухоли, сыворотки, слюнной железы и слюны, рис. 3B показал, что из 306 транскриптов, присутствующих в слюне, 67,6% также присутствуют в ткани меланомы-опухоли, 51,6% также присутствуют в сыворотке и 69,6%. также присутствуют в слюнных железах. Эти данные показывают, что происхождение настоящего транскриптома в слюне может быть связано с различными компартментами всего тела, составляющими всего ~ 75.2% из 306 расшифровок слюны. Кроме того, 24,8% из 306 транскриптов не перекрывались с генами опухоли, слюнной железы и сыворотки, что позволяет предположить, что они могут происходить из полости рта.

Рисунок 3. Перекрывающиеся профили экспрессии генов в слюне, слюнной железе, сыворотке и опухоли на мышиной модели меланомы.

A , Перекрывающиеся транскрипты, присутствующие в слюне, слюнной железе, сыворотке и опухоли у мышей с меланомой. B , Из 306 стенограмм слюны 69.6% присутствовали в слюнной железе, 51,6% присутствовали в сыворотке, 67,6% присутствовали в опухоли (меланоме) и 24,8% могли происходить из полости рта (местно).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005875.g003

Измененная экспрессия факторов транскрипции (TF) в слюнных железах мышей с меланомой коррелирует с измененными изменениями экспрессии генов, опосредованных факторами транскрипции, в слюне мышей

Так как транскриптом слюны был явно изменен в отношении несущей опухоль vs.На контрольных мышах мы предположили, что опухоли ведут себя как эндокринные органы в том смысле, что они секретируют медиаторы (гормоны, лимфокины, цитокины), которые могут влиять на активность TF в слюнных железах и тем самым индуцировать повышенную или понижающую регуляцию уровней транскриптов в слюне.

Хотя две модели рака у мышей в этом исследовании хорошо известны [34], [35], модель мыши с меланомой имитирует меланому человека лучше, чем модель рака легкого теоретически и патологически, потому что и меланома человека, и эта меланома мыши возникают подкожно.Поэтому мы использовали мышей C57BL / 6 с меланомой в качестве рабочей модели для проверки нашей гипотезы.

Сначала мы сравнили профили экспрессии генов в тканях слюнных желез у мышей с меланомой с контрольными мышами и определили список из 46 значительно активированных TF (кратное изменение> 2 и P <0,05) (Таблица S1). Затем мы рассчитали коэффициенты корреляции между профилями экспрессии этих значительно измененных ТФ и дифференциально экспрессируемых генов (как с повышенной, так и с отрицательной регуляцией) в слюне мышей с меланомой.Затем TF были ранжированы по количеству генов с высокой степенью совместной экспрессии, корреляция которых с экспрессией TF составляет> 0,5. Шесть активированных ТФ с наивысшим рейтингом были RunX1 (связанный с runt фактор транскрипции 1), MLXIPL (взаимодействующий белок-подобный белок MLX musculus) и TRIM30 (трехсторонний мотивный белок 30) для активированных генов слюны и Egr1 (фактор раннего роста-1). Tbx1 (T-box 1) и Nr1d1 (подсемейство 1 ядерных рецепторов musculus, группа D, член 1) для подавляющих регулируемых генов слюны (рис. 4A, E, F).

Рисунок 4. Факторы транскрипции (TF) в слюнной железе были активированы и коррелировали с экспрессией ряда генов в слюне модели мыши с меланомой.

A , 6 TF ( Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1 ) значительно выше экспрессируются в слюнных железах мышей с меланомой по сравнению с контрольными мышами (P <0,05, Таблица S1). B , уровни экспрессии мРНК этих 6 ТФ ( Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1 ) в слюнной железе мышей с меланомой vs.у нормальных мышей подтверждено qRCR. Горизонтальная пунктирная линия указывает уровни экспрессии генов у контрольных мышей, которые произвольно установлены на 1. Столбцы представляют уровни экспрессии генов в слюнной железе мышей с меланомой по сравнению с контрольными мышами. Эксперименты проводились в трех экземплярах; бары, SD. C , Уровни экспрессии пяти TF (Runx1, Mlxipl, Egr1, Nr1d1 и TBX1) в тканях слюнных желез контрольных мышей и мышей с меланомой измеряли с помощью иммуноблоттинга. (C1, C2, C3 и T1, T2, T3 — это та же партия тканей, что использовалась в анализе на микрочипах).Обратите внимание, что коммерческие антитела не были доступны для мышиного Trim30. D , Относительные уровни экспрессии белков вышеупомянутых пяти ТФ у мышей с меланомой по сравнению с контрольными мышами. Интенсивность сигнала блота на Фигуре 4 C определяли количественно с помощью программного обеспечения Image J (NIH). Горизонтальная пунктирная линия указывает уровни экспрессии этих 5 TF у контрольных мышей, которые произвольно установлены на 1. Столбцы показывают, что относительные уровни белка 5 TF у мышей с опухолью по сравнению с контрольными мышами; бары, SD. E и F , Экспрессия 6 TF ( Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1 ) в слюнной железе мышей с меланомой коррелировала с дифференцированной экспрессией генов в слюне мышей. Три из них (Runx1, Trim30 и Mlxipl ) могут быть потенциально ответственны за 180, 35 и 16 активированных транскриптов слюны у мышей с меланомой ( P <0,05), соответственно, в то время как остальные 3 TF ( Egr1 , Tbx1 и Nr1d1 ) потенциально коррелируют с 119, 116 и 77 подавляющими транскриптами слюны ( P <0.05). G , Экспрессия 3 TF (Runx1, Trim30 и Mlxipl) полностью коррелировала с 82,6% ((180 + 5 + 1) / 225 = 82,6%) усиленной экспрессией генов в слюне мышей с меланомой за счет перекрытия всех генов слюны которые коррелируют с этими тремя TF из рис. 4 E . H , Экспрессия трех других TF (Egr1, TBX1 и Nr1d1) полностью коррелировала с 62,5% ((119 + 58 + 2 + 73) / 403 = 62,5%) подавленной экспрессией гена в слюне мышей с меланомой. перекрывая все гены слюны, которые коррелируют с этими 3 TF на рис.4 Ф .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005875.g004

Затем измененные паттерны экспрессии этих TF слюнных желез были подтверждены как на уровне транскрипции, так и на уровне белка с помощью qPCR и иммуноблоттинга. На фигуре 4 B показано, что уровни мРНК шести TF увеличены от 3 до 16 раз в слюнных железах мышей с меланомой по сравнению с контрольными мышами. Обнаружение иммуноблоттинга с использованием 5 коммерчески доступных мышиных антител против ТФ выявило 1.Уровни экспрессии этих TF в слюнных железах мышей с меланомой в 5–3,5 раза выше, чем у контрольных мышей (фиг. 4 C и 4D ). Затем фиг. 4 E и F показывают, что указанные выше 6 TF были связаны с рядом дифференцированных экспрессий генов в слюне мыши. После перекрытия связанных генов каждого ТФ можно увидеть, что измененная активность трех ТФ (RunX1, MLXIPL и TRIM30) может быть потенциально ответственна за 83% мРНК с повышенным уровнем регуляции в слюне (рис.4 G ), тогда как коллективно измененные активности Egr1, Tbx1 и Nr1d1 потенциально могут составлять 63% подавленной экспрессии мРНК слюны (Fig. 4 H ).

Сигнальный путь Egr-1 и обнаружение фактора роста нервов (NGF) в опухолевой ткани и сыворотке меланомы

Чтобы выяснить, могут ли развитые опухоли опосредовать измененную экспрессию TF в слюнных железах мышей, несущих опухоль, мы исследовали сигнальный путь NGF / Egr1, поскольку Egr1 был идентифицирован как активированный TF в слюнной железе меланомы-опухоли. мышей.Хорошо известно, что Egr-1 является TF в сигнальном пути NGF [18], [19] (Fig. 5A). Поэтому мы предполагаем, что NGF секретируется в кровоток меланомой, циркулирует в слюнных железах, где он активирует рецептор-опосредованный сигнальный каскад, приводящий к усилению регуляции Egr-1 и индукции транскрипции специфического гена и трансляции белка. На фигуре 5B показано, что NGF продуцируется в ткани меланомы на значительно более высоких уровнях, чем в нормальной коже ( P <0,001). Рисунок 5C показывает, что NGF также значительно выше в сыворотке мышей с меланомой по сравнению с контрольными мышами ( P <0.05). В совокупности эти данные предполагают, что меланома может продуцировать NGF и секретировать его в кровоток. Достигнув слюнных желез, повышенные уровни NGF в крови могли затем стимулировать повышенную экспрессию TF, таких как Egr-1, что приводило к изменению экспрессии генов и профилей белков в слюне мышей с меланомой.

Рисунок 5. NGF участвует в активации TF Egr-1 и увеличивается в сыворотке мышей.

A , Путь с участием фактора транскрипции Egr1.Фактор роста нервов (NGF) может быть вышестоящим фактором Egr1. B , Экспрессия NGF в коже мышей и тканях меланомы, измеренная с помощью ELISA. Столбцы представляют собой абсолютные средние значения концентрации NGF в тканях пяти мышей с меланомой. ***, П <0,001. C , Экспрессия NGF в сыворотке контрольных мышей и мышей с опухолью. Столбцы представляют собой абсолютные средние значения концентрации NGF в сыворотке от пяти контрольных мышей и пяти мышей с меланомой. Бар, SD. **, P <0,05

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0005875.g005

Обсуждение

Исследования продемонстрировали потенциал использования слюны в качестве диагностической биожидкости в трансляционных и клинических приложениях. В качестве биологического образца слюна стоит недорого и легко доступна неинвазивным способом. Обширная база знаний о диагностическом составе слюны предлагает ценный и информативный ресурс для открытия биомаркеров (www.skb.ucla.edu). Были идентифицированы и подтверждены высокодискриминационные биомаркеры слюны для двух заболеваний полости рта: рака полости рта и синдрома Шегрена [9], [11].Однако связь между системными заболеваниями и биомаркерами слюны до сих пор неясна. В этом исследовании мы использовали мышиные модели рака, чтобы определить, влияет ли развитие болезни на профили биомаркеров слюны. Наши данные продемонстрировали, что профили транскриптомов слюны значительно изменяются у мышей с одной из двух опухолей: меланомой и карциномой легких (рис. 2). Каждый тип опухоли был связан с различным профилем транскриптома слюны. Кроме того, наш анализ продукции NGF и TF Egr1 предполагает, что продукция факторов роста в опухолевой ткани представляет собой один механизм, посредством которого удаленная опухоль может изменять транскриптом слюнной железы и, следовательно, слюны.Эти данные также показывают, что слюнные железы могут играть ключевую роль в опосредовании индуцированных опухолью изменений профиля биомаркеров транскриптома слюны. Помимо демонстрации того, что циркулирующие биомаркеры, вызванные заболеванием, могут проникать в слюну, эти результаты предполагают, что суррогатные биомаркеры слюнных желез, вызванные заболеванием, могут иметь диагностическое значение для обнаружения или мониторинга системных заболеваний.

Со времени нашего первого сообщения о транскриптоме слюны [8], [9] мы изучаем происхождение мРНК слюны, которая, по-видимому, отличается от мРНК, обнаруженной в других жидкостях организма.Считается, что нуклеиновые кислоты в сыворотке больных раком выделяются непосредственно из раковых клеток или высвобождаются в результате лизиса клеток в поврежденных органах, в то время как нуклеиновые кислоты в моче могут поступать из мРНК или ДНК крови [20], [21]. ]. При исследовании слюны человека транскрипты в транскриптоме слюны могут быть обнаружены во всех источниках слюны, включая околоушную железу, подчелюстные и подъязычные железы, десневую щелейную жидкость и эпителиальные клетки полости рта [16]. Недавно было продемонстрировано, что большинство мРНК в транскриптоме слюны имеет AU-богатый элемент (ARE) в их 3’UTR, который придает стабильность за счет образования комплекса с ARE-связывающими белками [17].В настоящем исследовании мы сравнили транскриптомы опухоли, сыворотки, слюнных желез и слюны и обнаружили, что транскриптом слюны у мышей с опухолью сильно перекрывается в значительной степени с транскриптомами слюнной железы, сыворотки и опухоли. Эти анализы предполагают, что мРНК слюны может иметь несколько источников и / или что между ротовой полостью и системным здоровьем может существовать сложная системная взаимосвязь.

Мы исследовали потенциальные механизмы, с помощью которых дистальные опухоли опосредуют изменения профилей биомаркеров слюны у мышей с опухолями.Предыдущие исследования показали, что системные заболевания или методы лечения могут влиять на функцию слюнной железы, приводя к изменениям в составе слюны [22], [23], [24]. После лечения интерлейкином-2 (ИЛ-2) у пациентов уровни натрия и белка в слюне были повышены. Одно исследование на мышиной модели также показало, что уровни воспалительных факторов, таких как IL-1beta, увеличиваются в слюне после удаленного воспаления в организме [24]. Поскольку слюнная железа является основным источником слюны, мы предположили, что слюнные железы могут быть ответственны за изменения специфических биомаркеров слюны, связанные с дистальными опухолями.Поскольку наш эксперимент проводился в трех экземплярах, может быть применим байесовский метод. Однако этот метод требует определенных допущений модели для данных. Наконец, в этом исследовании было применено программное обеспечение Expression console (Affymetrix, Inc.) и Dchip (http://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/). Для сингенной модели меланомы мы определили, что 46 TF значительно активированы в слюнных железах мышей с меланомой, что может приводить к прямой индукции или подавлению экспрессии генов.Относительные кратные изменения экспрессии TF, таких как Egr1 и Nr1d1, различаются между уровнями мРНК и уровнями белка, что может отражать трансляционную модификацию или протеасомную деградацию [25]. Затем мы обнаружили, что эта измененная экспрессия TF связана с индуцированным меланомой транскриптомом в слюне. Мы обнаружили, что примерно 83% значительно подавленных транскриптов в слюне можно объяснить тремя TF (Runx1, Trim30 и Mlxipl) (рис. 4G), а 63% значительно подавленных транскриптов слюны можно объяснить. еще тремя ТФ (Egr1, TBX1 и Nr1d1) (рис.4H). В совокупности эти данные позволяют нам сделать вывод, что слюнные железы выполняют ранее недооцененную роль в качестве органа, контролирующего системное заболевание, индуцируя специфические для заболевания TF и ​​изменяя экспрессию специфических генов и трансляцию соответствующих белков. Эти измененные мРНК и белки слюны являются суррогатными биомаркерами, связанными с заболеванием, которые секретируются в железистые жидкости и попадают в полость рта в виде цельной слюны.

Поскольку индукция экспрессии TF в слюнных железах произошла у мышей с дистальной опухолью, мы также предположили, что существуют опухолеспецифические медиаторы, которые могут влиять на измененную экспрессию TG в слюнных железах.Хорошо известно, что опухоли эктопически экспрессируют медиаторы, которые оказывают системное действие на дистальные органы и способствуют метастазированию раковых клеток [26], [27]. Известно, что меланомы эктопически экспрессируют TGF-бета [28], тогда как опухоли легких эктопически экспрессируют гонадотропины и другие гормоны [29], [30]. Мы исследовали, может ли один такой сигнальный путь быть связан с одним из идентифицированных TF, который может быть ответственным за индукцию или подавление транскриптома слюны в модели меланомы мыши. Действительно, известно, что NGF стимулирует экспрессию TF Egr-1 через хорошо изученный сигнальный путь (рис.5А). Используя анализ NGF ELISA, мы наблюдали, что концентрация NGF в ткани меланомы и сыворотке значительно выше, чем в аналогичных контрольных тканях (фиг. 5B, C). Эти данные предполагают биологический сценарий и логическое обоснование, согласно которому развивающаяся опухоль мыши секретирует NGF в кровоток, где он циркулирует в крови к слюнным железам и связывается с рецепторами NGF, экспрессируемыми ацинарными клетками слюны, активируя сигнальный путь, который приводит к усилению регуляции. уровней мРНК и белка Egr-1.Следует отметить, что клетки меланомы происходят из меланоцитов, которые мигрируют из нервного гребня во время эмбрионального развития. NGF может стимулировать пролиферацию и метастазирование клеток меланомы [31]. С другой стороны, NGF и его рецептор (TrkA IR и TrkC IR) были обнаружены в слюнной железе [32], [33]. Следовательно, разумно предположить, что NGF, секретируемый опухолью меланомы, переносился через кровь и связывался с его родственными рецепторами в слюнной железе, что в конечном итоге приводило к стимуляции экспрессии нескольких TF, включая Egr-1 (рис.6).

Рис. 6. Рабочая модель: взаимосвязь между транскриптомом слюны и удаленной опухолью.

Медиаторы, такие как NGF, секретируемый удаленными опухолями, переносятся в слюнные железы через кровь для стимуляции экспрессии TF и ​​изменения профиля мРНК слюны.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005875.g006

Мы также измерили уровни NGF в опухолевом лизате на модели рака легких у мышей. Хотя NGF был обнаружен, он был на значительно более низком уровне, чем лизат опухоли меланомы (20.9 ± 4,3 пг / мг в опухоли легкого против 75,73 ± 24 пг / мг в ткани меланомы, P <0,05, данные не показаны). Кроме того, только 11 активируемых и 17 подавляемых транскриптов перекрывались, когда мы сравнивали профиль мРНК слюны в модели меланомы с моделью рака легкого (225 активированных или 403 подавленных гена в модели меланомы по сравнению с 290 генами в модели меланомы). активируемые или 784 подавленные транскрипты в модели рака легких, соответственно, рис. 2C и D). И 2 из этих 17 перекрывающихся генов с пониженной регуляцией коррелировали с экспрессией Egr1 (данные не показаны).В совокупности эти данные позволяют нам заключить, что происходящий из меланомы NGF является потенциально важным медиатором в подавлении специфического транскриптома слюны только у мышей с меланомой.

Хотя наш отчет не демонстрирует всесторонне механистическую связь между развитием системных заболеваний и изменениями биомаркеров слюны, он начинает рисовать картину для концепции, что в нашем теле существуют системные сети, которые обеспечивают связь между дистальными заболеваниями и слюнными железами.Сигналы, передаваемые через такие сети, могут индуцировать связанные сигнальные пути, которые приводят к изменению экспрессии генов и трансляции белков и тем самым создают профили биомаркеров слюны, вызванные заболеванием. Мы предполагаем, что такие индуцированные заболеванием транскриптомы и продукты трансляции слюнных желез могут служить ценными индикаторами начала и / или прогрессирования заболевания. Таким образом, слюнную железу можно рассматривать как реактивный орган, контролирующий системные заболевания, а слюну можно исследовать как обогащенную биомаркерами биологическую жидкость, отражающую заболевание.Местное производство и секреция слюны из одного анатомического источника (слюнные железы), а также тот факт, что ее можно использовать просто и неинвазивно, а также с относительно небольшим дискомфортом для пациентов, являются сильным стимулом для продолжения исследования salvia как потенциальный диагностический индикатор системных заболеваний.

Материалы и методы

Животные

Мыши DBA / 2 и C57BL / 6 в возрасте от шести до восьми недель были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, штат Мэн) и размещены в Отделе медицины лабораторных животных (DLAM) Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.Протоколы экспериментов были одобрены Комитетом по исследованиям на животных (ARC) при Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (UCLA).

Клеточные линии

Мышиные клеточные линии KLN-205 и B16-F1 были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС). KLN-205 представляет собой линию клеток немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), первоначально созданную у мышей DBA / 2. Клетки культивировали в МЕМ (GIBCO). А B16-F1, линия клеток меланомы, происходящая из C57BL / 6, поддерживалась в DMEM (GIBCO) [34].Все клетки содержались в атмосфере 5% CO2 при 37 ° C.

на мышах с меланомой индуцировали подкожной (п / к) инъекцией 1 × 10 ⁵ клеток B16-F1 в 0,1 мл PBS в нижний правый бок мышей C57BL / 6. Модель рака легких была создана s.c. инъекция 2 × 10 ⁵ клеток KLN-205 мышам DBA / 2 [34], [35]. Контрольным животным вводили только PBS. Установившиеся опухоли наблюдались через 2–3 недели (рис.1).

Сбор слюны, крови и опухолевой ткани мышей

Когда опухоли достигали 15 мм в диаметре, собирали слюну и мышей умерщвляли. Легкую анестезию вызывали внутримышечной (IM) инъекцией 1 мкл / кг веса тела раствора, содержащего 60 мг / мл кетамина (Phoenix Scientific, Сент-Джозеф, Миссури) и 8 мг / мл ксилазина (Phoenix Scientific). Мышам подкожно вводили пилокарпин (0,05 мг пилокарпина / 100 г веса тела) между ушами для стимуляции секреции слюны.Слюну собирали из ротовой полости микропипеткой и сразу же помещали в предварительно охлажденные 1,5-мл микроцентрифужные пробирки. Сбор был завершен за 20 минут [23], и образцы хранили при -80 ° C до анализа.

Кровь собирали в пробирки BD Vacutainer, содержащие активатор сгустка (BD Biosciences), и центрифугировали при 1000 × g в течение 10 мин после умерщвления мышей [36]. Слюнную железу и опухолевую ткань удаляли у мышей, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.

Эксперимент проводили в трех повторностях.Мышей (30 мышей C57BL / 6 или 30 мышей DBA / 2) случайным образом распределяли в контрольную группу и группу опухолей в равной степени (15 животных на группу). Следовательно, в модели мышей с меланомой контрольная группа и группа лечения состоят из 15 мышей C57BL / 6, соответственно (всего 30 мышей). Образец слюны, собранный у каждой из 5 контрольных мышей, был обозначен как C1, 2, 3. Образец слюны, объединенный от каждой из 5 обработанных мышей, был обозначен как T1, 2, 3. Ткань слюнной железы, сыворотка и опухоль были объединены вместе в такой же порядок.Наконец, три образца каждой слюны, слюнной железы, сыворотки и опухолевой ткани либо в контрольной группе, либо в обработанной группе были готовы для следующей экстракции РНК и процесса микроматрицы. Мы сделали такой же дизайн на модели рака легких с использованием 30 мышей DBA / 2.

Экстракция РНК и анализ микрочипов олигонуклеотидов высокой плотности

РНК из слюны, слюнной железы, сыворотки и опухоли выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen), как описано ранее [12]. В контрольной группе или группе опухолей было 15 мышей (всего 30 мышей C57BL / 6 для модели мышей с меланомой, еще 30 мышей DBA / 2 для мышиной модели рака легкого).Образцы, полученные от 5 мышей в каждой группе, объединяли и экстрагировали РНК. Объединение необходимо, поскольку оно обеспечивает получение достаточного количества мРНК слюны для анализа микрочипов. Изолированную тотальную РНК обрабатывали рекомбинантной ДНКазой (Ambion, Austin, TX). Для анализа микроматрицы мРНК из слюны, железы, сыворотки или опухоли мышей линейно амплифицировали с использованием набора для амплификации РНК RiboAmp (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). После очистки кДНК транскрибировали и биотинилировали in vitro с использованием реагентов для 3′-амплификации GeneChip Expression для мечения транскрипции in vitro (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния).Меченые РНК (15 мкг каждая) затем фрагментировали и отправляли в центр микрочипов UCLA для гибридизации и сканирования массива. Массив GeneChip Mouse Genome 430 2.0, который представляет> 39 000 транскриптов и вариантов, был использован для анализа профилей. Все необработанные данные были импортированы в программу анализа ДНК-чипов (http://www.biostat.harvard.edu/complab/dchip) для нормализации и сравнения. Данные микрочипа загружены в базу данных GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/index.cgi). Номер доступа: GSE13443

Анализ данных микрочипов

Все данные микрочипов были обработаны и нормализованы с использованием программного обеспечения dChip [37] для расчета индексов экспрессии генов. Мы провели двухвыборочное сравнение экспрессии генов в обработанной опухолью и контрольной группах для слюнной железы и слюны соответственно. Ген был идентифицирован как повышающий (или понижающий) регулируемый, если 1) значение P двухвыборочного t-теста было <0,05 и 2) отношение его среднего уровня экспрессии у мышей с опухолью к этому значению. у контрольных мышей было> 2 (или <0.5 для генов с пониженной регуляцией). Тепловая карта была создана с помощью программного обеспечения Cluster3.0 и Java Gene Treeview [38], [39].

Корреляционный анализ проводили с использованием профилей экспрессии в слюнной железе модели мыши с меланомой. Среди активированных генов в слюнных железах 46 кодируют TF (Таблица S1). Мы рассчитали коэффициенты корреляции между профилями экспрессии этих ТФ и дифференциально экспрессируемых (повышающих и понижающих регуляцию) генов в слюне во всех образцах. Мы ранжировали TF по количеству генов с высокой степенью коэкспрессии, корреляция которых с экспрессией TF составляет> 0.5.

Мы также определили набор датчиков как присутствующий, когда он имел значение P <0,001 и значение интенсивности> 200 [12]. Анализ пути проводился с использованием базы данных Biocarta (http://www.biocarta.com), и было получено разрешение на использование в статье.

Количественная ПЦР в реальном времени

для шести генов (Runx1, Trim30 Mlxipl, Egr1, Nr1d1 и TBX1) (таблица S2) были сконструированы с использованием программного обеспечения Primer Express 3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) с температурой плавления 58–60 ° C. .ПЦР проводили в трех повторностях в реакционных объемах 10 мкл с использованием SYBR-Green Master Mix (Applied Biosystems) в течение 15 минут при 95 ° C для начальной денатурации, с последующими 40 циклами при 95 ° C в течение 30 секунд и 60 ° C в течение 30 секунд. сек в системе быстрой ПЦР в реальном времени ABI 7500HT [40].

Пороговый цикл (Ct) был получен с помощью системного программного обеспечения 7500 fast (Applied Biosystems) и усреднен. Относительные уровни экспрессии (кратные изменения) рассчитывали по формуле 2 ^{— [(Te-Tn) — (Ce-Cn)]} .Te — номер цикла Ct интересующего гена, такого как Runx1, наблюдаемый в образце слюнной железы из обработанной группы, Tn — номер цикла Ct генов домашнего хозяйства GAPDH, наблюдаемых в том же образце, в то время как Ce — среднее количество циклов Ct для тот же ген-мишень, такой как Runx1, наблюдаемый в образце в контрольной группе, Cn — это среднее число циклов Ct гена домашнего хозяйства GAPDH в том же образце. Результаты, полученные по относительным уровням экспрессии, использовали для статистического анализа.Типичные результаты показаны на фиг. 5C.

Вестерн-блоттинг и ELISA

Ткани трижды промывали PBS и лизировали тройным детергентным буфером (50 мМ трис-Cl [pH 8,0], 150 мМ NaCl, 0,02% азид натрия, 0,1% SDS, 100 мкг / мл фенилметилсульфонилфторида, 1 мкг / мл апротинина. , 1% Nonidet P-40 и 0,5% дезоксихолат натрия) в течение 20 минут на льду с последующей обработкой ультразвуком [41]. Лизат центрифугировали при 12000 × g в течение 10 мин и собирали супернатант. Концентрацию белка определяли с помощью DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA).Белки разделяли на гелях 10% полиакриламид / SDS (Invitrogen, CA) и наносили электроблоттингом на пленки поливинилидендифторида. Пленки блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 ч и инкубировали с указанными антителами (Santa Cruz Biotechnology). (Рис. 5D). Интенсивность сигнала полос измеряли с помощью программного обеспечения Image J (NIH, Bethesda, MD). Интенсивность полосы, представляющей интересующий ген, такой как Runx1, делили на интенсивность его соответствующей экспрессии ACTIN на том же блоте.Затем мы сравнили кратные изменения каждой экспрессии TF между обработанной группой и контрольной группой (фиг. 5E).

Концентрацию NGF в ткани меланомы и сыворотке измеряли с помощью набора NGF ELISA (Chemicon, Temecula, CA) и выполняли в соответствии с инструкциями производителя.

Благодарности

Мы благодарим доктора Но Джин Пак за комментарии и предложения по этому проекту. Мы также благодарим центр микрочипов UCLA и DLAM в UCLA за техническую поддержку.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: KG HZ LZ SH LEW JF GE DW. Проведены эксперименты: КГ ЛЗ Ш. Проанализированы данные: KG HZ LZ JWL QZ SH. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: KG JWL QZ SH JF GE DW. Написал документ: KG HZ LZ JWL QZ SH JF GE DW.

Ссылки

1. 1. Хамфри С.П., Уильямсон Р.Т. (2001) Обзор слюны: нормальный состав, поток и функция. J Prosthet Dent 85: 162–169.
2. 2.Schipper RG, Silletti E, Vingerhoeds MH (2007) Слюна как материал исследования: биохимические, физико-химические и практические аспекты. Arch Oral Biol 52: 1114–1135.
3. 3. Streckfus C, Bigler L, Dellinger T, Dai X, Kingman A и др. (2000) Присутствие растворимого c-erbB-2 в слюне и сыворотке у женщин с карциномой груди: предварительное исследование. Clin Cancer Res 6: 2363–2370.
4. 4. Holder G (2006) Измерение глюкокортикоидов в биологических жидкостях.Методы Мол Биол 324: 141–157.
5. 5. Картер С.С., Пурнаджафи-Назарлоо Х., Крамер К.М., Циглер Т.Э., Уайт-Траут Р. и др. (2007) Окситоцин: поведенческие ассоциации и потенциал как биомаркер слюны. Ann N Y Acad Sci 1098: 312–322.
6. 6. Кауфман Э., Ламстер И.Б. (2002) Диагностические применения слюны — обзор. Crit Rev Oral Biol Med 13: 197–212.
7. 7. Денни П., Хаген Ф.К., Хардт М., Ляо Л., Ян В. и др. (2008) Протеомы слюнных желез околоушной и поднижнечелюстной / подъязычной железы человека, собранные в виде секрета протоков.J Proteome Res 7: 1994–2006.
8. 8. Li Y, Zhou X, St John MA, Wong DT (2004) Профилирование РНК бесклеточной слюны с использованием технологии микрочипов. J Dent Res 83: 199–203.
9. 9. Ли И, Сент-Джон М.А., Чжоу Икс, Ким И, Синха У и др. (2004) Диагностика транскриптома слюны для выявления рака полости рта. Clin Cancer Res 10: 8442–8450.
10. 10. Ху С., Ареллано М., Бунтеунг П., Ван Дж., Чжоу Х. и др. (2008) Протеомика слюны для открытия биомаркеров рака полости рта.Clin Cancer Res. в прессе.
11. 11. Ху С., Ван Дж., Мейджер Дж., Йонг С., Се Й и др. (2007) Протеомные и геномные биомаркеры слюны для первичного синдрома Шегрена. Arthritis Rheum 56: 3588–3600.
12. 12. Ху З., Циммерманн Б.Г., Чжоу Х., Ван Дж., Хенсон Б.С. и др. (2008) Профилирование экспрессии на уровне экзонов: всесторонний анализ транскриптома оральных жидкостей. Clin Chem.
13. 13. Циммерманн Б.Г., Парк Нью-Джерси, Вонг Д.Т. (2007) Геномные мишени в слюне.Ann N Y Acad Sci 1098: 184–191.
14. 14. Циммерманн Б.Г., Вонг Д.Т. (2008) Мишени мРНК слюны для диагностики рака. Устный Онкол 44: 425–429.
15. 15. Парк Нью-Джерси, Чжоу X, Ю Т., Бринкман Б.М., Циммерманн Б.Г. и др. (2007) Характеристика РНК слюны с помощью анализа библиотеки кДНК. Arch Oral Biol 52: 30–35.
16. 16. Park NJ, Li Y, Yu T, Brinkman BM, Wong DT (2006) Характеристика РНК в слюне. Clin Chem 52: 988–994.
17. 17.Palanisamy V, Park NJ, Wang J, Wong DT (2008) Белки AUF1 и HuR стабилизируют мРНК интерлейкина-8 в слюне человека. J Dent Res 87: 772–776.
18. 18. Bogenmann E, Peterson S, Maekawa K, Matsushima H (1998) Регулирование чувствительности к NGF в нейробластоме человека. Онкоген 17: 2367–2376.
19. 19. Kujubu DA, Stimmel JB, Law RE, Herschman HR, Clarke S (1993) Ранние ответы клеток PC-12 на NGF и EGF: влияние K252a и 5′-метилтиоаденозина на экспрессию генов и метилирование мембранных белков.J Neurosci Res 36: 58–65.
20. 20. Fleischhacker M (2006) Биология циркулирующей мРНК: вопросов больше, чем ответов? Ann N Y Acad Sci 1075: 40–49.
21. 21. Коянаги К., Мори Т., О’Дей С.Дж., Мартинес С.Р., Ван Х.Дж. и др. (2006) Ассоциация циркулирующих опухолевых клеток с метилированной ДНК, связанной с опухолью, в периферической крови пациентов с меланомой. Cancer Res 66: 6111–6117.
22. 22. Наглер Р.М., Гез Э., Рубинов Р., Лауфер Д., Бен-Арье Х. и др.(2001) Влияние иммунотерапии на основе низких доз интерлейкина-2 на функцию и состав слюны у пациентов с метастатической почечно-клеточной карциномой. Arch Oral Biol 46: 487–493.
23. 23. Yamano S, Atkinson JC, Baum BJ, Fox PC (1999) Экспрессия цитокинов слюнных желез у мышей NOD и нормальных мышей BALB / c. Clin Immunol 92: 265–275.
24. 24. Яо К., Ли Х, Мурдиастути К., Косуги-Танака С., Акамацу Т. и др. (2005) Липополисахарид-индуцированное повышение и секреция интерлейкина-1бета в подчелюстной железе самцов мышей.Иммунология 116: 213–222.
25. 25. Roeb W, Boyer A, Cavenee WK, Arden KC (2007) PAX3-FOXO1 контролирует экспрессию регулятора клеточного цикла p57Kip2 посредством деградации EGR1. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 18085–18090.
26. 26. Сингх С., Саданандам А., Сингх Р.К. (2007) Хемокины в ангиогенезе и метастазировании опухолей. Раковые метастазы Rev 26: 453–467.
27. 27. Сейнхейв А.Л., Эггермонт А.М., тен Хаген Т.Л. (2008) TNF и манипуляции с интерфейсом опухолевые клетки и стромы: «способы сделать химиотерапию эффективной».Front Biosci 13: 3034–3045.
28. 28. Тейчер Б.А. (2001) Злокачественные клетки, управляющие злокачественным процессом: роль трансформирующего фактора роста-бета. Раковые метастазы Rev 20: 133–143.
29. 29. Ильес Р.К. (2007) Эктопическая экспрессия hCGbeta при эпителиальном раке: злокачественное поведение, метастазирование и ингибирование апоптоза опухолевых клеток. Эндокринол клеток Mol 260-262: 264-270.
30. 30. Kelly K, Huang C (2008) Биологические агенты при немелкоклеточном раке легкого: обзор последних достижений и клинических результатов с акцентом на рецептор эпидермального фактора роста и фактор роста эндотелия сосудов.J Thorac Oncol 3: 664–673.
31. 31. Truzzi F, Marconi A, Lotti R, Dallaglio K, French LE, et al. (2008) Нейротрофины и их рецепторы стимулируют пролиферацию и миграцию клеток меланомы. Дж. Инвест Дерматол 128: 2031–2040.
32. 32. Де Висенте Дж. К., Гарсия-Суарес О., Эстебан И., Сантамария Дж., Вега Дж. А. (1998) Иммуногистохимическая локализация нейротрофинов и рецепторов нейротрофинов в слюнных железах человека и мыши. Анн Анат 180: 157–163.
33. 33.Шутер Е.М. (2001) Первые дни белков фактора роста нервов. Анну Рев Neurosci 24: 601–629.
34. 34. Perrotta C, Bizzozero L, Falcone S, Rovere-Querini P, Prinetti A и др. (2007) Оксид азота усиливает химиоиммунотерапию за счет ингибирования кислой сфингомиелиназы на мышиной модели меланомы. Cancer Res 67: 7559–7564.
35. 35. Boffa DJ, Luan F, Thomas D, Yang H, Sharma VK и др. (2004) Рапамицин подавляет рост и метастатическое прогрессирование немелкоклеточного рака легкого.Clin Cancer Res 10: 293–300.
36. 36. Ли Y, Elashoff D, Oh M, Sinha U, St John MA и др. (2006) Профилирование мРНК человека в сыворотке крови и его полезность для обнаружения рака полости рта. Дж. Клин Онкол 24: 1754–1760.
37. 37. Li C, Wong WH (2001) Анализ массивов олигонуклеотидов на основе моделей: вычисление индекса экспрессии и обнаружение выбросов. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 31–36.
38. 38. де Хун М.Дж., Имото С., Нолан Дж., Мияно С. (2004) Программное обеспечение для кластеризации с открытым исходным кодом.Биоинформатика 20: 1453–1454.
39. 39. Салдана А.Дж. (2004) Java Treeview — расширяемая визуализация данных микрочипа. Биоинформатика 20: 3246–3248.
40. 40. Gao K, Lockwood WW, Li J, Lam W, Li G (2008) Геномный анализ выявляет гены-кандидаты на приобретенную устойчивость к иринотекану в клетках меланомы. Int J Oncol 32: 1343–1349.
41. 41. Gao K, Dai DL, Martinka M, Li G (2006) Прогностическое значение ядерного фактора-kappaB p105 / p50 в меланоме человека и его роль в миграции клеток.Cancer Res 66: 8382–8388.

Оптогенетическое молчание на основе калиевых каналов | Nature Communications

Эксперименты на животных

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Директиве 2010/63 / ЕС Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях, и были одобрены местными властями Баден-Вюртемберга. (Regierungspräsidium Freiburg, X-16 / 10R), Бавария (Правительство Верхней Баварии / Regierung Oberbayern, AZ.55.2-1-54-2532-101-12), Берлин (правительство земли Берлин / Landesamt für Gesundheit und Soziales, G0092 / 15 и G150 / 17) и Северный Рейн-Вестфалия (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein Westfalen (LANUV ), AZ 84-02.04.2014.A254), Германия. Для животных, использованных в исследовании, не проводилась рандомизация или ослепление. Мы не проводили анализ мощности для определения размера выборки до экспериментов, так как целью нашего исследования было создание новой технологии без предварительных знаний о размере и вариабельности эффекта.Если не указано иное, все химические вещества были приобретены у Sigma Aldrich, Carl Roth, Tocris и Thermo Fisher Scientific. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Молекулярная биология

Последовательности ДНК, кодирующие SthK, bPAC, NgPAC1, TpPAC, OaPAC и IcPAC (№ WP051071283.1), были получены путем генного синтеза. Были использованы две конфигурации конструкции (рис. 1а). В расщепляемой конфигурации (сплит-PAC-K) канал SthK отделен от PAC пропущенным пептидом рибосомы 2A из тешовируса-1 свиньи (P2A) ⁵⁶ .В варианте слитого белка (слитый-PAC-K) SthK связан с С-концом PAC (TpPAC или bPAC) пептидной последовательностью (PRTYETSQVAPAGAP). Во всех случаях mCherry служил флуоресцентным маркером. Длина волны, используемая для возбуждения mCherry, не перекрывалась со спектром возбуждения PAC. Кассеты экспрессии для PAC-SthK-T2A-mCherry и SthK-P2A-PAC-Cherry были субклонированы в плазмиду на основе pCS2-CMV для характеристики в клетках ND7 / 23. Различные варианты PAC (рис. 1б, в, дополнительный рис.1a, b) сравнивали с использованием расщепляемой конфигурации PAC-K.

Для экспрессии в кардиомиоцитах SthK-P2A-bPAC (wt) -mCherry или bPAC (S27A) -SthK-T2A-mCherry были клонированы в pAdeno-CMV (Clontech) с использованием аденовирусной системы Adeno-X (Clontech). Аденовирус был предоставлен Viral Core Facility Charité — Universitätsmedizin Berlin, Германия.

Аналогичным образом мы разработали две конструкции вирусной экспрессии для нейрональной экспрессии: для конфигурации расщепленного PAC-K мы вставили SthK-P2A-bPAC (wt) -mCherry или SthK-P2A-TpPAC-mCherry в вектор экспрессии AAV CW3SL ⁵⁷ , содержащий небольшой промотор CaMKIIα и химерный элемент WPRE / поли-А.Для конфигурации слитого-PAC-K мы создали AAV, кодирующий bPAC (S27A) -SthK-T2A-mCherry, с промотором синапсина, управляющим экспрессией конструкции. Для экспериментов с участием ChR bReaChES со смещением в красную область, EGFP-P2A-bReaChES был получен путем синтеза гена и вставлен в CW3SL. Таким образом, SthK-P2A-bPAC-mCherry и EGFP-P2A-bReaChES экспрессировались отдельными AAV. Для Cre-зависимой экспрессии сайленсера PAC-K, Sthk-P2A-bPAC-Cherry вставляли в кассету Flex-and-Excision (FLEX) ⁵⁸ ниже промотора синапсина.Аденоассоциированные вирусные частицы серотипа 9 или 1 получали согласно опубликованным протоколам ⁵⁹ . Вкратце, клетки HEK 293 (ATCC CRL-1573) трансфицировали смесью pAD deltaF6, pAAV2 / 9 или pAAV 2/1 и вектора экспрессии AAV. Через 48 часов после трансфекции клетки ресуспендировали, собирали центрифугированием, лизировали в 50 мМ Трис-Cl, 150 мМ NaCl и вирусные частицы очищали с использованием процесса очистки в градиенте йодиксанола. См. Дополнительную таблицу 2 для использования различных конструкций в каждом отдельном эксперименте.

Комбинированная визуализация уровней цАМФ и электрофизиология

Вирусную трансдукцию датчика цАМФ проводили в соответствии с протоколом производителя (анализ красного флуоресцентного цАМФ, Montana Molecular). Вкратце, 9 × 10 ⁴ клеток HEK 293 смешивали с исходным раствором BacMam, полной средой и бутиратом натрия и помещали на покровные стекла в многолуночный планшет. Клетки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, а затем в течение 24 ч при 37 ° C и 5% CO ₂ .Через 24 часа клетки трансфицировали слитой конструкцией bPAC-SthK с использованием липофектамина 2000 (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом производителя. Через 24–48 ч после трансфекции клетки переносили в записывающую камеру, размещенную на инвертированном микроскопе (Olympus IX71). bPAC стимулировали с помощью ксеноновой разрядной лампы (JML-C2, Rapp OptoElectronik) при 100 В, проходящей через возбуждающий фильтр 470 нм (Semrock, США). Флуоресценцию cADDis регистрировали с использованием одноклеточной флуорометрической системы (Photon Technology International) с возбуждающим светом 560 ± 3 нм; излучение проходило через фильтр 641/75 нм (Semrock) на фотоумножитель для счета фотонов.Токи регистрировали в режиме фиксации напряжения (-40 мВ) в цельноклеточной конфигурации с помощью усилителя Axopatch 200B (Molecular Devices). Внеклеточный раствор содержал (в мМ): NaCl 140, KCl 5,4, MgCl ₂ 1, CaCl ₂ 1,8, HEPES 5, глюкозу 10, pH доведенный до 7,4 с помощью NaOH. Внутриклеточный раствор содержал (в мМ): NaCl 10, KAsp 130, EGTA 1, MgCl ₂ 1, Na ₂ ATP 2, HEPES 10, pH доведенный до 7,2 с помощью КОН.

Электрофизиология клеток ND7 / 23

Клетки ND7 / 23 (ECACC 920