Диагностика методом пцр: Не удалось найти представление [name, type, prefix]: category, pdf, contentView

Содержание

расшифровка и применение — АЛТ Украина ЛТД

К нам часто поступает множество вопросов, касающихся такого метода лабораторной диагностики как ПЦР. В своей статье, мы постарались рассмотреть самые актуальные из них.

Надеемся наш материал будет полезным для Вас!

Что такое ПЦР-диагностика?

ПЦР-анализ (полимеразная цепная реакция) — это высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, основанный на анализе генетического материала (ДНК и РНК). Для диагностики используется слюна, кровь, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы, в зависимости от целей исследования.

Какие опасные инфекции можно выявлять в реанимации методом ПЦР?

Методом ПЦР можно выявлять любые опасные инфекции, которые приводят к критическому состоянию пациента. Своевременное выявление инфекционного агента, вызвавшего данное состояние, позволит правильно скорректировать лечение и спасти жизнь.

Подойдёт ли этот метод для скрининга, для подтверждения диагноза?

Скрининговый анализ, в общем понимании, действительно не совсем подходящий метод для неотложной медицины. Скрининг, по большей части, является профилактическим мероприятием и представляет собой массовые тотальные исследования по выявлению скрытых, внешне не проявляющихся или недавно начавшихся патологических процессов у пациентов. Например, ПЦР-диагностика прекрасно используется в гинекологической практике для скрининга вируса папиломы человека (ВПЧ) или болезней, передающихся половым путём (ЗППП). Также ПЦР метод широко используется для скринингового тестирования плазмы крови на предмет выявления вирусов гепатита В, С, D, E. И так далее.

Для скрининга эффективнее использовать ныне устаревающий метод ИФА или современной ИХЛА?

С методами ИФА и ИХЛА не всё так однозначно. Они выявляют косвенные признаки патологических изменений и это является их главным недостатком. Организму на вредное воздействие необходимо вначале сформировать иммунный ответ, наработать антитела, которые в последующем возможно выявить только со временем.

Может возникнуть ситуация, когда организм уже заражен какой-либо инфекцией, а антител к ней еще нет или их титр находится ниже порога чувствительности тест-набора. Или наоборот – возбудителя уже нет в организме, а антитела ещё выявляются.

Хронологически метод ПЦР в клинической практике появился позже ИФА и ИХЛА и по факту является более современным. По показателям специфичности и чувствительности ПЦР выше данных иммунологических методов. К тому же ПЦР-анализ выявляет прямую первопричину процессов – их генетическую основу, а не следствие. Для получения нужного результата при постановке ПЦР нет необходимости выявлять весь геном мишени. Задачи по анализу всего генома решаются с помощью других методов (например, таргетный или полногеномный анализ с помощью секвенирования нового поколения – NGS). С помощью ПЦР-теста выявляется высоко консервативный фрагмент ДНК (определённая нуклеотидная последовательность), однозначно характеризующий мишень. А при методе ПЦР в реальном времени можно даже определить изначальное количество мишени в пробе.

Что этот метод даст для лечения и выявления мультирезистентного штама микобактерий?

Выявление мультирезистентных шаммов позволит изначально не использовать те антибиотики, к которым у возбудителя существует генетически обусловленная стойкость, а использовать другие препараты. Например против штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к Изониазиду и Рифампицину сразу применять фторхинолоны или инъекционные препараты.

Можно ли при ВИЧ вылечить чувствительные штаммы?

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вообще не восприимчив ко антибиотикам и противомикробным препаратам, потому что не является бактерией. Против вирусов необходимо применять противовирусные препараты. Трудность лечения вирусных заболеваний вообще и СПИДа в частности обусловлена их биологической особенностью – активная фаза жизнедеятельности вируса проходит только внутри живой клетки. Поэтому вирусные частицы защищены от воздействий внешней среды. Уничтожить вирус можно только с клеткой, в случае с ВИЧ – с клеткой иммунной системы.

Как исследование соотношения субпопуляций лейкоцитов выявляет онкомаркеры?

Числовое значение соотношения субпопуляций лейкоцитов является индикаторным или маркерным показателем наличия онкологического процесса, т.е. одним из онкомаркеров. В норме и при патологии данное значение отличается. Например, при значениях CD4+/CD8+ в диапазоне от 1,2 до 2,6 может свидетельствовать о возможном наличии в организме множественной миеломы или солидных опухолей. Увеличение значения более до 3 и более может указывать на острый Т-лимфобластный лейкоз или хронический Т-лейкозе. И т.д. Другими словами –в данном случае преобладание Т-хелперов над Т-киллерами специфически информативно.
Но онкомаркеры могут быть и генетическими. На сегодняшний момент обнаружены тысячи мутантных аллелей генов, которые с той или иной вероятностью могут приводить к развитию онкологического процесса. На рынке существует множество тест-систем для выявления онкомаркеров разных производителей.

Рак шейки матки целесообразно предотвращать (или диагностировать на ранней – внутриэпителиальной стадии) до его развития путём разработки и внедрения государственных программ по тотальному скринингу женщин на наличие ВПЧ с регулярными подтверждающими цитологическими исследованиями. Также огромным фактором по своевременному предотвращению данного заболевания будет внедрение вакцинации против ВПЧ всех младенцев при рождении (и мальчиков и девочек).

ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний

ПЦР — диагностика (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, который основывается на исследовании генетического материала человека (ДНК и РНК). В зависимости от цели исследования используются кровь, слюна, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы.

ПЦР — анализ

Часто бывает, что различные по своей природе вирусы могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. ПЦР анализ позволяет определить наличие возбудителя, даже при минимальном содержании его штаммов в биологическом материале, а в отдельных случаях, выявляет даже единичные клетки вирусов или бактерий. Определяется вирус, природа его появления, устанавливается сила его воздействия на организм и количество имеющихся микробов в организме. Эта информация важна для лечащего врача при выборе лекарственных препаратов и назначении методов лечения.

В настоящее время ПЦР тест позволяет выявлять все известные современной медицине вирусные заболевания. В том числе даже те, которые могут годами «жить» в организме человека и не проявлять себя, ожидая наиболее комфортных условий для своей «работы». Диагностика «растущих» длительное время возбудителей особенно актуальна в гинекологии и урологии.

В медицинской лаборатории «Синэво» можно пройти ПЦР — диагностику по следующим заболеваниям:

Гепатит B и C

Проведение ПЦР — диагностики необходимо здесь в силу того, что вирус гепатитов имеет продолжительный инкубационный период (до 180 дней) и достаточно серьезные последствия, вплоть до летального исхода.

ИППП

Заболевания, передающиеся половым путем: уреплазмол половых органов, хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз. Коварство заключается в том, что симптомы данных заболеваний зачастую на ранних стадиях «стерты». Эта группа заболеваний опасна тем, что может вызвать у женщин бесплодие, оказывает серьезное влияние на течение беременности, увеличивает риск развития рака шейки матки. У мужчин снижается подвижность и жизнеспособность сперматозоидов, вызывая мужское бесплодие, поражается мочеиспускательный канал и развивается простатит. Увеличиваются риски заболевания генитальным герпесом, а так же ВИЧ/СПИД. Пакет 18.1 «Обследование на ИППП».

Сдать анализ рекомендуется и супругам, желающим родить здорового ребенка. Ведь только ПЦР — диагностика позволяет выявить скрытые инфекции в организме и предотвратить их проникновение в организм плода.

Герпес

Опасное и устойчивое заболевание. Зачастую болезнь не системна и протекает долгие годы в неактивном режиме. При этом возможны проявления, похожие на симптомы герпеса. Но истекают они так быстро, что не возможно точно поставить диагноз традиционным способом. Опасность герпеса в том, что он может поражать центральную нервную систему и стать причиной развития менингита и энцефалита. См. услуги ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (соскоб) и ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (кровь, качественное определение).

Тест на отцовство

Благодаря ПЦР — диагностике инфекции выявляются на начальном этапе их развития, что способствует скорейшему выздоровлению и предотвращению серьезных осложнений.

Анализ: Молекулярная диагностика методом ПЦР (соскоб) — сдать в Москве и в Раменском недорого

Молекулярная диагностика методом ПЦР (соскоб): цена

Chlamydia trachomatis 300 p.

Mycoplasma hominis 300 p.

Mycoplasma genitalium 300 p.

Ureaplasma spp. 300 p.

Gardnerella vaginalis 300 p.

Trichomonas vaginalis 300 p.

Neisseria gonorrhoeae 300 p.

Candida albicans 300 p.

Herpеs simpl. Virus I/II 300 p.

Epstein-Barr virus (Herpes-4) 300 p.

Cytomegalovirus (Herpes-5) 300 p.

Human papilloma virus 16,18 400 p.

Human papilloma virus 6,11 340 p.

Human papilloma virus 31,33 400 p.

Lactobacillus spp. 300 p.

Mobiluncus curtisii 300 p.

Prevotella spp. 300 p.

Определение типа папилломавируса высокого канцерогенного риска (16,18,31,33,35,39,45,52,56,58,59,68) 850 p.

Кол. определение папилломавируса канцерогенного риска суммарного (16,18,31,33,35,39,45,51,56,59,68) 950 p.

Метод ПЦР диагностики — что показывает ПЦР тест, точность исследования

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (англ. — PCR — polymerase chain reaction) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.

ПЦР — это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (ДНК) инфекционного возбудителя и многократно размножить его.

В диагностике инфекций передаваемых половым путем (ИППП) также используются следующие методики:

  • микроскопия — исследование неокрашенных и окрашенных препаратов в светооптическом микроскопе. Точность метода зависит от опыта врача-лаборанта. Как правило хорошо диагностируются гонококки, трихомонады, гарднереллы и кандиды (бактерии больших размеров). Другие инфекции не видны под микроскопом, так как очень маленького размера.
  • бактериология — культивирование (выращивание) инфекций на питательных средах. До практического использования ПЦР, бактериальное исследование считалось «золотым стандартом» в диагностике ИППП, т. е. самым точным методом. Большим плюсом данной методики является возможность определения чувствительности микробов к антибиотикам. Минусом — необходимость быстрой доставки клинического материала в лабораторию, пока микробы не погибли в окружающей среде, не все ИППП растут на питательных средах, необходимость использования качественных питательных сред, сроки получения результатов — 5 — 7 дней.
  • иммуноферментный анализ — определение специфических антител (белков), вырабатываемых в ответ на внедрение микробов (антигенов) в сыворотке крови. То есть выявляют не сам микроб, а антитела которые вырабатывает организме человека. Плюсом метода является возможность определение стадии инфекционного процесса (в острой стадии определяются иммуноглобулины (антитела) класса М, в хронической — иммуноглобулины класса G). Минусом — отсутствие выработки антител у пациентов с иммунодефицитом, перекрестная реакция антител со схожими микробами, низкие показатели чувствительности и специфичности. На основании результатов только ИФА без подтверждения другими методами диагностики и при отсутствии клинических проявлений выставлять диагноз не представляется возможным.

В настоящее время ПЦР является самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний. Точность любого метода диагностики в медицине оценивается такими понятиями как чувствительность и специфичность.

 

Чувствительность — процент положительных результатов среди обследованных инфицированных лиц. Это значит, что при обследовании 100 человек больных хламидиозом методом ПЦР диагноз будет подтвержден у 98-99 человек, а у 1-2 человек из 100 будет установлен ложноотрицательный результат. Чувствительность ИФА в диагностике инфекций передаваемых половым путем — 50-60%. Это значит, что у 40-50 людей из 100 больных хламидиозом возможен ложноотрицательный результат.

Специфичность — процент отрицательных результатов среди обследованных здоровых лиц. Это значит , что при обследовании 100 здоровых людей на хламидии методом ПЦР у 97-98 обследуемых покажет отрицательный результат, а у 2-3 человек возможен ложноположительный результат. Специфичность ИФА составляет 60-70%. 

Ниже приведены показатели чувствительности и специфичности методов диагностики инфекций передаваемых половым путем.

Метод диагностики

Чувствительность, %

Специфичность, %

Микроскопия

20 — 60

70 — 80

Бактероилогия

40 — 80

80 — 90

ИФА -серология

50 — 60

60 — 70

ПЦР

98 — 99

97 — 98

Как видно из таблицы метод ПЦР обладает наилучшими результатами в диагностике инфекции передаваемых половым путем. Именно поэтому можно получить разные результаты исследования у одного человека, если он обследован разными методами диагностики. Но приоритет всегда должен отдаваться ПЦР, как самому точному из всех. 

На сегодняшний день существует 2 методики ПЦР-анализа: так называемая «форезная» и «ПЦР в реальном времени» (более современная).

Основным приемуществом методики ПЦР в реальном времени по сравнению с форезом является:

  • сведение к минимуму риска контаминации (загрязнение) лаборатории и связанных с ней ложно-положительных результатов и артефактов ПЦР-анализа
  • упрощение требований к организации лаборатории — отсутствует необходимость в изолированном дополнительном помещении для проведения этапа детекции и отдельного врача -лаборанта
  • автоматический анализ результатов с помощью компьютера, стандартизация результатов, исключение субъективности результатов (при форезной методике результат исследования определяется врачем-лаборантом, а при ПЦР в реальном времени — компьютером)
  • возможность количественной оценки содержания ДНК возбудителя в клиническом образце

Несмотря на высокую точность анализов, не редки случаи получения противоположных результатов в разных ПЦР-лабораториях. Это объясняется многими факторами. Критериями качественной работы лаборатории является:

  • использование сертифицированных тест — систем, обладающих высокой аналитической чувствительностью
  • использование внутренних и внешних контролей работы лаборатории
  • высокая воспроизводимость результатов (95 — 98%)
  • современное оборудование
  • квалифицированные специалисты
  • борьба с контаминацией (загрязнением лаборатории продуктами амплификации)
  • правильное расположение «рабочих» зон лаборатории
  • при наличии сомнительных результатов и артефактов ПЦР-анализа — их перестановка на различных этапах
  • архивирование результатов исследований с возможностью их просмотра в спорных случаях.

Таким образом, только сочетание грамотного специалиста и качественно работающей лаборатории могут обеспечить постановку правильного диагноза и как следствие быстрого и полного выздоровления. Если возникает несоответствие клинической картины с результатами лабораторных исследований, необходимо повторное проведение анализов. Единственное нужно понимать, что подтвердить диагноз, поставленный методом ПЦР, можно только методом ПЦР, выполненным в другой лаборатории или повторно в этой же, так как другие способы диагностики сильно уступают вышеуказанному методу диагностике.


Если вы хотите сдать ПЦР-анализы и получить профессиональную диагностику, то специалисты нашей клиники готовы оказать вам действительно качественные услуги.

Специализированное научно-практическое издания для ветеринарных врачей и студентов ветеринарных ВУЗов.

Toggler

Выпуски журнала по годам

Контакты журнала

vetpeterburg

Подпишись на новости

Вы можете подписаться на нашу новостную рассылку.
Для этого нужно заполнить форму, указав ваш почтовый e-mail.
Рассылка осуществляется не более 5-6 раз в год.
Администрация сайта никогда ни при каких обстоятельствах не разглашает и не передает другим лицам данные о пользователях сайта.


Покупка бумажной версии Чтобы приобрести бумажную версию журнала необходимо оформить заказ и оплатить его онлайн.
Доставка выполняется Почтой России.
Стоимость экземпляра журнала указанна с учетом доставки. 
По вопросам рассылки в другие странны обращайтесь к заместителю главного редактора: [email protected]
Предзаказ Доставка для клиник

Для ветеринарных клиник г. Санкт-Петербурга и Лен. области.
Доставка производится курьером на адрес клиники в количестве одного экземпляра.
Для оформления доставки необходимо заполнить форму. Подписка на доставку оформляется один раз и действует до тех пор, пока представитель вашей организации не подаст заявку на отмену доставки.


Оформить доставку

ПЦР-диагностика

Парк Победы

Чтобы добраться от метро «Парк Победы» (Калининско-Солнцевская) до клиники Вам нужно выйти из метро (выход №4), пройти до автобусной остановки «Метро Парк Победы», проехать 2 остановки до «Поклонная улица». Перейти дорогу, пройти левее до памятника Гризодубовой и повернуть направо. Вы увидите вывеску нашей клиники.

Время в дороге составит 8 минут.

Студенческая

Чтобы доехать от метро «Студенческая» до клиники Вам нужно проехать до метро «Кутузовская» выйти и повернуть налево (выход из последнего вагона из центра), идти прямо и перейти дорогу. Далее пройти до памятника Гризодубовой и повернуть направо. Вы увидите вывеску нашей клиники.

Время в дороге составит 10 минут.

Фили

Чтобы доехать от метро «Фили» до клиники Вам нужно проехать до метро «Кутузовская» выйти и повернуть налево (выход из последнего вагона из центра), идти прямо и перейти дорогу. Далее пройти до памятника Гризодубовой и повернуть направо. Вы увидите вывеску нашей клиники.

Время в дороге составит 17 минут.

Кутузовская

Чтобы добраться от метро «Кутузовская» до клиники Вам нужно выйти из метро и повернуть налево (выход из последнего вагона из центра), идти прямо и перейти дорогу. Далее пройти до памятника Гризодубовой и повернуть направо. Вы увидите вывеску нашей клиники.

Время в дороге составит 7 минут.

Деловой центр

Чтобы доехать от МЦК «Деловой центр» до клиники Вам нужно проехать до МЦК «Кутузовская» выйти и повернуть налево (выход из последнего вагона из центра), идти прямо и перейти дорогу. Далее пройти до памятника Гризодубовой и повернуть направо. Вы увидите вывеску нашей клиники.

Время в дороге составит 15 минут.

Международная

Чтобы доехать от метро «Международная» до клиники Вам нужно перейти на МЦК «Деловой центр» проехать до МЦК «Кутузовская» выйти и повернуть налево (выход из последнего вагона из центра), идти прямо и перейти дорогу. Далее пройти до памятника Гризодубовой и повернуть направо. Вы увидите вывеску нашей клиники.

Время в дороге составит 16 минут.

Выставочная

Чтобы доехать от метро «Выставочная» до клиники Вам нужно проехать до метро «Кутузовская» выйти и повернуть налево (выход из последнего вагона из центра), идти прямо и перейти дорогу. Далее пройти до памятника Гризодубовой и повернуть направо. Вы увидите вывеску нашей клиники.

Время в дороге составит 20 минут.

Медицинский центр в Туле — клиника Л-Мед

Так, к настоящему времени метод амплификации нуклеиновых кислот (НК) полимеразной цепной реакцией (ПЦР) уже достаточно широко используется в практической медицине как эффективный инструмент лабораторной диагностики.

Метод ПЦР при выявлении ДНК включает три стадии:

На первой стадии при температуре 94°С (или выше) происходит денатурация двойной цепи исследуемой ДНК (стадия денатурации).

На второй стадии два олигонуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к определенным участкам антипараллельных цепей исследуемой ДНК, связываются (образуют гибриды с помощью водородных связей) с этими участками ДНК (стадия отжига).

На третьей стадии при температуре 70-72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы и дезоксинуклеозид-5ў-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с исследуемой ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи ДНК (стадия полимеризации).

Таким образом, за цикл, включающий три стадии, происходит удвоение каждой из двух антипараллельных цепей ДНК. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества исходной ДНК в миллион и более раз.

Наличие специфического продукта ПЦР (ампликона) в подавляющем большинстве случаев детектируют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и положительному ДНК-контролю. Дополнительные доказательства специфичности ампликона получают методами рестрикционного анализа, гибридизации и прямого секвенирования.

Основным достоинством метода ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность анализа – до 1 копии геномной ДНК возбудителя инфекции в исследуемой пробе в «nested»-варианте ПЦР (с «внутренней» и «внешней» парами олигонуклеотидов-праймеров). Чувствительность выявления ДНК в ПЦР с одной парой праймеров составляет обычно 30-100 копий генома в исследуемой пробе.

Для ПЦР-анализа РНК-содержащих инфекционных агентов (например, ВГС, ВКЭ) предварительно проводят стадию обратной транскрипции – получения ДНК, комплементарной вирусной РНК-матрице, для чего используют специфические праймеры к РНК и фермент – РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу, ревертазу). Далее ПЦР-анализ проводят по схеме, описанной выше.

Возможности, заложенные в методе ПЦР, позволяют, с одной стороны, достигать максимальной специфичности анализа, т. е. отсутствия перекрестных реакций и способности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. С другой стороны, соответствующий выбор олигонуклеотидов-праймеров, в основном определяющих специфичность анализа ПЦР, позволяет одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Другим достоинством ПЦР-метода является то, что для ПЦР-диагностики практически всех инфекционных заболеваний может быть использован один набор оборудования, универсальные процедуры подготовки пробы и постановки анализа, а также незначительно отличающиеся (в основном структурой олигонуклеотидов-праймеров) наборы реактивов. К настоящему времени метод автоматизирован и позволяет, при необходимости, получать результаты анализа ПЦР в течение одного рабочего дня.

Высокая чувствительность и специфичность, непосредственное обнаружение инфекционного агента и возможность проведения генотипирования определяют широкую область применения метода ПЦР в клинической диагностике. В настоящее время метод ПЦР используется для:

  • ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно;
  • выявления персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекций;
  • контроля эффективности лечения;
  • диагностики оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протекания заболевания;
  • разрешения сомнительных результатов серологических исследований;
  • эпидемиологических исследований;
  • выявления наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов;
  • исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии;
  • определения резистентности к лекарственным препаратам.

Метод ПЦР используется для постановки или подтверждения диагноза, контроля терапии в акушерско-гинекологической практике, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, гепатологии, пульмонологии, офтальмологии, неврологии, фтизиатрии и др.

Методы ДНК-диагностики незаменимы в пренатальной диагностике наследственных заболеваний (муковисцидоза, фенилкетонурии, гемофилии и пр.), а также при установлении отцовства.

Следует отметить, что широкое использование ДНК-диагностики ни в коей мере не отменяет методы иммунохимических исследований (ИФА, ПИФ, РИФ и др.), а дополняет их. Комплексное обследование пациента различными методами дает возможность врачу-клиницисту получить более полную информацию, как о наличии инфекционного агента, так и об иммунном статусе, что позволяет более точно ставить диагноз, назначать соответствующее этиотропное лечение и вести его последующий контроль.

Организация работ по выявлению ДНК методом ПЦР

В связи с высокой чувствительностью метода ПЦР существует опасность получения ложноположительных результатов в силу переноса через предметы и реагенты как самой ДНК-матрицы, так и продуктов ПЦР – ампликонов, получаемых в больших количествах в течение ежедневной работы. Причинами получения ложноположительных результатов являются три вида контаминаций:

  1. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов.
  2. Контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена, часто использующимися в качестве положительного контроля.
  3. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложно-положительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы.

Вследствие этого при проведении работ с использованием метода ПЦР необходимо соблюдать следующие правила:

  1. Территориально разделять различные стадии анализа ПЦР, размещая их в различных помещениях:
    • помещение для подготовки проб;
    • помещение для постановки ПЦР;
    • помещение для детекции результатов ПЦР.
    Кроме того, подготовку реагентов для выделения НК, проведения ПЦР и детекции результатов ПЦР предпочтительно проводить в отдельном помещении (пре-ПЦР, биохимическая).
  2. Для каждой стадии анализа должен быть свой комплект лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования.
  3. Работу на всех этапах проводить только с использованием одноразовых расходных материалов: пробирок, наконечников для пипеток и пр.
  4. Необходима постоянная постановка отрицательных контрольных образцов как на реагенты для подготовки проб (выделение ДНК), так и на реагенты для проведения ПЦР.
  5. Работу должен проводить специально обученный персонал, обладающий достаточной квалификацией в данной области.
  6. Для контроля чувствительности проводимого ПЦР-анализа необходима постоянная постановка положительных контрольных образцов.

Требования к организации работ в ПЦР-лабораториях обобщены и сформулированы в нормативных документах, на основании которых соответствующие комитеты лицензируют их деятельность:

  1. «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения». 1995, Госсанэпиднадзор.
  2. «Требования к планировке помещений и режиму работы в ПЦР-генодиагностической лаборатории». Методические рекомендации, разработаны ЦНИИЭ, РНИПЧИ, ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Эффективный путь в использовании и развитии методов генодиагностики – это создание централизованных ПЦР-лабораторий, оборудованных и организованных в соответствии с необходимыми требованиями и имеющих квалифицированный персонал.

Для получения правильных результатов анализа ПЦР весьма важна организация забора клинических образцов, их хранения и транспортировки. Неправильный забор образцов, некачественное хранение и доставка может привести как к ложноположительным, так и ложноотрицательным результатам, несмотря на безупречно проведенную процедуру анализа.

Забор проб. Для ПЦР анализа используют разнообразный клинический материал: кровь, сыворотку крови, форменные элементы крови, мочу, слюну, соскобы и мазки со слизистых, ликвор, слезную жидкость, содержимое везикул, биоптаты органов и тканей. Для исключения контаминации забор проб производят только одноразовым инструментарием (шприцы, соответствующие зонды, пробоотборники и пр.). Взятый для ПЦР-анализа материал мазка, соскоба помещают в одноразовые пробирки (например, типа «Эппендорф») или тщательно вымытые (хромовой смесью) стеклянные флаконы, а в некоторых случаях в транспортную среду, предоставляемую ПЦР-лабораторией. При необходимости переноса образца используют автоматические микропипетки со сменными одноразовыми наконечниками. Каждый образец для исключения взаимной контаминации хранят и транспортируют в отдельном полиэтиленовом пакете.

Хранение образцов. До транспортировки в ПЦР-лабораторию отобранный биоматериал хранят при температуре 2-4 °С не более 48 ч; для более длительного хранения (до 1 месяца) используют максимально низкую температуру. Необходимо минимизировать время от забора образца до постановки ПЦР-анализа.

Транспортировка образцов.Осуществляется в сумках-холодильниках, термоконтейнерах, термосах с термопакетами, льдом или сухим льдом.

Своевременное выявление этиологических агентов внутриутробных, интранатальных и постнатальных инфекций у новорожденных позволило врачам провести эффективную целенаправленную терапию и значительно снизить тяжелые последствия заболеваний, а также количество летальных исходов. По результатам этих исследований в настоящее время оформляются методические рекомендации по диагностике внутриутробных инфекций методом ПЦР.

Стандартный тест на коронавирус, если он доступен, работает хорошо, но могут ли новые методы диагностики помочь в этой пандемии? | Наука

Врач в Германии готовит мазок для анализа на коронавирусную инфекцию.

Дэниел Рейнхардт / фото альянс через Getty Images

Автор Роберт Ф.Service

По мере того, как Соединенные Штаты стремятся активизировать тестирование на пандемический коронавирус с использованием технологии, основанной на проверенной и проверенной полимеразной цепной реакции (ПЦР), начинают внедряться альтернативные подходы, которые могут упростить и ускорить изучение людьми того, нужно ли они были инфицированы. Некоторые методы модифицируют стандартный тест ПЦР, который усиливает крошечные кусочки генетического материала для обнаружения, тогда как другие секвенируют вирус напрямую или используют редактор генома CRISPR.

Грядут более быстрые и дешевые тесты, — говорит Эван Джонс, генеральный директор OpGen, компании по быстрой диагностике. Однако, добавляет он, разработка новых видов тестов «займет время». Некоторые из новых тестов уже поступают в онлайн, но для проверки других, вероятно, потребуются месяцы, и они будут готовы к широкому распространению.

«Тестирование, тестирование, тестирование» — это мантра, которую снова и снова повторяет Генеральный директор Всемирной организации здравоохранения Тедрос Адханом Гебрейесус. Диагностические тесты, выявляющие активные инфекции у людей, жизненно важны для усилий общественного здравоохранения, а не только для здоровья людей.Широко распространенное диагностическое тестирование, наряду с изоляцией инфицированных, отслеживанием контактов и помещением в карантин этих контактов, похоже, сыграло ключевую роль в работе Южной Кореи по подавлению распространения вируса.

Связанные

В Соединенных Штатах медленное развертывание ПЦР-тестов на коронавирус широко объясняется сочетанием строгих правил, направленных на обеспечение их надежности, и сложной сети компаний и систем здравоохранения, ответственных за разработку, проведение и оплату тестов.Администрация Трампа заявляет, что тестирование ускоряется. 16 марта на пресс-конференции в Белом доме помощник министра здравоохранения и социальных служб США Бретт Джируар заявил, что страна сможет обработать 1 миллион тестов к концу недели и 2 миллиона на следующей неделе. Но реальные цифры еще не близки к этому. Согласно данным, собранным в рамках проекта отслеживания COVID, некоммерческого сотрудничества представителей общественного здравоохранения и журналистов, подсчитывающих тесты, проведенные в Соединенных Штатах, по состоянию на 22 марта была проведена 191 541 ПЦР-диагностика, из которых 24 345 из них оказались положительными на вирус.

29 февраля Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) опубликовало новые правила, разрешающие экстренное использование тестов на коронавирус помимо тех, которые производятся и распространяются Центрами США по контролю и профилактике заболеваний. Академические вирусологические лаборатории, департаменты здравоохранения и компании начали создавать свои собственные тесты ПЦР. Сегодня около четырех десятков организаций получили одобрение FDA на свои тесты. Среди крупнейших — диагностические компании, такие как Roche Molecular Systems, получившая на этой неделе зеленый свет на проведение испытаний со стороны Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. По словам Александра Валсамакис, главного медицинского директора компании, на начальном этапе она будет предоставлять около 400 000 тестов в неделю в США и 3 миллиона во всем мире. Другие крупные компании также недавно получили одобрение на свои тесты, в том числе Thermo Fisher Scientific и Abbott Laboratories.

университетских вирусологических лабораторий также вскочили в лазарет, чтобы помочь диагностировать случаи заболевания поблизости от них. Например, на прошлой неделе врачи Медицинского центра Университета Питтсбурга (UPMC) начали использовать самодельный ПЦР-тест для проверки на наличие инфекции в округе Аллегейни.На данный момент количество тестов остается небольшим, около 100 в неделю. «Нам определенно хотелось, чтобы мы начали это раньше, — говорит Алан Уэллс, возглавляющий клинические лаборатории UPMC.

ПЦР — это наиболее часто используемый тест для диагностики коронавируса, поскольку он очень точен. (См. Как работает наиболее распространенный тест на коронавирус?) Но его ограничивают другие проблемы. «Нам не удалось добиться необходимого улучшения», — говорит Стивен Волински, врач-инфекционист Северо-Западного университета. Каждый тест занимает около 4 часов после того, как образец поступает в централизованную лабораторию тестирования, с разделением времени между подготовкой образца и фактическим тестом ПЦР.С транспортом и очередями получение результата может занять от 2 до 4 дней. За это время инфицированные люди могут передать вирус многим другим.

Самостоятельная тампона

В диагностический ландшафт коронавируса добавляется еще одно новое измерение: «домашние» тесты, которые включают отправку образца, взятого дома, в лабораторию. Например, завтра Everlywell планирует начать поставки комплектов на дом и в розничные аптеки. Эти тесты начнутся со скрининговых вопросов в Интернете или в магазине, чтобы определить, вероятно ли, что человек подвергся воздействию вируса.Если да, они могут получить набор для отбора проб из носоглотки по почте или купить его у местного продавца. Человеку будут даны подробные инструкции о том, как ввести свой мазок, вставить его в защитный флакон и в течение ночи отправить его по почте в одну из десятков диагностических лабораторий (которые сотрудничают с Everlywell и уже имеют одобрение FDA) для анализа ПЦР.

Франк Онг, главный медицинский и научный директор Everlywell, говорит, что компания рассчитывает быстро вырасти с тысячи таких тестов в день до десятков тысяч.Хотя каждый тест, вероятно, потребует 4-дневного ожидания результатов, говорит Онг, эта стратегия домашнего отбора проб имеет серьезные преимущества: она защитит медицинских работников от воздействия потенциальной инфекции и высвободит их время. «Нам нужно убедиться, что мы даем им возможность заботиться о пациентах», — говорит Онг. Другие компании, в том числе Nurx и Carbon Health, заявляют, что теперь они поставляют ограниченные запасы собственных наборов для отбора проб в домашних условиях.

Большинство тестов ПЦР на новый вирус проводится на больших дорогих автоматизированных машинах, которые выполняют множество тестов одновременно. Они есть в крупных больницах или диагностических учреждениях, но сейчас начинает разворачиваться еще один вариант — это небольшие и менее дорогие устройства, которые также выполняют амплификацию нуклеиновых кислот. Они могут использоваться небольшими больницами и даже отдельными врачебными кабинетами.

В пятницу, например, компания Cepheid, которая продает небольшие системы ПЦР для быстрого обнаружения вирусов гриппа, бактерий туберкулеза и других микробов, получила одобрение FDA на экстренное использование тест-картриджа на коронавирус 2 (SARS-CoV-2), который предназначен для экстренного использования. в систему GenXpert компании, устройство размером с кофемашину, которое может выдать диагностический результат всего за 45 минут.Официальные лица Cepheid говорят, что во всем мире установлено 23 000 таких систем, из них 5000 — в Соединенных Штатах. 19 марта GenMark получил одобрение FDA на экстренное использование собственных тестов на коронавирус, которые проводятся на машинах аналогичного размера, в которых используется запатентованный электрохимический подход для обнаружения целевого генетического материала менее чем за 2 часа. Другие компании, спешащие поставить диагностические аппараты для пунктов оказания медицинской помощи, включают Mesa Biotech, HiberGene, Mobidiag и QuantuMDx.

То же самое и с такими компаниями, как Oxford Nanopore и Fulgent Genetics, которые вместо использования ПЦР напрямую секвенируют любой генетический материал в образце, а затем ищут совпадения, скажем, с новым коронавирусом.Этот подход к высокоскоростному секвенированию генов может помочь охарактеризовать геном коронавируса, чтобы лучше понять, как вирус развивается, но он также может быть диагностическим в определенных ситуациях, таких как удаленные сайты без доступа к ПЦР. Портативные устройства Oxford Nanopore использовались во время вспышек лихорадки Эбола, и компания отправила их в Китай на ранних этапах пандемии.

CRISPR для тестирования

Самый быстрый способ тестирования на коронавирус в конечном итоге может быть предложен компаниями, использующими редактор генома CRISPR, более известный тем, что он добавляет или удаляет ДНК в клетках. Две американские компании, Mammoth Biosciences и Sherlock Biosciences, заявляют, что они создали тесты на основе CRISPR и в настоящее время проверяют их на образцах пациентов, прежде чем обращаться за разрешением на экстренное использование в FDA. Метод начинается с образца пациента, извлекается вирусная РНК и используется тест быстрой амплификации нуклеиновых кислот, называемый петлевой амплификацией, чтобы получить ровно столько РНК, чтобы тест мог ее обнаружить. Затем исследователи добавляют два компонента редактора генома CRISPR: белок под названием CAS12, который разрезает ДНК или РНК, и «направляющую» РНК, которая вставляется в CAS12 и помогает ему найти последовательность, соответствующую части генома коронавируса.Если CAS12 и его руководство находят совпадение в РНК, CAS12 связывается с этой согласованной РНК, которая активирует CAS12, чтобы разрезать ее и продолжить разрезать любые другие короткие цепи РНК или ДНК поблизости, включая копии цепи, предназначенные для высвобождения цвета. — изменение молекул, когда CAS12 отсекает их. Результатом может быть простое изменение цвета тест-полоски.

Этот метод отлично подходит для поиска небольших фрагментов генетического материала, говорит Дженнифер Дудна, биохимик из Калифорнийского университета (UC), пионер CRISPR, председатель научного консультативного совета Mammoth Biosciences.

В препринте, опубликованном 10 марта на medRxiv, исследователи из Mammoth Biosciences и Калифорнийского университета в Сан-Франциско сообщают, что тесты на клинических образцах дали результаты с точностью, сравнимой с ПЦР, всего за 30 минут. Он использует простую бумажную полоску с цветной линией, которая появляется с положительным результатом. По словам Тревора Мартина, генерального директора Mammoth, компания обсуждает с партнерами производство наборов для тестирования, которые позволят быстро и дешево диагностировать инфекцию SARS-CoV-2 в домашних условиях, не требуя медицинских знаний.

На завершение теста и получение одобрения регулирующих органов могут уйти месяцы, поэтому, скорее всего, он не будет готов в ближайшие решающие недели. Но он может быть готов, если распространение коронавируса продолжится. Некоторые предсказывают, что вирус тоже исчезнет, ​​но осенью снова появятся инфекции. Мартин говорит, что для получения результатов не потребуются машины для ПЦР, управляемые обученными специалистами. «Это изменит правила игры в нашей реакции» на возникающие болезни, — говорит Мартин.

Проблемы со снабжением

Несмотря на то, что компании и академические лаборатории расширяют свои усилия по диагностике на основе ПЦР, больницы и центры тестирования по всей стране сообщают, что они столкнулись с более серьезным кризисом: у многих заканчиваются химические вещества и другие материалы, которые позволяют проводить тесты, такие как тампоны для сбора образцов у пациентов и реагенты, необходимые для ПЦР.Бенджамин Пински, патолог Стэнфордского университета, который разработал диагностический тест на основе ПЦР, используемый в Северной Калифорнии, говорит, что его лаборатория сталкивается с постоянной нехваткой различных материалов, в первую очередь наборов, используемых для извлечения РНК из вирусных образцов, прежде чем ее можно будет загрузить в ПЦР-машины.

«Это был большой вызов», — говорит Пинский. «Мы должны были быть очень ловкими, чтобы справиться с этим», постоянно меняя поставщиков или даже химические процедуры, которые должны быть проверены, прежде чем их можно будет использовать на образцах пациентов.Его команда даже разослала в Твиттере просьбы к сообществу Стэнфорда и региональным биотехнологическим компаниям с просьбой пожертвовать наборы реагентов, такие как наборы от Zymo и Qiagen. По словам Пинского, несмотря на поступление пожертвований, запасов по-прежнему не хватает.

Реагентные компании пытаются ответить. Например, Qiagen, крупный поставщик наборов для экстракции РНК, объявил во вторник, что его сотрудники работают круглосуточно, чтобы увеличить производство с 1,5 миллиона наборов в месяц до 6.5 миллионов в месяц к концу апреля и далее увеличится.

Пинский, например, говорит, что он готов к тому, чтобы компании полностью взяли на себя тестирование на коронавирус у таких ученых, как он сам. «Я надеюсь, что эти компании смогут провести обещанное тестирование», — говорит Пинский. «Это еще предстоит выяснить.»

Повысьте эффективность тестирования с помощью рабочего процесса ПЦР в реальном времени Vela Diagnostics

Интегрированные и гибкие решения IVD для ПЦР

Vela Diagnostics предлагает тесты полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения и / или количественного определения широкого спектра бактерий, вирусов и генных мутаций.

Тесты полностью автоматизированы, что позволяет высвободить ценные ресурсы и сократить время, затрачиваемое операторами лаборатории. Стандартизация интерпретации результатов обеспечивает воспроизводимую и надежную диагностику, легко интегрируясь с лабораторными процедурами.

Гибкость платформы ПЦР позволяет проводить консолидированное тестирование с использованием более 30 проверенных тестов ПЦР и 21 клинически значимого и утвержденного типа образцов человека. По клиническим показаниям можно провести до 4 тестов на одном клиническом образце за один цикл ПЦР, что значительно экономит время и деньги по сравнению с отдельными тестами.Комбинации включают тесты на иммуносупрессию и гастроэнтерит.

Типы образцов Подтвержденные тесты ПЦР Тестовая комбинация

Вся кровь

CMV, EBV, HSV-1/2, VZV, BKV, HHV6

ДА

Плазма

HBV, HCV *, CMV, EBV, HSV-1/2, VZV, BKV, ZIKV

ДА

Сыворотка

HBV, HCV *, CMV, EBV, HSV-1/2, VZV, BKV, ZIKV

ДА

CSF

CMV, EBV, HSV-1/2, VZV, HHV6

ДА

Моча

БКВ, ЗИКВ

НЕТ

Табурет

Рота, К. diff, Норо

ДА

Общая РНК (кровь)

BCR-ABL м / м

ДА

Носоглоточный мазок

Грипп A / B и RSV, H7N9 (RUO)

ДА

Назальный мазок

MRSA / SA, грипп A / B и RSV, H7N9 (RUO)

НЕТ

Мазок для половых органов и полости рта

HSV-1/2

НЕТ

Мокрота

MTC

НЕТ

FFPE

НРАС, БРАФ, КРАС

НЕТ

Ректальный и перианальный мазок

фургонA / фургонB

НЕТ

Мазок из горла и раны

Strep A, VZV (поражение)

НЕТ

* Продукты в разработке

Чип для быстрой ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний

Исследователи из Имперского колледжа Лондона разработали крошечную лабораторию на чипе, которая может выполнять диагностику ПЦР всего за несколько минут. Обычно требует громоздкого и дорогого лабораторного оборудования, ПЦР является золотым стандартом диагностики различных инфекционных патогенов, включая бактерии и вирусы, такие как SARS-CoV-2. Новое испытательное устройство имеет диаметр 1 см и может помочь расширить диагностику в отдаленные или бедные регионы.

Медленное диагностическое тестирование вызывает множество проблем для пациентов с инфекционными заболеваниями, включая задержки в соответствующем лечении, более длительное пребывание в больнице и время восстановления. Во время продолжающейся пандемии COVID-19 экспресс-тесты помогут людям как можно скорее определить, инфицированы ли они, и могут позволить возобновить повседневную деятельность во многих обстоятельствах.Для регионов с ограниченными ресурсами или отдаленных регионов потребность в технологиях быстрого и мобильного тестирования еще более остра, поскольку на удобном расстоянии может не оказаться больничной лаборатории.

«Вместо того, чтобы отправлять мазки в лабораторию или в клинику, лаборатория может прийти к вам на чипе размером с ноготь», — сказал Фират Гудер, исследователь, участвовавший в исследовании, в пресс-релизе. «Вы могли бы использовать этот тест так же, как люди с диабетом, использующие тесты на сахар в крови, предоставляя образец и ожидая результатов — за исключением того, что на этот раз он предназначен для инфекционных заболеваний.”

Исследователи изготовили устройство из кремния. Обычно для такой миниатюрной кремниевой технологии требуются производственные условия в чистом помещении, такие как те, которые используются для создания компьютерных микросхем, что затрудняет и делает производство дорогостоящим. Однако это новейшее устройство было разработано таким образом, чтобы его можно было создавать в стандартных лабораторных условиях, что помогает снизить затраты и повысить доступность технологии.

Чип содержит датчики температуры, нагреватель и датчик ДНК.На данный момент исследователи проверили способность устройства обнаруживать бактериальную инфекцию, которая обычно встречается у животных, и генетический материал, встречающийся в вирусе SARS-CoV-2, что позволяет предположить, что эта технология имеет потенциал для оказания медицинской помощи COVID-19. контрольная работа.

Смотрите видео о технологии ниже:

Исследование в Nature Communications : Одноразовый универсальный микро-КПЦР на основе силикона для быстрого обнаружения патогенов на месте

Через: Имперский колледж Лондона

Молекулярных тестов и тестов на антитела для поддержки скрининга, диагностики и мониторинга COVID-19

7 апреля 2020

Кайл Грин 1 , Сара Грациадио 2 , Филип Тернер 3,4 , Томас Фэншоу 3,4 , Джой Аллен 1

От имени Оксфордской группы доказательной службы COVID-19
Центр доказательной медицины, Наффилд Департамент первичной медико-санитарной помощи
Оксфордский университет

1 Кооператив NIHR Ньюкасла по диагностике in vitro
Университет Ньюкасла, Ньюкасл-апон-Тайн, NE2 4HH
2 Кооператив NIHR Ньюкасла по диагностике in vitro
Ньюкасл-апон-Тайн NHS Hospitals Foundation Trust, Ньюкасл-апон-Тайн, штат NE2 3 NIHR Community Healthcare MedTech and In vitro Diagnostics Coperative, Oxford Health NHS Foundation Trust
4 Департамент первичной медико-санитарной помощи Наффилда, Оксфордский университет, OX2 6GG

Соответствие радости. [email protected]

POCT молекул и антител для поддержки скрининга, диагностики и мониторинга COVID-19 PDF
POCT COVID-19 Таблицы PDF


ВЕРДИКТ
Перенос диагностического тестирования на COVID-19 из лабораторных условий в пункт оказания медицинской помощи потенциально может изменить скорость и количество тестов, которые могут быть выполнены. Описаны одиннадцать диагностических тестов, которые потенциально подходят для тестирования на COVID-19 в месте оказания медицинской помощи: шесть молекулярных тестов и пять тестов на основе антител.Некоторые устройства демонстрируют высокую диагностическую точность во время контролируемого тестирования, но в настоящее время отсутствуют данные о производительности в клинических условиях и четкое понимание оптимальной популяции и роли этих тестов в процессе оказания медицинской помощи.

ИСТОРИЯ ВОПРОСА
Необходимость повышения уровня тестирования на COVID-19 была определена как Всемирной организацией здравоохранения, так и правительством Великобритании.

В настоящее время большинство тестов на COVID-19 проводится в лабораторных условиях.Руководство по тестированию на вирусы в лабораториях NHS доступно здесь, а ВОЗ также предоставляет техническое руководство по лабораторным тестам. Ранее сообщалось о сравнении мазков из ротоглотки и носоглотки для лабораторной диагностики.

Точные и масштабируемые тесты в местах оказания медицинской помощи (POC) для диагностики COVID-19 увеличат объем диагностики, которую необходимо ставить в обществе и за пределами лабораторных условий (Wang et al (1), Nguyen et al (2 )). Они могли бы сократить время до получения действенного результата, могли бы способствовать раннему выявлению людей с COVID-19, а также могли бы поддержать надлежащее использование ресурсов изоляции, мер инфекционного контроля и вовлечение в клинические испытания методов лечения.

В этом отчете мы суммируем характеристики текущих молекулярных диагностических тестов и тестов на антитела, доступных для поддержки диагностики и лечения пациентов с подозрением на COVID-19. Мы рассматриваем анализы, которые могут выполняться на анализаторах рядом с пациентом, а не на тех, которые обычно размещаются в лаборатории. Многие из этих тестов POC представляют собой тесты типа ПЦР на молекулярной основе, но другие представляют собой серологические тесты, которые обнаруживают присутствие антител в образце крови.

Контрольный тест

Текущий эталонный тест для диагностики активной инфекции SARS-CoV-2 представляет собой анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (rRT-PCR) в реальном времени (Corman et al (3)).В анализе rRT-PCR используется вирусная РНК, выделенная из образцов пациентов (например, материал, собранный с помощью мазка NP / OP), синтезируется комплементарная ДНК (кДНК) под действием фермента обратной транскриптазы и амплифицируется целевые последовательности вирусного генома из матрицы кДНК. . rRT-PCR можно интерпретировать полуколичественным образом, со скоростью целевой амплификации, зависящей от концентрации и качества вирусной РНК в исходном образце, и, таким образом, скорость амплификации может использоваться в качестве заместителя для вирусной нагрузки образца.

Невозможность амплификации может быть интерпретирована как отрицательный результат, но также может быть отнесена на счет низкого качества клинического образца или раннего статуса заболевания. Эти анализы можно проводить на стандартных термоциклерах rRT-PCR или на больших автоматизированных или полуавтоматических диагностических платформах. Тестирование у пациентов с подозрением на COVID-19 включает отправку респираторного образца (например, мазка из полости рта / носоглотки, мокроты или бронхоальвеолярного лаважа у серьезно нездоровых пациентов) в референс-лабораторию для тестирования rRT-PCR.Время между сбором образца и получением результатов может составлять от 24 до 72 часов, но могло бы быть намного быстрее при оптимизированном подходе от образца к ответу для срочных клинических сценариев.

Молекулярные тесты в месте оказания медицинской помощи используют ту же базовую методологию, что и лабораторный анализ, но по существу автоматизируют различное количество необходимых шагов. Поскольку они могут работать в условиях близости к пациенту, а не на лабораторном столе, можно ожидать, что они обеспечат более короткое время получения результата.

Серологические и антигенные тесты

Серологические тесты с использованием иммуноферментного анализа выявляют наличие антител к коронавирусу в цельной крови, плазме или образце сыворотки (Xiao et al (4)). Эти тесты выявляют иммуноглобулины M и G (IgM и IgG). IgM — это самый крупный иммуноглобулин, который появляется первым после первоначального воздействия антигена. IgG — это наиболее часто встречающиеся в организме антитела, которые появятся позже, но будут вырабатываться в большом количестве.Эти тесты могут определить, был ли пациент ранее инфицирован коронавирусом, поскольку они останутся положительными после исчезновения активной инфекции.

В настоящее время серологическое тестирование обычно не предлагается как часть скрининга или диагностики COVID-19, поскольку не существует проверенных тестов. Эти тесты не будут положительными до тех пор, пока организм не начнет вырабатывать антитела для борьбы с вирусом, обычно через 5-10 дней после заражения. Широкое использование такого теста может выявить, какой процент населения был заражен вирусом, но эти тесты с меньшей вероятностью выявляют случаи на ранних стадиях заболевания.В случаях, когда молекулярный тест отрицательный, но есть сильное клиническое подозрение на заболевание COVID-19, серологическое тестирование может подтвердить диагноз, как только станут доступны валидированные тесты.

Тесты на антиген

(Хан и др. (5)) также могут предлагать дополнительную информацию до или во время взятия образца для молекулярного скрининга, но на момент написания нет коммерчески доступных тестов на антиген COVID-19.

Для более подробного обзора соответствующих лабораторных методов см. Loeffelholz & Tang (6).

ТЕКУЩИЕ ДОКАЗАТЕЛЬСТВА
Мы открыли веб-сайты, перечисленные в стратегии поиска (ниже) 26. 03.2020, и извлекли список доступных тестов POC.

Мы записали следующую информацию, как записано на веб-сайтах производителей и во вкладышах к упаковкам анализов. Мы также попытались получить информацию о диагностических характеристиках, связавшись напрямую с производителями, но, поскольку было получено немного больше, мы сообщаем здесь только общедоступную информацию.

  • Тип устройства
  • Target (e.грамм. SARS-CoV-2 или иммуноглобины)
  • Тип образца, необходимый для испытания
  • Имеет ли маркировку CE и / или одобрение FDA для чрезвычайных ситуаций
  • Время, необходимое для пробоподготовки и получения результата диагностики
  • Пропускная способность (например, количество картриджей, которые можно обработать одновременно)
  • Требования к хранению
  • Диагностические характеристики (например, чувствительность и специфичность, независимо от того, используются ли лабораторные или клинические образцы)

Мы нашли шесть коммерчески доступных молекулярных тестов POC, пять тестов на основе антител и ни одного теста на антигены на момент проведения поиска. Сравнительная сводка представлена ​​в таблицах 1 и 2.

Молекулярная диагностика POC

Большинство из шести молекулярных тестов POC получили маркировку CE или одобрение FDA. Поскольку на момент написания мы не смогли найти клинические оценки этих анализов в литературе, информация, обобщенная ниже, взята из вкладышей производителя или с их веб-сайтов.

Почти все портативные анализаторы настольного размера, за исключением теста MicrosensDx RapiPrep © COVID-19 и теста MesaBioTech Accula, которые представляют собой небольшие портативные устройства.

Типичные утвержденные типы образцов включают мазки из носа, горла, полости рта или носоглотки. MicrosensDx также поддерживает образцы мокроты.

Все тесты требуют подготовки образца, которая включает помещение образца тампона в среду для переноса вирусов и пипетирование части образца в одноразовый картридж. Этот этап подготовки обычно занимает около двух минут, но для некоторых устройств может занять 5–10 минут. Набор Abbot ID Now указывает время подготовки 1-2 минуты, так как тампон смешивается со средой для переноса вирусов в картридже анализатора.

Большинство устройств POC являются одноразовыми и работают с одноразовыми картриджами. Cepheid Xpert SARS-CoV-2 может обрабатывать 2–4 образца за цикл с произвольным доступом, а GenMark EPlex может запускать 3 образца за цикл с произвольным доступом.

Для хранения большинства картриджей требуется охлаждение плюс некоторое время для уравновешивания до комнатной температуры, за исключением тестов Cepheid Xpert SARS-CoV-2, Mesa BioTech Accula SARS-CoV-2 и Abbott ID NOW COVID-19, которые можно хранить в помещении. температура перед использованием.

Время получения результата варьируется от 13 минут (Abbott ID NOW) до 45 минут (Cephied Xpert Xpress).

Для этих шести устройств не было доказательств клинической диагностической точности при проспективных клинических исследованиях. Предварительные данные, извлеченные из вкладышей картриджей, показали, что данные валидации ограничиваются небольшим количеством образцов с добавками в лабораторных условиях (обычно 20-50 положительных образцов). Большинство сравнивали положительное согласие по диапазону пределов обнаружения и, где это возможно, сообщали об отличных диагностических характеристиках в этой контролируемой обстановке.Информация о валидации для каждого устройства представлена ​​в Таблице 1, а более краткая сводка представлена ​​в Таблице 3 для целей сравнения.

Диагностика антител POC

Из пяти тестов на основе антител два представляют собой иммуноанализы с латеральным потоком (экспресс-тест BioMedomics и кассета для экспресс-тестов Surescreen), один — иммуноферментный анализ с временным разрешением (набор для диагностики Goldsite) и два — иммуноанализы коллоидного золота (набор Assay Genie rapid POC и тест VivaDiag COVID-19 IgG-IgM).

Все анализы обнаруживают присутствие IgG и IgM в цельной крови, сыворотке или плазме. Они включают пипетирование нескольких капель крови из укола пальца или вены на иммуноанализ, а затем нескольких капель буферного раствора с отображением результата (в виде линий, похожих на тест на беременность) в течение 10-15 минут. Во всех используются одноразовые картриджи, и большинство из них можно хранить при комнатной температуре.

Эталонным стандартом, использованным для сравнения в этих исследованиях, было тестирование ОТ-ПЦР.Некоторые данные о диагностической точности были собраны в результате клинических, а не лабораторных испытаний, крупнейшим из таких исследований была оценка экспресс-теста BioMedomics IgM-IgG (Li et al (2020) (7)), который оценивает чувствительность 89% и специфичность 91%. среди 525 выборок пациентов (таблица 3). Основываясь на опубликованных клинических данных, эта оценка представляет собой более убедительные доказательства, чем другие оценки, представленные в таблице 3. Мы также нашли зарегистрированный протокол клинических испытаний для VivaDiag и ожидаем, что по мере развития пандемии COVID-19 будут доступны дополнительные данные о клинической точности.

ВЫВОДЫ
В стадии разработки находится все большее количество диагностических устройств, которые потенциально подходят для диагностики COVID-19 в местах оказания медицинской помощи. Различные устройства могут быть более подходящими для диагностики новых случаев инфекции, в то время как другие, особенно те, которые проверяют наличие антител, лучше подходят для определения того, был ли человек ранее инфицирован. Этот последний сценарий, вероятно, будет иметь первостепенное значение при выявлении медицинских работников, которые, возможно, выздоровели от первоначальной инфекции, с тем чтобы убедиться в их пригодности для возвращения в передовые медицинские службы.Это также может помочь информировать о стратегиях общественного здравоохранения в конце периодов изоляции или по мере ослабления ограничений социального дистанцирования.

Важно отметить, что мы нашли относительно мало текущей информации о диагностических характеристиках этих устройств POC с использованием клинических образцов, взятых из местных сообществ. Соответствующие данные могут все еще собираться в рамках текущих исследований или не публиковаться публично. Как правило, можно ожидать, что диагностическая эффективность будет ниже в клинических условиях, чем при использовании образцов с добавками в контролируемой лабораторной среде.

Следует также отметить, что лабораторный эталонный стандарт rRt-PCR подвержен некоторым ошибкам классификации, и, в частности, могут возникать ложноотрицательные результаты. Это имеет отношение к проведению клинических оценок, поскольку неправильная классификация в эталонном стандарте может повлиять на кажущуюся диагностическую эффективность оцениваемых тестов POC. Другие факторы, которые могут повлиять на производительность, включают преаналитические факторы, такие как качество собранной респираторной пробы, момент времени во время заражения, когда проба собирается, а также обращение с пробой и ее хранение до анализа.

В случае широкомасштабного внедрения в сообществе любое снижение диагностической эффективности, вероятно, будет иметь серьезные последствия либо в виде ложного подтверждения инфицированным пациентам, либо из-за чрезмерной диагностики людей с отрицательным диагнозом болезни. Также мало данных о психологических и поведенческих последствиях знания иммунного статуса, независимо от того, правильно ли поставлен диагноз. Следовательно, для определения пригодности жизненно важно провести достаточные клинические испытания.

Заявление об ограничении ответственности : Статья не рецензировалась; он не должен заменять индивидуальное клиническое суждение, и следует проверять цитируемые источники.Хотя эта статья содержит информацию о характеристиках диагностических устройств, доступных в Интернете на дату поиска, эта информация может быть изменена и может быть заменена по мере появления новых данных, и не должна интерпретироваться как одобрение какого-либо конкретного устройства. Мнения, выраженные в этом комментарии, отражают точку зрения авторов, а не обязательно точку зрения принимающего учреждения, NHS, NIHR или Департамента здравоохранения и социального обеспечения. Взгляды не заменяют профессиональные медицинские консультации.

СТРАТЕГИЯ ПОИСКА
Мы зашли на следующие веб-сайты 26.03.2020 и извлекли список доступных тестов POC:

https://www. 360dx.com/coronavirus-test-tracker-launched-covid-19-tests
https://www.bioworld.com/COVID19diagnostics
https://www.finddx.org/covid-19 -backup /
https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-use-authorizations

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Wang C et al. Новая вспышка коронавируса, вызывающая озабоченность в области здравоохранения во всем мире.Ланцет 2020; 395 (10223): 470-3.
2. Nguyen T et al. Новое заболевание, вызванное коронавирусом 2019 г. (COVID-19): прокладывает путь к быстрому обнаружению и диагностике в местах оказания медицинской помощи. Микромашины 2020; 11 (3): 306
3. Corman VM et al. Обнаружение нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Euro Surveill 2020; 25 (3): 2000045.
4. Xiao SY et al. Изменяющийся статус новой коронавирусной инфекции 2019 г .: предложение традиционных серологических тестов для диагностики заболеваний и мониторинга инфекций. Журнал медицинской вирусологии 2020; 92 (5): 464-7.
5. Khan S et al. Анализ серологической перекрестной реактивности между обычными человеческими коронавирусами и SARS-CoV-2 с использованием микроматрицы антигенов коронавируса. bioRxiv 2020. https://doi.org/10.1101/2020.03.24.006544.
6. Лоффельхольц MJ и Танг YW. Лабораторная диагностика возникающих коронавирусных инфекций человека — современное состояние. Новые микробы и инфекции 2020; 9 (1): 747-5
7. Li Z et al. Разработка и клиническое применение экспресс-теста комбинированных антител IgM-IgG для диагностики инфекции SARS-CoV-2.Журнал медицинской вирусологии 2020. https://doi.org/10.1002/jmv.25727.

ПЦР-методов ведут к диагностике COVID-19

В декабре 2019 года в городе Ухань в Китае было зарегистрировано несколько случаев атипичной пневмонии. Лабораторные тесты подтвердили, что возбудителем болезни был новый коронавирус, предварительно названный 2019-nCoV, а теперь называемый SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 вызывает заболевание, официально обозначенное Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) как COVID-19. По состоянию на 27 февраля 2020 года ВОЗ зафиксировала 82 294 случая COVID-19 в 46 странах. Из них 78 630 были зарегистрированы в Китае и привели к смерти 2747 человек.

30 января 2020 года ВОЗ объявила вспышку COVID-19 чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение. Такое обозначение делает надежный лабораторный диагноз критически важным для усилий общественного здравоохранения. «Наша цель — раннее выявление новых случаев и предотвращение дальнейшего распространения коронавируса», — сказал директор Центров по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) Роберт Р.Редфилд, доктор медицины.

В условиях глобального распространения вируса, угрожающего пандемией COVID-19, раннее обнаружение может способствовать разработке вакцин и лекарств. Здесь мы обсуждаем, как диагностические тесты на COVID-19 быстро эволюционировали от ранних случаев до новейших инфекций.

Раннее обнаружение неизвестного вируса

В начале этого года исследователи собрали образцы бронхоальвеолярной жидкости у первых нескольких пациентов и проверили их на 22 вируса и бактерии с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ранее идентифицированные штаммы коронавируса и другие патогены, которые, как известно, вызывают респираторные симптомы, не были обнаружены в образцах. Это было первым признаком того, что возбудителем инфекции был новый, ранее не идентифицированный патоген.

Затем команда выделила вирусные частицы от тех же пациентов и исследовала их с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Вирус показал характерные шипы, характерные для коронавирусов. Они использовали ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) для амплификации консервативной области бета-коронавирусов, которая дала положительные результаты.Бетакоронавирусы ранее были причастны к вспышкам тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS).

Наконец, исследователи секвенировали вирусный геном. Они выполнили выравнивание последовательностей и филогенетический анализ генома нового вируса, используя геномы других бета-коронавирусов (SARS-CoV и MERS-CoV) в качестве эталона. Сходство консервативных доменов неизвестного вируса и других членов семейства бета-коронавирусов составило менее 90 процентов. Таким образом, исследователи пришли к выводу, что респираторные симптомы у пациентов были вызваны новым бета-коронавирусом.

Диагностические тесты на переднем крае

В течение нескольких недель после первых зарегистрированных случаев исследователи инфекционных заболеваний депонировали последовательности генома SARS-CoV-2 в открытые базы данных, такие как GenBank и GISAID. Это побудило международное сообщество ученых и медицинских работников разработать быструю и надежную молекулярную диагностику.

Исследователи из Берлинского института вирусологии разработали тесты для отличия инфекции SARS-CoV-2 от SARS-CoV на основе нуклеотидной последовательности гена РНК-зависимой РНК-полимеразы ( RdRp ).Они подтвердили перекрестную реактивность анализа с использованием 297 клинических образцов, полученных от пациентов, инфицированных известными респираторными патогенами. Отдельная группа из Гонконгского университета разработала одностадийный количественный анализ RT-PCR для обнаружения двух различных областей генома SARS-CoV-2 — открытой рамки считывания 1b ( ORF1b ) и области нуклеокапсида ( N ). Они подтвердили тест у двух пациентов с подозрением на COVID-19. Анализ N-гена был примерно в 10 раз более чувствительным, чем анализ ORF1b в этих клинических образцах.Анализы, разработанные обеими группами, были переданы в ВОЗ и разосланы для использования в нескольких странах.

В США CDC разработал качественный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени для обнаружения SARS-подобных коронавирусов и специфической идентификации SARS-CoV-2. Праймеры и зонды были сконструированы против области вирусного нуклеокапсида. Ранее образцы, полученные от людей с подозрением на COVID-19, нужно было отправлять в CDC для тестирования. Однако 4 февраля 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) выдало разрешение на экстренное использование диагностической панели ОТ-ПЦР CDC.Теперь тест можно отправить в лаборатории общественного здравоохранения штата и местные органы США, лаборатории Министерства обороны США и некоторые международные лаборатории. «Эта ситуация продолжает развиваться, и возможность распространять этот диагностический тест среди квалифицированных лабораторий является важным шагом вперед в защите общественного здоровья», — сказал комиссар FDA Стивен М. Хан, доктор медицины.

* ОБНОВЛЕНО 18 МАРТА 2020 ГОДА: на 17 марта 2020 года было зарегистрировано более 3500 случаев заболевания, поэтому в США активизировались усилия по диагностике COVID-19.Ранее в этом месяце FDA предоставило EUA для диагностической панели SARS-COV-2 RT-PCR, разработанной Центром Уодсворта при Департаменте общественного здравоохранения штата Нью-Йорк. Тест должен проводиться на респираторных образцах, взятых у людей, которые соответствуют рекомендациям CDC по тестированию.

12 марта тест Roche cobas SARS-CoV-2 стал первым коммерческим тестом, получившим одобрение FDA EUA. Тесты, предназначенные для одновременного запуска с другими анализами на системах cobas 6800/8800 компании, могут дать результаты в 3 раза.5 часов. Компания «Рош» начала отгрузку 400 000 тестов в больницы и лаборатории по всей территории США.

13 марта Thermo Fisher Scientific также получила сертификат EUA за свой тест на COVID-19 под названием TaqPath COVID-19 Combo Kit. Набор идентифицирует специфические последовательности в SARS-CoV-2 ORF1ab , кодирующей нуклеокапсид области и гене, кодирующем спайковый белок. Тест оптимизирован для использования на приборе Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real-Time PCR и дает результаты в течение 4 часов.Компания подготовила к отправке 1,4 миллиона тестов и планирует увеличить производство до 2 миллионов тестов в неделю.

Другие тесты, недавно одобренные в соответствии с EUA FDA, включают Quest Diagnostics SARS-CoV-2 Qualitative Real-Time RT-PCR, Quidel Corporation Lyra SARS-CoV-2 Assay, LabCorp’s COVID-19 RT-PCR Test и Hologic’s Panther Fusion SARS. -CoV-2. Эти тесты одобрены для использования в сертифицированных CLIA лабораториях, которые проводят тесты высокой сложности.

16 марта FDA объявило об изменении нормативных требований, которое позволяет штатам разрешать лабораториям разрабатывать собственные диагностические тесты на COVID-19.Лаборатории, уполномоченные государством, больше не должны будут добиваться EUA от FDA. Это обеспечит доступность тестов для удовлетворения растущих потребностей общественного здравоохранения.

Ограничения существующих диагностических тестов

Хотя ОТ-ПЦР является высокочувствительным тестом, он может иметь некоторые недостатки. Праймеры ОТ-ПЦР обычно разрабатывают против консервативных областей вирусного генома SARS-CoV-2. Коронавирусы имеют подверженные ошибкам РНК-зависимые РНК-полимеразы, что делает мутации и рекомбинации частыми.Мутации SARS-CoV-2 в настоящее время очень ограничены. Необходимо учитывать, как диагностическая специфичность и чувствительность анализов на основе ОТ-ПЦР может измениться при изменении частоты мутаций.

Низкая вирусная нагрузка у бессимптомных пациентов или пациентов с легкими симптомами не может быть надежно обнаружена с помощью ОТ-ПЦР. Хотя положительные результаты указывают на активную инфекцию SARS-CoV-2, они не исключают бактериальную инфекцию или коинфекцию другими вирусами. Как положительные, так и отрицательные результаты необходимо интерпретировать в сочетании с клиническими симптомами и эпидемиологическими данными.

Некоторые лаборатории общественного здравоохранения штата столкнулись с проблемами при валидации анализа ОТ-ПЦР CDC США. Они сообщили о положительных результатах отрицательных контролей анализа. Это дает неубедительный результат, который препятствует достоверной клинической диагностике. «… Один из реагентов не работал стабильно… следующий шаг — восстановление производства», — сказала Нэнси Мессонье, доктор медицинских наук, директор Национального центра иммунизации и респираторных заболеваний CDC.

В настоящее время диагностические тесты проводятся на респираторных жидкостях (носоглоточный аспират, бронхоальвеолярный лаваж и мокрота) и сыворотке.Однако одно исследование, в котором использовались праймеры для амплификации гена шипа (S) SARS-CoV-2, не могло надежно обнаружить вирус в жидкостях организма, не связанных с дыхательными путями, таких как кровь и моча. CDC работает над разработкой анализа крови, который определит антитела, вырабатываемые против SARS-CoV-2. Это поможет лучше понять передачу болезни и выявить инфекцию у людей с небольшими симптомами или без них.

Коммерческая диагностика в разработке по состоянию на 2 марта 2020 г.

FDA США создало шаблон проверки разрешения на использование в чрезвычайных ситуациях, который предоставляется по запросу разработчикам диагностических тестов. На сегодняшний день этот шаблон был предоставлен более чем 50 разработчикам, которые проявили интерес к разработке средств диагностики COVID-19.

В таблице ниже представлен обзор последних разработок, проводимых во всем мире.

Developer

Описание теста

Сямэнь Диагностика (Сямэнь, Китай) Набор для обнаружения SARS-CoV-2 на основе ПЦР получил одобрение китайской национальной медицинской компании Администрация (NMPA)
altona Diagnostics (Гамбург, Германия) Анализ на основе ОТ-ПЦР в реальном времени для качественного обнаружения РНК SARS-CoV-2 в респираторных образцах
Biomeme (Филадельфия, США) Portable Go-Strips запускается на мобильном портативном устройстве для количественной ПЦР.Go-Strips имеет РНК-мишени SARS-CoV-2 (ORF1ab и S-ген), мультиплексированные с экстракцией РНК Biomeme и контролем ОТ-ПЦР. Предназначен только для исследовательского использования
Bioneer (Тэджон, Южная Корея) Набор диагностических тестов, представленный для оценки и внесения в список для экстренного использования (EUAL) в Корейские центры по контролю и профилактике заболеваний (KCDC)
CerTest (Сарагоса) , Испания) Выпущены два диагностических комплекта. Один амплифицирует фрагмент гена S. Второй идентифицирует ген ORF1ab и N на основе последовательностей, опубликованных Китайским центром по контролю и профилактике заболеваний
Совместная диагностика (Солт-Лейк-Сити, США) Тест Logix Smart на основе RT-PCR усиливает консервативную область в SARS -CoV-2 геном.Первая американская компания, получившая знак CE за диагностический тест на COVID-19.
Coyote Bioscience (Пекин, Китай и Сан-Хосе, США) Анализ количественной ПЦР без препарирования дает результаты в течение одного часа с использованием портативной станции для количественной ПЦР. Тест используется только для исследовательских целей в Китае, но передан в NMPA для получения разрешения на экстренную помощь
GeneFirst (Оксфорд, Великобритания) Разработка двух наборов тестов; трехчасовой тест на основе ПЦР на SARS-CoV-2 и мультиплексный анализ ПЦР на SARS-CoV-2 и 17 других распространенных вирусов и бактерий
Genekam Biotechnology (Дуйсбург, Германия) Одноплексный и мультиплексный тест наборы для обнаружения SARS-CoV-2 и отличия его от других инфекций, таких как грипп, MERS и вирусы, обычно встречающиеся у летучих мышей
Genomica (Мадрид, Испания) Диагностический набор для одновременного анализа 96 образцов в течение одного часа.Получение ускоренного разрешения от Испанского агентства по лекарствам и медицинским устройствам
GenScript (Пискатауэй, США) Одноэтапный анализ обнаружения qRT-PCR, нацеленный на RdRp, ген N и ген E первого SARS-CoV- Идентифицировано 2 последовательности. Предназначен только для исследовательского использования.
IDbyDNA (Солт-Лейк-Сити, США) Тестовая платформа Explify Respiratory использует метагеномную технологию нового поколения на основе секвенирования для обнаружения SARS-CoV-2 и 900 других патогенов.Может отличить SARS-CoV-2 от других коронавирусов на основе in silico проверки
Kogen Biotech (Сеул, Южная Корея) PowerChek2019 Набор для ПЦР в реальном времени предоставлен EUAL в Корее
LexaGene (Беверли, США) Открытая, полностью автоматизированная платформа LX Analyzer успешно обнаружила РНК SARS-CoV-2 с помощью теста CDC в США
Novacyt (Париж, Франция и Камберли, Великобритания) Открыто молекулярное подразделение компании Primerdesign тест qRT-PCR, который обнаруживает SARS-CoV-2 в течение двух часов.Недавно получил маркировку СЕ. Требуется разрешение на использование в экстренных случаях в FDA США.
PCL (Сеул, Южная Корея) В процессе коммерциализации набора для мультиплексной диагностики
Qiagen (Хильден, Германия) QIAstat-Dx Respiratory 2019-nCoV Panel обнаруживает SARS-CoV-2, ORF1b и E, и отличает его от 21 другого возбудителя респираторного синдрома. Платформа QIAstat-Dx имеет маркировку CE, но тестовая панель запрашивает разрешение на использование в экстренных случаях в США, Корее и Китае
Roche (Базель, Швейцария) Набор LightMix RT-PCR Tib MolBiol обнаруживает RdRp, ген E и N ген SARS-CoV-2.Тест совместим с инструментами Roche серии Light Cycler 480 и Magna Pure24. Для исследований используйте только
Seegene (Сеул, Южная Корея) Набор для анализа AllPlex одновременно обнаруживает три гена-мишени SARS-CoV-2 — RdRp, ген E и ген N. Программное обеспечение для автоматического анализа предоставляет результаты теста в течение четырех часов. Получил маркировку CE в Европе и разрешение на использование в экстренных случаях в Корее.
ThermoFisher Scientific (Уолтем, США) Тест RT-PCR, выполняемый с помощью технологии TaqMan Assay от Applied Biosystems, идентифицирует последовательности, обнаруженные в начальных 44 геномах SARS-CoV-2.Только для исследований.

PCR расшифровывается как «Полимеразная цепная реакция». ПЦР — это давно используемый метод молекулярного диагностического тестирования, используемый для идентификации или нацеливания на генетическую последовательность ДНК или РНК (например, бактерий, вирусов) в образце.

Обычно «цепная реакция» относится к 40-кратному усилению или фотокопированию количества ДНК в образце, процесс, который обычно занимает 40-85 минут.40)). Это то, что делает ПЦР такой удивительно чувствительной. Кроме того, если при разработке теста, специфичного для патогена, уделяется должное внимание, то этот тест редко — если вообще когда-либо — дает ложноположительный результат. Это называется специфичностью.

Поскольку чувствительность и специфичность ПЦР настолько высоки, ПЦР широко считается «золотым стандартом». С точки зрения непрофессионала, это очень точно.

SARS-CoV-2 (возбудитель, вызывающий COVID-19) является возбудителем РНК. Чтобы успешно обнаружить этот патоген с помощью ПЦР, сначала необходимо преобразовать РНК в ДНК, и это делается путем обратной транскрипции РНК в ДНК.Когда ученые комбинируют обратную транскрипцию (ОТ) и ПЦР для амплификации мишеней РНК, это сокращенно называют ОТ-ПЦР. Шаг RT занимает 5-15 минут. Благодаря своей точности ОТ-ПЦР является основным методом, используемым справочными лабораториями для выявления присутствия SARS-CoV-2 (COVID-19) и многих других патогенов.

Несмотря на надежность ПЦР, существует множество конкурирующих химикатов, которые можно использовать для обнаружения патогенов. Два примера — изотермическая амплификация и тесты на основе антигенов. Эти химические процессы, как правило, выполняются быстрее и требуют меньше технических средств.Однако считается, что эти технологии уступают по чувствительности ОТ-ПЦР. Из-за этого они не являются выбором большинства референс-лабораторий, поскольку большинство референс-лабораторий предпочли бы потратить немного больше времени и получить правильный ответ, чем спешить с низкокачественной технологией и подвергнуться более высокому риску ошибочного диагноза.

ПЦР-тесты занимают около часа и дают очень точные результаты. Существуют и другие химические методы (изотермическая амплификация и тесты на антиген), которые могут предложить более быстрые результаты тестов, но они упускают из виду процент случаев, которые могут быть обнаружены с помощью ПЦР.

ПЦР традиционно проводится в справочной лаборатории, которая обычно возвращает результаты в течение 24 часов после получения образца. Доставка образцов в референс-лаборатории может значительно увеличить задержку в получении результатов. LexaGene помогает решить проблему «времени», автоматизируя ПЦР в момент необходимости и возвращая результаты примерно через 1 час после начала обработки образца.

Подробнее о кПЦР читайте в блоге компании.

Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)?

Как работает ПЦР?

Для полимеразной цепной реакции требуются два типа реагентов, ДНК-полимераза и праймеры, а также процесс термоциклирования. Эти ингредиенты делают возможной цепную реакцию, которая экспоненциально копирует исходный образец ДНК.

ДНК-полимераза — это фермент, который синтезирует молекулы из дезоксирибонуклеотидов, строительных блоков ДНК, для создания двух идентичных сегментов ДНК из одного оригинала.

Taq-полимераза — это специфический фермент, обычно используемый в ПЦР, поскольку он может выдерживать экстремальные температурные изменения при термоциклировании, избавляя от необходимости добавлять новую нестабильную термостабильную ДНК-полимеразу после каждого цикла ПЦР.Его источником является бактерия Thermus aquaticus , которая была впервые выделена из геотермальных источников в Йеллоустонском национальном парке примерно во время открытия ПЦР.

Праймеры представляют собой короткие фрагменты одноцепочечной ДНК, пары которых должны быть специально сконструированы, чтобы заставить ДНК-полимеразу инициировать амплификацию целевого сегмента ДНК.

Термический цикл относится к повторяющимся циклам нагревания и охлаждения, которые облегчают температурно-зависимые реакции амплификации ДНК.Термоциклер — это лабораторный прибор, который выполняет химические реакции в зависимости от температуры, включая ПЦР.

Один цикл ПЦР удваивает количество ДНК, с которой он начинался. Каждый цикл состоит из трех этапов: денатурации, отжига и растяжения.

  1. Денатурация

На первом этапе цикла ПЦР исходный образец нагревается почти до кипения. Высокая температура вызывает плавление или денатурацию ДНК — процесс физического разрушения водородных связей между двумя дополнительными цепями двойной спирали ДНК.Результатом являются две одинарные цепи ДНК, которые позже будут синтезированы в две полные двойные спирали ДНК.

  1. Отжиг

После денатурации температура образца снижается. Это позволяет праймерам связываться с их комплементарными последовательностями на каждой из разделенных цепей ДНК. Праймеры создают основу для полимеразы Taq, чтобы начать образование ДНК на последнем этапе.

  1. добавочный номер

На заключительном этапе образец повторно нагревается до температуры, при которой Taq-полимераза наиболее активна — около 72 ° C (162 ° F), — чтобы фермент мог закрепиться на основе, созданной праймерами во время стадии отжига.Полимераза Taq собирает два полных сегмента ДНК из исходного.

Новый цикл ПЦР готов к началу с удвоением количества ДНК по сравнению с предыдущим циклом. Циклы продолжаются до тех пор, пока не будет достигнуто необходимое количество ДНК.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.