Какую температуру сбивают: Что делать при ОРВИ с повышенной температурой?

Прогноз гроз после рекордной жары

Так что же такое гондола для мороженого?

City Park Gelato & aMore представил на лето целый парк велосипедных тележек или гондол для мороженого.

Эрин Уделл, Форт-Коллинз, Колорадо

После рекордной волны тепла, обрушившейся на Форт-Коллинз, на горизонте ожидаются грозы и более низкие температуры, чтобы немного облегчить ситуацию.

В четверг в Форт-Коллинзе третий день подряд наблюдается рекордно высокая температура. По данным Климатического центра Колорадо, температура достигла 98 градусов во вторник, 100 градусов в среду и 99 градусов в четверг.

По словам государственного климатолога и директора Колорадского климатического центра Русса Шумахера, высокая температура в четверг побила предыдущий рекорд 17 июня в 97 градусов в 2007 году.

Высокая температура во вторник побила предыдущий рекорд Форт-Коллинза 15 июня в 94 градуса, который до этой недели был трехсторонним между 1946, 1952 и 1977 годами. Максимум среды побил предыдущий дневной температурный рекорд в 95 градусов, который был зафиксирован 16 июня 1940 года.

По данным Национальной метеорологической службы, в пятницу днем ​​температура достигла 94 градусов, что далеко от рекордного на тот момент максимума в 100 градусов.

УДАР: 5 способов остыть в Форт-Коллинзе

По прогнозам, в ближайшие несколько дней над Северным Колорадо пройдут грозы.

По состоянию на полдень пятницы Национальная метеорологическая служба прогнозирует 30% -ную вероятность гроз и максимум 92 градусов в субботу и 20% -ную вероятность штормов и максимум 89 градусов в воскресенье.

Грозы будут более вероятными с вечера воскресенья по понедельник, с 40% вероятностью дождя и высокой температурой в 73 градуса в понедельник.

Рекордная жара на этой неделе сопровождалась несколькими, в основном не связанными с этим, отключениями электроэнергии, от которых до утра четверга пострадали тысячи жителей района Тимнат.

Отключения по выходным в Тимнате были вызваны неисправностью электросети и обрушенной линией электропередачи, говорится в городском выпуске новостей. В автокатастрофе на Малберри-стрит сломалась опора электропередачи, что привело к отключению электричества во вторник.

Сильный ураган обрушил несколько опор в среду, что привело к отключению тысяч клиентов Xcel в округе Лаример, Тимнате и Виндзоре примерно с 14:30. Со среды до 10:30 четверга.

Высокие температуры и высокий спрос вызвали отключение трансформатора на главной подстанции на несколько часов в четверг.

Колорадский репортер Эрин Уделл и исполнительный редактор Колорадо Эрик Ларсен внесли свой вклад в этот отчет.

Сэди Суонсон занимается вопросами общественной безопасности, уголовного правосудия, правительства округа Лаример и многого другого в Северном Колорадо.Вы можете отправить ей свои идеи по адресу [email protected] или в Twitter по адресу @sadyswan. Поддержите ее работу и работу других журналистов из Колорадо, купив цифровую подписку сегодня.

Как измерить температуру вашего ребенка

Во время Пандемия COVID-19, родителям может потребоваться проверить своих детей на наличие симптомов, включая лихорадку, прежде чем они отправятся в больницу. школа, уход за детьми, или спортивные занятия. Ощупывание лба вашего ребенка происходит быстро, но не очень точно.Большинство современных цифровых термометров работают быстро и просты в использовании.

Какой термометр лучше всего подходит для моего ребенка?

Для определения температуры ребенка лучше всего использовать цифровой термометр. НЕ используйте ртутный термометр. Эти тонкие стеклянные устройства, наполненные серебристым металлом, могут сломаться и высвободиться. токсичные уровни паров ртути. Фактически, если у вас есть дома ртутный термометр, вам следует убери это.

Что такое нормальная температура и что считается лихорадкой?

«Нормальная» температура зависит от возраста, активности и времени суток ребенка. А лихорадка обычно имеет температуру 100,4 градуса по Фаренгейту (38 градусов по Цельсию) или выше. Это признак того, что организм борется с болезнью. Температура, возраст вашего ребенка и другие признаки болезни помогут вашему врачу порекомендовать лечение, которое лучше всего подходит для вашего ребенка.

Какие бывают типы цифровых термометров?

Существуют разные типы цифровых термометров, которые измеряют температуру в разных частях тела. Ректальная (в анусе) температура является наиболее точной.Следующими по точности являются температура лба. Температура полости рта и ушей является точной, если все сделано правильно. Температура подмышек является наименее точной, но вы можете использовать этот метод для проверки ребенка любого возраста.

Какой бы подход вы ни использовали, перед использованием следуйте инструкциям по очистке на упаковке.

Вот 3 типа цифровых термометров:

Цифровой многоцелевой термометр

• Измеряет температуру в нижней части тела ребенка (ректально), во рту (орально) или подмышечной впадине (подмышечные области).

• Пероральное использование не рекомендуется, пока ребенку не исполнится 4 года и старше.

• Считывает температуру тела, когда датчик, расположенный на кончике термометра, касается этой части тела.
  

• Важно обозначить термометр «оральный» или «ректальный», чтобы его нельзя было использовать в обоих местах.

Височная артерия

• Измеряет инфракрасные тепловые волны, исходящие от кровеносного сосуда, проходящего через лоб чуть ниже кожи.

• Подходит для любого возраста.
  

• Температура измеряется на боковой и передней части лба, в зависимости от того, бесконтактная это модель или модель «без прикосновения». Перед использованием ознакомьтесь с инструкциями, чтобы узнать, насколько близко ко лбу и другими советами.

• Бесконтактные модели могут помочь снизить риск передачи микробов.

• Прямой солнечный свет и низкие температуры после пребывания на улице могут повлиять на чтение.
  

Барабанная

• Измеряет температуру в ухе ребенка, считывая инфракрасные тепловые волны от барабанной перепонки.

• Для детей от 6 месяцев. Не надежен для младенцев, у которых слуховые проходы слишком узкие

• Чтобы быть точным, его необходимо правильно поместить в слуховой проход вашего ребенка (см. «Температура уха» ниже).

• Низкие температуры после пребывания на улице могут повлиять на показания.
  

Как пользоваться цифровым термометром

Чтобы получить правильные показания термометра, важно , чтобы всегда следовать инструкциям, прилагаемым к устройству .

Ректальная температура

Измерение ректальная температура дает наилучшие показания, особенно для младенцев в возрасте до 3 месяцев. Вот как измерить ректальную температуру:

• Нанесите небольшое количество смазки, например, вазелина, на конец термометра и на попку ребенка.

• Положите ребенка животом на колени или на твердую поверхность. Другой способ — на спине, подтянув ноги к груди.Включите термометр и вставьте его на 1/2 дюйма (для детей младше 6 месяцев) на 1 дюйм в задний проход. Быть нежным. Никакого сопротивления быть не должно. Если есть, остановись. Держите ребенка неподвижно. Оставьте термометр на месте, пока он не издаст звуковой сигнал. Затем снимите и проверьте цифровое считывание.

• Термометры следует дезинфицировать до и после использования дезинфицирующим мылом и водой или дезинфицирующим спиртовым тампоном.

• Пометьте ректальный термометр, чтобы его случайно не использовали во рту.

Температура полости рта

Когда вашему ребенку исполнится 4 года, вы можете измерять температуру ртом. Вот как измерить температуру полости рта :

• Если ваш ребенок пил горячий или холодный напиток, подождите 30 минут.

• Включите термометр и поместите кончик под язык ребенка с одной стороны по направлению к задней части рта. Попросите ребенка держать термометр губами и пальцами. Не используйте зубы, чтобы удерживать их на месте.

• Держите губы закрытыми над термометром, пока он не издаст звуковой сигнал. Проверьте цифровое чтение.

Температура лба

Термометры височной артерии (лба) подходят для детей любого возраста. Вот как взять температура лба :

• Следуйте инструкциям на упаковке, чтобы узнать, как и куда перемещать или наводить датчик на лоб для получения наиболее точных измерений.

• Датчик измеряет тепловые волны, исходящие от височной артерии.Этот кровеносный сосуд проходит через лоб чуть ниже кожи.

• Считайте температуру вашего ребенка на экране дисплея.

Температура в ухе

Барабанный (ушной) термометр можно использовать для детей в возрасте от 6 месяцев и старше, так как у маленьких детей узкие слуховые проходы. Вот как взять температура уха :

• Следуйте инструкциям на упаковке.

• Правильная температура зависит от того, оттянуть ухо назад.Оттяните ухо назад и вверх, если ребенку больше 1 года. Затем наведите кончик ушного зонда между противоположным глазом и ухом.

• Нахождение на улице в холодный день может привести к заниженным показаниям. Подождите 15 минут после того, как войдете в дом, чтобы измерить температуру.

Помните

Лихорадка — это всего лишь один из признаков болезни, но очень важный. Если у вас есть вопросы о лихорадке и ее измерении, обратитесь к педиатру вашего ребенка.

Дополнительная информация

* Рисунки цифрового термометра, созданные Anthony A lex LeTourneau.

Информация, содержащаяся на этом веб-сайте, не должна использоваться вместо медицинской помощи и рекомендаций вашего педиатра. Ваш педиатр может порекомендовать различные варианты лечения в зависимости от индивидуальных фактов и обстоятельств.

Малая интерферирующая РНК сбивает фактор теплового шока-1 (HSF-1) и усиливает провоспалительную активацию NF-κB и AP-1 в гладкомышечных клетках сосудов | Сердечно-сосудистые исследования

Абстрактные

Цели: Тепловой шок и повышенная экспрессия белков теплового шока подавляют активацию провоспалительного фактора транскрипции NF-κB.Мы предположили, что подавление экспрессии фактора теплового шока-1 (HSF-1) с помощью технологии РНКи усугубит вызванное ангиотензином (Ang) II воспалительное повреждение гладкомышечных клеток сосудов (VSMC).

Методы: Клетки аорты А10 крысы и клетки гладких мышц кишечника человека выращивали без трансфекции или с трансфекцией малой интерферирующей РНК HSF-1 (миРНК) или миРНК отрицательного контроля. Клетки стимулировали Ang II (100 нМ) для активации сигнального пути NF-κB.

Результаты: миРНК HSF-1 значительно подавляла экспрессию HSF-1 и одного из последующих белков теплового шока (Hsp), Hsp27, в обеих клеточных линиях. SiRNA HSF-1 также влияла на клетки, подвергшиеся воздействию теплового шока или обработки Ang II. Ang II индуцировал активацию NF-κB и AP-1 в нетрансфицированных VSMC, однако Ang II индуцировал значительно более высокую активность этих провоспалительных факторов транскрипции в клетках, трансфицированных HSF-1 siRNA. Контрольная миРНК не оказывала явного влияния на экспрессию HSF-1 и Hsp27 и на активацию NF-κB и AP-1, индуцированную Ang II.

Выводы: Эти данные показывают, что подавление HSF-1 усугубляет вызванное Ang II воспаление в VSMC, и предполагает, что белки теплового шока защищают от воспалительного повреждения путем подавления провоспалительных факторов транскрипции, таких как NF-κB и АП-1.

См. Редакцию А.А. Knowlton (страницы 7–8) в этом выпуске.

1 Введение

Белки теплового шока (Hsps) представляют собой семейство высококонсервативных молекулярных шаперонов, которые поддерживают растворимость белков, функцию цитоскелета и клеточный гомеостаз, а также защищают клетки от стресса окружающей среды и патофизиологических повреждений [1–3]. У крыс тепловой шок (42 ° C в течение 15 минут) вызывает значительно повышенные уровни Hsp70 в сердце, и это связано с улучшением функционального восстановления сердца после глобальной ишемии [4]. Трансгенные мыши, экспрессирующие высокие уровни индуцибельного Hsp70 человека, продемонстрировали прямую роль Hsp70 в защите миокарда и нейронов гиппокампа от ишемического повреждения [5,6]. Недавно было показано, что лечение тепловым шоком с индуцированными высокими уровнями Hsp70 и Hsp27 защищает от индуцированной ангиотензином (Ang) II гипертензии и воспаления в аорте и сердце [7,8].Однако вопрос о том, регулируют ли повышенные уровни Hsps или другие изменения в экспрессии генов напрямую пути воспалительного внутриклеточного повреждения, остается открытым.

Различные гены теплового шока регулируются факторами транскрипции теплового шока (HSF), которые экспрессируются конститутивно [9]. В настоящее время идентифицировано четыре различных HSF, то есть HSF-1, HSF-2, HSF-3 и HSF-4, каждый из которых имеет различные характеристики. HSF-1 регулирует транскрипцию генов Hsp после экологического или патофизиологического стресса, который денатурирует или осаждает клеточные белки.HSF-2 и HSF-3 регулируют транскрипцию генов Hsp в определенных тканях, претерпевая процессы дифференцировки и развития, а HSF-3 был описан только у кур [9,10]. HSF-4 структурно связан с тремя другими HSF, однако он функционально отличается и не реагирует на стрессы, такие как тепло [11]. Более того, транскрипция генов Hsp70, Hsp90 и Hsp27 снижается при сверхэкспрессии HSF-4 [11]. Было высказано предположение, что HSF-4 не является фактором транскрипции, потому что он лишен карбоксиконцевого повтора, общего для HSF-1, HSF-2 и HSF-3 [11].HSF-1 является основным стресс-чувствительным HSF, опосредующим реакцию теплового шока в клетках млекопитающих [12]. HSF-1 конститутивно локализован в цитозоле и ядре и поддерживается в инактивированной форме за счет связывания с конститутивным белком теплового шока 70 кДа (Hsc70) или Hsp90. При различных формах клеточного стресса, таких как тепло, гипоксия, этанол и арсенит натрия, которые денатурируют белки, конститутивные Hsps рекрутируются на денатурированные белки, высвобождая HSF-1. Свободный HSF-1 фосфорилируется и перемещается из цитозольного компартмента в ядерный и становится организованным в активные ДНК-связывающие гомотримеры [9].

В настоящем исследовании мы использовали технологию РНК-интерференции (РНКи) для подавления экспрессии гена HSF-1 в гладкомышечных клетках сосудов (VSMC). Мы предположили, что (1) нокдаун HSF-1 также нарушит экспрессию нижележащего гена Hsps, и (2) нокдаун HSF-1 усугубит вызванное Ang II воспалительное повреждение VSMC. Такие данные подтверждают мнение о том, что белки теплового шока играют непосредственную роль в подавлении индуцированных Ang II воспалительных сигнальных путей и последующего воспаления.

2 метода

2,1 Культура клеток

VSMC, полученная из аорты плода крысы (клетки A10), была получена из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Rockville, MD, Cat # CRL 1476). Клетки гладкой мускулатуры кишечника человека (клетки HISM) были также получены из АТСС (каталожный номер CRL 1692) и считаются клеточной линией VSMC [13]. Клетки культивировали рутинно в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), пенициллин (50 Ед / мл) и стрептомицин (50 мкг / мл) при 37 ° C в 5% увлажненной атмосфере. CO ₂ и 95% воздуха.

2.2 Производство и трансфекция РНКи

миРНК HSF-1 была химически синтезирована компанией Ambion (Остин, Техас). Метод Эльбашира и соавт. [14] использовали для определения следующей целевой последовательности: 5′-AAGAGAAAGATCCCTCTGATG-3 ‘. Целевая последовательность находится в открытой рамке считывания гена HSF-1 крысы (номер доступа: xm_343270), на 613 нуклеотидов ниже стартового кодона. Отрицательный контроль миРНК, дуплекс 21-нуклеотидной РНК без известной гомологии последовательностей, также был приобретен у Ambion (каталожный номер 4611).

Трансфекция миРНК в клетки была достигнута с использованием реагента олигофектамина (Invitrogen, Burlington, ON). Вкратце, 2 × 10 ⁴ клеток / лунку помещали в 24-луночные планшеты в течение ночи для достижения 50-70% конфлюэнтных монослоев. В день трансфекции культивированные клетки промывали DMEM без сыворотки или антибиотиков. Исходный олигонуклеотид и олигофектамин в 20 мкМ разбавляли и осторожно смешивали с DMEM для достижения конечной концентрации олигофектамина (рекомендация производителя, 2 мкл / лунка) и 1 × и 2 × для миРНК (1 × концентрация составляла 133 нМ).Затем в каждую лунку добавляли комплексы олигонуклеотид-олигофектамин и клетки инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. Затем к клеткам добавляли FBS для достижения конечной концентрации 10% в DMEM и инкубировали в течение 44 часов при 37 ° C в инкубаторе CO ₂ .

2.3 Анализ МТТ для определения жизнеспособности клеток

После трансфекции siRNA или фиктивной обработки культуральную среду заменяли на нормальную среду для выращивания с 450 мкл DMEM с 10% FBS. Тетразолиевая соль МТТ (Sigma, St.Louis, MI, Cat # M2128) 50 мкл, 5 мг / мл в PBS добавляли к клеткам до конечной концентрации 0,5 мг / мл и клетки инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов. МТТ превращали в кристаллы формазана жизнеспособными клетками. Кристаллы формазана растворяли в 500 мкл солюбилизирующего буфера (0,1 М HCl и 10% SDS), инкубируя клетки при 37 ° C в течение 1 часа. Поглощение считывали при 562 нм в считывающем устройстве для микропланшетов, FL _x 800 (Bio-Tek instrument Inc., Winooski, VT). Жизнеспособность клеток выражали в процентах от ложно обработанных клеток.

2,4 Ангиотензин II и лечение тепловым шоком

Через 48 часов трансфекции siRNA как трансфицированные, так и нетрансфицированные (фиктивные) клетки культивировали в течение 1 дня в бессывороточной среде DMEM для остановки роста перед обработкой Ang II или обработкой HS. Человеческий ангиотензин II (Sigma, № по каталогу A9525) добавляли в концентрации 100 нмоль / л. Для обработки тепловым шоком после остановки роста клетки инкубировали при 44 ° C в течение 20 минут в инкубаторе и восстанавливали при 37 ° C. Клетки собирали для исследования Hsp27, NF-κB и AP-1 в разные моменты времени после лечения ангиотензином II или HS.

2,5 Иммуноцитохимия

Для иммуноцитохимии клетки инкубировали с кроличьими поликлональными антителами против HSF-1 (1: 2000, StressGen, Виктория, Канада, № по каталогу SPA-901) или кроличьими поликлональными антителами против Hsp27 (1: 2000, StressGen, по каталогу SPA. -801). Первичные антитела к HSF-1 и Hsp27 реагировали с вторичным антителом, козьим антикроличьим, конъюгированным с alexa-546 (1: 500, Molecular Probes, Юджин, Орегон). Цифровые изображения были получены с помощью камеры Zeiss Axiovert 200 и AxioCam HRc и системы захвата изображений.

2,6 Приготовление белковых экстрактов

Белков из различных условий, описанных выше, собирали и объединяли из 6 лунок 24-луночных планшетов, и все процедуры экстракции белков выполняли на льду. Клетки промывали холодным 0,1 М PBS и лизировали 50 мкл ледяного буфера A [10 мМ HEPES (pH 7,9), 1,5 мМ MgCl ₂ , 10 мМ KCl, 1 мМ 1,4-дитиотреитол (DTT), 0,5. мМ PMSF, 10 мкг / мл лейпептина, 10 мкг / мл апротинина, 0,1% Triton X-100]. После 10-минутной инкубации на льду гомогенаты центрифугировали при 4000 g в течение 4 минут при 4 ° C.Супернатанты хранили как цитоплазматические экстракты при -70 ° C. Осадки ресуспендировали в 40 мкл буфера B [20 мМ HEPES (pH 7,9), 25% глицерин, 420 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl ₂ , 0,2 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 0,5 мМ PMSF, 10 мкг / мл лейпептина. , 10 мкг / мл апротинина]. Суспензию инкубировали 30 мин на льду. После центрифугирования при 20000 g в течение 15 минут при 4 ° C супернатанты аликвотами переносили в новые пробирки и хранили при -70 ° C до анализа. Концентрации белка определяли методом Lowry et al.[15].

2,7 Вестерн-анализ

образцов белка (10 мкг) использовали для вестерн-анализа по методу Chen et al. [7,8]. Блоты реагировали либо с антителом против HSF-1 (1: 5000), либо с антителом против Hsp27 (1: 5000), либо с крысиным моноклональным антителом против HSF-2 (1: 5000, StressGen, Cat # SPA-960), а затем инкубацией с соответствующим конъюгированным с пероксидазой вторичным антителом (1: 2000, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Уровень HSF-1, HSF-2 и Hsp27 определяли с помощью системы усиленной хемилюминесценции (Amersham Pharmacia) в соответствии с протоколом производителя, а затем подвергали воздействию пленок или детектировали с помощью системы Storm (Storm 840, Amersham Biosciences, Саннивейл, Калифорния). .Уровни белка определяли количественно сканирующей денситометрией с использованием систем анализа изображений (Scion Corp, Frederick, ML). Равные количества загрузки белка на дорожку проверяли окрашиванием амидным черным или вестерн-блоттингом с кроличьими поликлональными антиактиновыми антителами (1: 200, Sigma, № по каталогу A2066).

2,8 Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)

консенсусных олигонуклеотидных последовательностей NF-κB и AP-1 (5′-AGTGAGGGACTTTCCCAGGC-3 ‘и 5′-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3’, соответственно) (Promega, Madison, WI) были использованы для EMSA в соответствии с протоколом, ранее описанным Chen et al. .[7,8]. Вкратце, реакции связывания, каждая из которых содержала 10 мкг ядерных экстрактов, разделяли на неденатурирующем 4% акриламидном геле. Гели сушили на бумаге Whatman 3 MM и экспонировали на рентгеновской пленке при -70 ° C в течение ночи. Чтобы установить специфичность реакции, конкурентные анализы с 50-кратным избытком немеченых специфических олигонуклеотидов-конкурентов и неспецифического конкурентного олигонуклеотида, SP-1 (5′-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3 ‘) (Promega), проводили путем добавления немеченых зондов через 10 мин. перед добавлением меченого зонда.Отрицательные контроли не содержали ядерных экстрактов. Для тестов сверхсдвига 2 мкг анти-p65 (sc-109 X, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния), анти-p50 (sc-114 X, Santa Cruz Biotechnology) и анти-c-Fos (sc-52 , Santa Cruz Biotechnology), антитела добавляли к экстрактам ядерных белков и инкубировали в течение 1 ч после добавления меченого зонда. Активность связывания ДНК определяли количественно сканирующей денситометрией с использованием систем анализа изображений (Scion Corp).

2.9 Статистический анализ

Данные выражены как среднее ± SEM. Достоверность различий определяли с помощью дисперсионного анализа и теста множественного сравнения post hoc с использованием программного обеспечения SPSS 11.5 (SPSS, Чикаго, Иллинойс). P <0,05 считали статистически значимым.

3 Результаты

3.1 РНКи подавляет экспрессию HSF-1 и Hsp27 в нестрессированных клетках A10

Иммуноцитохимия для обнаружения экспрессии HSF-1 в VSMC A10 (рис. 1A-E) показала, что существует значительный эффект нокдауна HSF-1 siRNA.В нетрансфицированных (фиктивных) клетках A10 HSF-1 в основном локализовался в ядрах и диффузно распределялся в цитоплазме (рис. 1A). Чтобы исключить эффект самой трансфекции, клетки трансфицировали контрольной миРНК в 1-кратной и 2-кратной дозировке. Не было очевидного влияния контрольной трансфекции siRNA на экспрессию HSF-1 (фиг. 1B, C). При трансфекции siRNA HSF-1 экспрессия HSF-1 снижалась дозозависимым образом (рис. 1D, E). Эффективность трансфекции составляла ~ 90%. Обработка клеток трансфекцией миРНК подавляла жизнеспособность клеток примерно до 70% от жизнеспособности фиктивно обработанных клеток ( P <0.05) (Рис. 1F). Однако не было существенной разницы между контрольной миРНК и обработкой миРНК HSF-1 как при однократной, так и при двукратной дозировке.

Рис. 1

siRNA HSF-1 подавляет экспрессию HSF-1 и нижестоящего Hsp27 в клетках A10. (A) Ложно обработанные клетки имели в основном экспрессию HSF-1 в ядерной и диффузной цитоплазме. (B, C) Клетки, обработанные контрольной миРНК в 1 × и 2 × дозировках, соответственно, не имели видимых различий по сравнению с имитационно обработанными клетками.(D и E) Клетки, обработанные миРНК HSF-1 в 1х и 2х дозах соответственно. Экспрессия HSF-1 подавлялась дозозависимым образом. (F) Жизнеспособность клеток, определенная с помощью анализа МТТ, показала, что трансфекция миРНК подавляла жизнеспособность клеток, однако не было существенной разницы между обработками трансфекции. (G) Вестерн-анализ подтвердил эффект подавления РНКи HSF-1 на экспрессию HSF-1, а также показал, что миРНК HSF-1 (двукратная доза) подавляла экспрессию Hsp27.(H) Полуколичественная оценка западного анализа. Относительные уровни Hsp90, Hsp70 и Hsp27 были нормализованы до актина. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего и являются репрезентативными для 3 отдельных экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с фиктивным. Масштабная линейка в E = 100 мкм на панелях (A, B, C, D и E).

Рис. 1

миРНК HSF-1 подавляет экспрессию HSF-1 и нижестоящего Hsp27 в клетках A10. (A) Ложно обработанные клетки имели в основном экспрессию HSF-1 в ядерной и диффузной цитоплазме.(B, C) Клетки, обработанные контрольной миРНК в 1 × и 2 × дозировках, соответственно, не имели видимых различий по сравнению с имитационно обработанными клетками. (D и E) Клетки, обработанные миРНК HSF-1 в 1х и 2х дозах соответственно. Экспрессия HSF-1 подавлялась дозозависимым образом. (F) Жизнеспособность клеток, определенная с помощью анализа МТТ, показала, что трансфекция миРНК подавляла жизнеспособность клеток, однако не было существенной разницы между обработками трансфекции. (G) Вестерн-анализ подтвердил эффект подавления РНКи HSF-1 на экспрессию HSF-1, а также показал, что миРНК HSF-1 (двукратная доза) подавляла экспрессию Hsp27.(H) Полуколичественная оценка западного анализа. Относительные уровни Hsp90, Hsp70 и Hsp27 были нормализованы до актина. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего и являются репрезентативными для 3 отдельных экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с фиктивным. Масштабная линейка в E = 100 мкм на панелях (A, B, C, D и E).

Вестерн-анализ также подтвердил, что уровень HSF-1 снижался при обработке РНКи. Антитело против HSF-1 распознает один белок 85 кДа в цитоплазме и белки 85 кДа и 95 кДа в ядре, что соответствует молекулярным массам неактивной и активированной форм HSF-1, соответственно, на иммуноблотах SDS – PAGE ( Инжир. 1G). HSF-1 siRNA с 2-кратной дозировкой снижает уровни HSF-1 как в цитоплазме, так и в ядре, однако HSF-1 siRNA с 1-кратной дозой только снижает ядерный уровень HSF-1 (рис. 1G, H). Также исследовали влияние РНКи HSF-1 на один из последующих белков теплового шока HSF-1, Hsp27. HSF-1 siRNA подавляла экспрессию Hsp27 в клетках A10 при 2-кратной дозировке (рис. 1G, H). HSF-1 siRNA не влияла ни на HSF-2, ни на уровни актина (рис. 1G).

3.2 РНКи подавляет экспрессию HSF-1 и Hsp27 в нестрессированных клетках HISM

HSF-1 локализовался в основном в ядрах нестрессированных клеток HISM.Обработка ложной и контрольной siRNA не привела к видимой разнице в экспрессии HSF-1 (фиг. 2A, B). Обе дозы миРНК HSF-1 подавляли экспрессию HSF-1 в клетках HISM как в ядрах, так и в цитоплазме (рис. 2C, D). В нормальных клетках HISM Hsp27 локализован в основном в нуклеоплазме и слегка в цитоплазме (рис. 2E). Контрольная миРНК не оказывала явного влияния на экспрессию Hsp27 в клетках HISM (фиг. 2F). Интересно отметить, что обработка миРНК HSF-1 в дозе 1 × уменьшала ядерную экспрессию Hsp27 (рис.2G) и двукратная доза снижала как ядерную, так и цитоплазматическую экспрессию Hsp27 (фиг. 2H).

Рис. 2

siRNA HSF-1 подавляет экспрессию HSF-1 и Hsp27 в клетках HISM. (A) Ложно обработанные клетки показывают положительную экспрессию HSF-1 в ядерной цитоплазме. (B) Контрольные клетки, обработанные siRNA 1х, не показывают видимых различий по сравнению с клетками, обработанными имитацией. (C, D) Клетки, обработанные миРНК HSF-1 при дозировках 1 и 2, показывают, что цитоплазма и ядерная экспрессия HSF-1 снижены дозозависимым образом.(E) Ложно обработанные клетки показывают положительную экспрессию Hsp27 в ядерной цитоплазме. (F) Контрольные клетки, обработанные siRNA, 1 × не показывают видимых различий по сравнению с клетками, обработанными имитацией. (G, H) Клетки, обработанные миРНК HSF-1 в дозах 1 и 2, показывают, что экспрессия Hsp27 в ядре и цитоплазме снижена дозозависимым образом. Масштабная линейка на панелях (D и H) = 100 мкм в целом.

Рис. 2

миРНК HSF-1 подавляет экспрессию HSF-1 и Hsp27 в клетках HISM. (A) Ложно обработанные клетки показывают положительную экспрессию HSF-1 в ядерной цитоплазме.(B) Контрольные клетки, обработанные siRNA 1х, не показывают видимых различий по сравнению с клетками, обработанными имитацией. (C, D) Клетки, обработанные миРНК HSF-1 при дозировках 1 и 2, показывают, что цитоплазма и ядерная экспрессия HSF-1 снижены дозозависимым образом. (E) Ложно обработанные клетки показывают положительную экспрессию Hsp27 в ядерной цитоплазме. (F) Контрольные клетки, обработанные siRNA, 1 × не показывают видимых различий по сравнению с клетками, обработанными имитацией. (G, H) Клетки, обработанные миРНК HSF-1 в дозах 1 и 2, показывают, что экспрессия Hsp27 в ядре и цитоплазме снижена дозозависимым образом.Масштабная линейка на панелях (D и H) = 100 мкм в целом.

3.3 РНКи подавляет экспрессию Hsp27 в клетках A10, обработанных тепловым шоком или Ang II

Для исследования действия РНКи на клетки, подвергшиеся стрессу, VSMC A10, трансфицированные HSF-1 siRNA, обрабатывали тепловым шоком или Ang II. HSF-1 siRNA значительно подавляла экспрессию Hsp27 ( P <0,05) в клетках, не обработанных HS (0) и обработанных HS (фиг. 3A). В нетрансфицированных (фиктивных) клетках A10 обработка HS оказывала лишь минимальный эффект на экспрессию Hsp27, т.е.е. Hsp27 увеличивался только через 12 ч после обработки HS по сравнению с клетками, не обработанными HS (0). По сравнению с нетрансфицированными (фиктивными) клетками, трансфекция контрольной миРНК не оказывала явного влияния на экспрессию Hsp27.

Рис. 3

Вестерн-блоттинг-анализ Hsp27 в (А) тепловом шоке или (В) обработанных ангиотензином II клетках А10. (A) Клетки A10 не подвергали трансфекции (имитацию) или трансфицировали контрольной siRNA 1 × или HSF-1 siRNA 2 × в течение 2 дней с последующим 1 днем ​​бессывороточной инкубации перед обработкой HS.Клетки собирали для анализа без обработки HS (0) или через 6, 12, 24 или 48 часов после обработки HS. Обработка HS привела к умеренному увеличению экспрессии Hsp27 только через 12 ч после обработки HS. Трансфекция siRNA HSF-1 значительно подавляла экспрессию Hsp27 в необработанных HS (0) и обработанных HS клетках с восстановлением от 6 до 48 часов. По сравнению с фиктивным, трансфекция контрольной siRNA не оказывала заметного влияния на экспрессию Hsp27. (B) Клетки A10 не подвергали трансфекции (имитация) или трансфицировали контрольной миРНК 1х или HSF-1 миРНК 2х в течение 2 дней с последующим 1 днем ​​бессывороточной инкубации перед обработкой Ang II.Клетки собирали для анализа без обработки Ang II (0) или через 0,25, 1, 2, 6 или 24 часа обработки Ang II. В нетрансфицированных клетках (фиктивные) обработка Ang II увеличивала экспрессию Hsp27 через 1-6 часов. Трансфекция siRNA HSF-1 значительно подавляла экспрессию Hsp27 в Ang II, не обработанном (0), и обработанном клетками в течение от 0,25 до 24 часов. По сравнению с имитацией трансфекция контрольной siRNA не оказывала заметного влияния на экспрессию Hsp27. *, ** P <0,05 и 0,01 по сравнению с фиктивным без обработки HS или Ang II. #, ## P <0,05 и 0,01 HSF-1 siRNA, обработанная по сравнению с фиктивной или контрольной siRNA, обработанной в каждый момент времени. Экспрессию Hsp27 нормализовали до уровня актина, и эксперименты повторяли трижды.

Рис. 3

Вестерн-блот-анализ Hsp27 в (A) тепловом шоке или (B) обработанных ангиотензином II клетках A10. (A) Клетки A10 не подвергали трансфекции (имитацию) или трансфицировали контрольной siRNA 1 × или HSF-1 siRNA 2 × в течение 2 дней с последующим 1 днем ​​бессывороточной инкубации перед обработкой HS.Клетки собирали для анализа без обработки HS (0) или через 6, 12, 24 или 48 часов после обработки HS. Обработка HS привела к умеренному увеличению экспрессии Hsp27 только через 12 ч после обработки HS. Трансфекция siRNA HSF-1 значительно подавляла экспрессию Hsp27 в необработанных HS (0) и обработанных HS клетках с восстановлением от 6 до 48 часов. По сравнению с фиктивным, трансфекция контрольной siRNA не оказывала заметного влияния на экспрессию Hsp27. (B) Клетки A10 не подвергали трансфекции (имитация) или трансфицировали контрольной миРНК 1х или HSF-1 миРНК 2х в течение 2 дней с последующим 1 днем ​​бессывороточной инкубации перед обработкой Ang II.Клетки собирали для анализа без обработки Ang II (0) или через 0,25, 1, 2, 6 или 24 часа обработки Ang II. В нетрансфицированных клетках (фиктивные) обработка Ang II увеличивала экспрессию Hsp27 через 1-6 часов. Трансфекция siRNA HSF-1 значительно подавляла экспрессию Hsp27 в Ang II, не обработанном (0), и обработанном клетками в течение от 0,25 до 24 часов. По сравнению с имитацией трансфекция контрольной siRNA не оказывала заметного влияния на экспрессию Hsp27. *, ** P <0,05 и 0,01 по сравнению с фиктивным без обработки HS или Ang II.#, ## P <0,05 и 0,01 HSF-1 siRNA, обработанная по сравнению с фиктивной или контрольной siRNA, обработанной в каждый момент времени. Экспрессию Hsp27 нормализовали до уровня актина, и эксперименты повторяли трижды.

миРНК HSF-1 значительно подавляла экспрессию Hsp27 ( P <0,05) в клетках, не обработанных Ang II и Ang II (фиг. 3B). В нетрансфицированных (фиктивных) клетках A10 обработка Ang II в течение 1-6 ч значительно увеличивала экспрессию Hsp27. По сравнению с нетрансфицированными (фиктивными) клетками, трансфекция контрольной миРНК не оказывала явного влияния на экспрессию Hsp27.

3.4 Эффект подавления экспрессии HSF-1 на Ang II-индуцированную активацию NF-κB

В нетрансфицированных (фиктивных) клетках обработка Ang II индуцировала значительную активацию NF-κB через 6 и 24 часа обработки ( P <0,05) как в клетках A10, так и в клетках HISM (фиг. 4). В клетках, трансфицированных siRNA HSF-1, ДНК-связывающая активность NF-κB, индуцированная Ang II, была значительно выше ( P <0,05) через 6 и 24 часа обработки Ang II по сравнению с таковой у нетрансфицированных (фиктивных) клеток. (Инжир.4). Не было явной разницы в контрольных клетках, трансфицированных siRNA, по сравнению с нетрансфицированными (фиктивными) клетками без обработки Ang II или с обработкой Ang II в течение 6 часов.

Рис. 4

Эффект подавления экспрессии HSF-1 на Ang II-индуцированную активацию ядерного фактора (NF) -κB. (A) Ячейки A10. (B) клетки HISM. Ang II индуцировал активацию NF-κB как в клетках A10, так и в HISM после обработки Ang II в течение 6 и 24 часов. Ang II индуцировал значительно более высокую активацию NF-κB в HSF-1 siRNA 2 × нокдаун клетках.Контрольная миРНК 1 × не оказывала явного влияния на активацию NF-κB, индуцированную Ang II. Конкурентный анализ подтвердил специфичность комплексов для NF-κB. Комплексы NF-κB были скомпрометированы добавлением антитела против p65 и p50 в A10 и были суперсмещены в клетках HISM. *, ** P <0,05 и 0,01 по сравнению с фиктивным без обработки Ang II, соответственно. #, ## P <0,05 и 0,01 HSF-1, обработанная миРНК, по сравнению с фиктивной или контрольной обработанной миРНК, соответственно. Данные представляют 3 отдельных эксперимента.

Рис. 4

Эффект подавления экспрессии HSF-1 на Ang II-индуцированную активацию ядерного фактора (NF) -κB. (A) Ячейки A10. (B) клетки HISM. Ang II индуцировал активацию NF-κB как в клетках A10, так и в HISM после обработки Ang II в течение 6 и 24 часов. Ang II индуцировал значительно более высокую активацию NF-κB в HSF-1 siRNA 2 × нокдаун клетках. Контрольная миРНК 1 × не оказывала явного влияния на активацию NF-κB, индуцированную Ang II. Конкурентный анализ подтвердил специфичность комплексов для NF-κB.Комплексы NF-κB были скомпрометированы добавлением антитела против p65 и p50 в A10 и были суперсмещены в клетках HISM. *, ** P <0,05 и 0,01 по сравнению с фиктивным без обработки Ang II, соответственно. #, ## P <0,05 и 0,01 HSF-1, обработанная миРНК, по сравнению с фиктивной или контрольной обработанной миРНК, соответственно. Данные представляют 3 отдельных эксперимента.

3.5 Эффект подавления экспрессии HSF-1 на Ang II-индуцированную активацию AP-1

В нетрансфицированных (фиктивных) клетках A10 обработка Ang II в течение 6 и 24 часов также индуцировала активацию AP-1 (рис. 5А). Хотя обработка РНКи не вызывала значительно более высокой активности АР-1 через 6 часов по сравнению с фиктивной, обработка миРНК HSF-1 удваивала индуцированную Ang II активацию АР-1 через 24 часа. В нетрансфицированных (фиктивных) клетках HISM Ang II индуцировал активацию AP-1 только через 24 часа обработки (фиг. 5B). Напротив, в клетках, трансфицированных siRNA HSF-1, Ang II индуцировал значительно повышенную активацию AP-1 как через 6, так и через 24 часа обработки ( P <0,01). Кроме того, обработка миРНК HSF-1 значительно увеличилась ( P <0.01) Активация AP-1 через 6 и 24 часа обработки Ang II по сравнению с нетрансфицированными (фиктивными) клетками. Не было явной разницы в контрольных клетках, трансфицированных siRNA, по сравнению с нетрансфицированными (фиктивными) клетками без обработки Ang II или с обработкой Ang II в течение 6 часов.

Рис. 5

Эффект подавления экспрессии HSF-1 на Ang II-индуцированную активацию AP-1. (A) Ячейки A10. Ang II индуцировал активацию AP-1 после обработки в течение 6 и 24 часов. Ang II индуцировал значительно более высокую активацию AP-1 в siRNA HSF-1 в 2 × нокдаун клетках через 24 часа обработки ( P <0.05). (B) Ang II активировал AP-1 только через 24 часа в ложно обработанных клетках HISM, однако Ang II активировал AP-1 на значительно более высоком уровне как через 6, так и через 24 часа обработки в клетках, обработанных HSF-1 siRNA 2x. ( P <0,05). Контрольная миРНК 1х не оказывала заметного влияния на активацию АР-1, индуцированную Ang II. Конкурентный анализ подтвердил специфичность комплексов к АР-1. *, ** P <0,05 и 0,01 по сравнению с фиктивным без обработки Ang II, соответственно. ## P <0,01 Обработанная миРНК HSF-1 по сравнению сфиктивная или контрольная siRNA, обработанная. Данные представляют 3 отдельных эксперимента.

Рис. 5

Эффект подавления экспрессии HSF-1 на Ang II-индуцированную активацию AP-1. (A) Ячейки A10. Ang II индуцировал активацию AP-1 после обработки в течение 6 и 24 часов. Ang II индуцировал значительно более высокую активацию AP-1 в siRNA HSF-1 в 2 × нокдаун клетках через 24 часа обработки ( P <0,05). (B) Ang II активировал AP-1 только через 24 часа в ложно обработанных клетках HISM, однако Ang II активировал AP-1 на значительно более высоком уровне как через 6, так и через 24 часа обработки в клетках, обработанных HSF-1 siRNA 2x. ( P <0.05). Контрольная миРНК 1х не оказывала заметного влияния на активацию АР-1, индуцированную Ang II. Конкурентный анализ подтвердил специфичность комплексов к АР-1. *, ** P <0,05 и 0,01 по сравнению с фиктивным без обработки Ang II, соответственно. ## P <0,01 Обработанная миРНК HSF-1 по сравнению с обработанной фиктивной или контрольной миРНК. Данные представляют 3 отдельных эксперимента.

4 Обсуждение

В этом исследовании мы обнаружили, что миРНК HSF-1 специфически подавляла экспрессию HSF-1 в двух клеточных линиях, A10 и HISM.Подавление экспрессии HSF-1 с помощью HSF-1 РНКи впоследствии подавляло конститутивную и индуцибельную экспрессию одного белка теплового шока, Hsp27. Это подавление экспрессии HSF-1 и Hsp27 вызвало повышенную активацию NF-κB и AP-1 в VSMC после стимуляции Ang II воспалительных сигнальных путей.

В этом исследовании использовалась миРНК HSF-1 для подавления экспрессии HSF-1 в клетках A10 и HISM. Эта миРНК не оказывала явного влияния на экспрессию HSF-2 или актина и на морфологию клеток.Отрицательный контроль siRNA не влиял на экспрессию HSF-1 или Hsp27. Это предполагает, что РНКи представляет собой специфический и эффективный подход к подавлению экспрессии HSF-1. Поскольку количества олигофектамина были одинаковыми (2 мкл / лунку), и не было очевидной разницы между обработкой миРНК отрицательного контроля при 1х и 2х дозах на экспрессию HSF-1 и жизнеспособность клеток (рис.1), а также на HSF. -2 (данные не показаны), контрольную миРНК при дозировке 1 × использовали в качестве контроля в остальных экспериментах.В этом исследовании экспрессия Hsp27 была подавлена ​​в клетках, обработанных siRNA HSF-1, однако не исключена возможность снижения других Hsps.

В этом исследовании siRNA HSF-1 не только подавляла Hsp27 в нестрессированных клетках, но также подавляла уровни Hsp27 в клетках, обработанных HS или Ang II (рис. 3). В соответствии с данными van de Klundert et al. [16], обработка HS оказывала лишь минимальный эффект на экспрессию Hsp27 в нетрансфицированных клетках A10. Однако в клетках, трансфицированных siRNA HSF-1, обработка HS увеличивала уровни Hsp27 через 12 и 24 часа восстановления.Уровни Hsp27 снизились после 48 часов восстановления после обработки HS в клетках, трансфицированных HSF-1 siRNA. Обработка HS, по-видимому, временно противодействует эффекту siRNA HSF-1 через 12 и 24 часа восстановления, а эффект HS, по-видимому, исчезает через 48 часов.

Не совсем ясно, как белки теплового шока регулируют воспаление. Белки теплового шока — это высококонсервативные стрессовые белки, которые защищают клетки и организмы от стресса. Их индукция является быстрой и коррелирует с индукцией толерантности к высокой температуре и другим стрессам в самых разных клетках и организмах [17]. Одна из функций белков теплового шока — защищать клетки от поврежденных и нефункциональных белков. Белки теплового шока идентифицируют поврежденные стрессом полипептиды и нацелены на их деградацию посредством внутренних протеолитических путей [17] или реактивируют поврежденные стрессом белки через роль молекулярных шаперонов Hsps, таких как Hsp70, Hsp60, Hsp90 и Hsp27 [17]. В стрессовых условиях конститутивные Hsps диссоциируют от HSF, рекрутируются на поврежденные или денатурированные белки и способствуют повторной укладке, сборке и стабилизации денатурированных белков [1,18].

Также накапливаются доказательства того, что Hsps могут взаимодействовать с клеточными сигнальными путями и регулировать их. Например, Hsp70 ингибирует стресс-индуцированный апоптоз, подавляя c-Jun NH ₂ -концевую киназу (JNK) [19] и прокаспазу-9 [20]. Hsp27 является цитопротектором против апоптоза, регулируя каспазу-3 [21] и цитохром c -зависимую активацию прокаспазы-9 [22].

Помимо регуляции апоптотических сигнальных путей, Hsps, по-видимому, также регулируют воспалительные пути передачи сигналов. Было обнаружено, что семейство Hsp60 индуцирует секрецию макрофагами провоспалительных медиаторов, таких как TNF-α, IL-6, IL-12 и оксид азота [23,24]. Напротив, другие исследования продемонстрировали противовоспалительную роль Hsps. Сверхэкспрессия Hsp70 ускоряет выздоровление мышей после эндотоксического заражения [25]. У мышей с дефицитом HSF-1 (HSF — / -), экспрессирующих низкие уровни конститутивного Hsps, экспрессируются большие количества провоспалительных цитокинов, и мыши более восприимчивы к летальности, опосредованной эндотоксином, по сравнению с мышами дикого типа [26].При аутоиммунных заболеваниях назальное введение пептидов Hsp60 180–188 индуцирует высокоэффективную защиту от индуцированного адъювантом артрита за счет генерации регуляторных Т-клеток [27]. Также было обнаружено, что микобактериальные Hsp10 [28] и Hsp70 [29] подавляют индуцированный адъювантом артрит. Трансгенная сверхэкспрессия Hsp70 защищает от ишемии / реперфузионного повреждения сердца [5,30] и головного мозга [6,31].

Лечение тепловым шоком с сопутствующими высокими уровнями Hsp70 и Hsp27 и их фосфорилированием также защищает от вызванного Ang II сердечно-сосудистого воспаления, подавляя провоспалительный путь NF-κB [7,8].В нашей работе [7,8] и других [32,33] было обнаружено, что обработка HS подавляет активацию NF-κB путем ингибирования фосфорилирования и деградации его ингибитора IκB-α. Обработка HS также ингибирует активацию киназы IκB (IKK) [33] и снижает цитоплазматический уровень IKK-α [8]. Обработка HS также приводит к нерастворимости комплекса IKK [34]. Интересно, что Hsp70 и Hsp27, как было обнаружено, взаимодействуют напрямую с NF-κB, IκB-α, IKK-α и IKK-β в подавлении индуцированной стимулами активации NF-κB [35–37].Кроме того, было показано, что Hsp70, индуцированный обработкой HS, подавляет другие провоспалительные пути, такие как JNK и p38 [38,39]. Хотя Hsps подавляют провоспалительные пути, их роль может быть более общей, если будет обнаружено, что они также регулируют противовоспалительные пути. Hsps может по-разному регулировать провоспалительные и противовоспалительные сигнальные пути [40].

Здесь мы показали, что подавление HSF-1 подавляет экспрессию Hsp27 и это усугубляет вызванное Ang II воспаление, вызывая значительно более высокую активацию NF-κB и AP-1 в VSMC.Это дает убедительные доказательства роли Hsps, и в частности Hsp27, в подавлении вызванного Ang II воспалительного поражения.

В заключение, нокдаун HSF-1 с последующим подавлением Hsp27 обостряет Ang II-индуцированное воспаление в VSMC, что предполагает новую роль белков теплового шока в регуляции воспаления.

Благодарности

Авторы благодарят Синди Леопольд, Вэй Цзян и Кей Мерфи за их отличную техническую помощь.Мы также благодарим доктора Юндэ Пэна (Первая народная больница Шанхайского университета Цзяотун) за его помощь в разработке siRNA. Эта работа финансировалась за счет гранта Фонда сердца и инсульта Нью-Брансуика Р. Уильяму Карри. Ю Чен получил стипендии от Фонда Киллама и Фонда исследований в области здравоохранения Новой Шотландии.

Список литературы

Молекулярные шапероны в сворачивании клеточного белка

Природа

1996

381

571

579

Стресс-белки в воспалении

Ann N Y Acad Sci

1998

851

75

85

Стресс до смерти: регуляция апоптотических сигнальных путей белками теплового шока

Научно-исследовательский институт СТКЭ

2001

31

RE1

Реакция на тепловой шок связана с улучшенным постишемическим восстановлением желудочков

Circ Res

1988

63

543

549

и другие.

Трансгенные мыши, экспрессирующие белок теплового шока человека 70, улучшили постишемическое восстановление миокарда

Дж. Клин Инвест

1995

95

1854

1860

Трансгенные мыши, экспрессирующие индуцибельный Hsp70 человека, имеют нейроны гиппокампа, устойчивые к ишемическому повреждению

Шапероны клеточного стресса

1997

2

162

167

Обработка тепловым шоком защищает от гипертонии, вызванной ангиотензином II, и воспаления в аорте

Шапероны клеточного стресса

2004

9

99

107

Обработка тепловым шоком подавляет индуцированную ангиотензином II активацию пути NF-κB и воспаление сердца: роль в истощении IKK из-за теплового шока?

Am J Physiol

2004

287

х2104

х2114

Белки теплового шока и патофизиология сердечно-сосудистой системы

Physiol Rev

2001

81

1461

1497

Характеристика нового фактора транскрипции теплового шока цыплят, фактора теплового шока 3, предполагает новый регуляторный путь

Mol Cell Biol

1993

13

1983

1997

HSF4, новый член семейства факторов теплового шока человека, у которого отсутствуют свойства активатора транскрипции.

Mol Cell Biol

1997

17

469

481

Молекулярное клонирование и экспрессия фактора теплового шока человека, HSF1

Proc Natl Acad Sci U S A

1991

88

6906

6910

Влияние инсулина и гепарина на вызванное глюкозой повреждение сосудов в культуре клеток

Почки Int

2000

57

2492

2501

Анализ функции генов в соматических клетках млекопитающих с использованием малых интерферирующих РНК

Методы

2002

26

199

213

Измерение белка с помощью реагента фолин-фенол

J Biol Chem

1951

193

265

275

Альфа-В-кристаллин и hsp25 в клетках сердца новорожденных — различия в клеточной локализации в условиях стресса

евро J Cell Biol

1998

75

38

45

Функция белков теплового шока при стрессоустойчивости: деградация и реактивация поврежденных белков

Annu Rev Genet

1993

27

437

496

и другие.

Регулирование олигомеризации Hsp27, функции шаперона и защитной активности против окислительного стресса / фактора некроза опухоли альфа путем фосфорилирования

J Biol Chem

1999

274

18947

18956

Hsp72 и стресс-киназа c-jun N-концевая киназа регулируют бид-зависимый путь апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли

Mol Cell Biol

2002

22

3415

3424

и другие.

Белок теплового шока 70 ингибирует апоптоз, предотвращая рекрутирование прокаспазы-9 в апоптосому Apaf-1

Nat Cell Biol

2000

2

469

475

и другие.

Белок теплового шока 27 увеличивается после андрогенной абляции и играет цитопротекторную роль при гормонорезистентном раке простаты

Рак Res

2004

64

6595

6602

HSP27 ингибирует цитохром c -зависимую активацию прокаспазы-9

FASEB J

1999

13

2061

2070

Передний край: белок теплового шока 60 является предполагаемым эндогенным лигандом комплекса толл-подобного рецептора-4

Дж Иммунол

2000

164

558

561

и другие.

Человеческий белок теплового шока 60 индуцирует созревание дендритных клеток по сравнению с Th2-стимулирующим фенотипом

Дж Иммунол

2003

170

2340

2348

Ускоренное восстановление после эндотоксической нагрузки у мышей, предварительно обработанных тепловым шоком

Am J Physiol

2002

282

R1374

R1381

и другие.

HSF1 необходим для внеэмбрионального развития, постнатального роста и защиты во время воспалительных реакций у мышей

EMBO J

1999

18

5943

5952

и другие.

Ингибирование адъювант-индуцированного артрита регулирующими клетками, управляемыми интерлейкином-10, индуцированное назальным введением пептидного аналога связанного с артритом белка теплового шока 60 Т-клеточный эпитоп

Rheum артрита

2002

46

1937

1946

и другие.

Профилактическое введение Mycobacterium tuberculosis 10-кДа белок теплового шока (hsp10) подавляет адъювантный артрит у крыс Lewis

Инт Иммунофармакол

2002

2

463

474

Последовательность консервативного белка микобактериального теплового шока (hsp) 70 предотвращает адъювантный артрит при назальном введении и индуцирует продуцирующие IL-10 Т-клетки, которые перекрестно реагируют с собственным гомологом hsp70 млекопитающих

Дж Иммунол

2000

164

2711

2717

Сверхэкспрессия индуцируемого крысами белка теплового стресса массой 70 кДа у трансгенных мышей увеличивает устойчивость сердца к ишемическому повреждению

Дж. Клин Инвест

1995

95

1446

1456

и другие.

Нацеливание экспрессии hsp70i на дискретные популяции нейронов с использованием промотора Lmo-1: оценка нейрозащитных эффектов hsp70i in vivo и in vitro

J Cereb Blood Flow Metab

2001

21

972

981

и другие.

Индукция стрессовой реакции in vivo снижает активность ядерного фактора-каппа B в слизистой оболочке тощей кишки мышей с эндотоксемией

Arch Surg

2000

135

860

866

Противовоспалительный эффект индукции белка теплового шока связан со стабилизацией I каппа B альфа за счет предотвращения активации I каппа B киназы в клетках респираторного эпителия

Дж Иммунол

2000

164

5416

5423

Индуцированное стрессом ингибирование сигнального пути NF-κB является результатом перевода в нерастворимую форму киназного комплекса IκB после его диссоциации от белка теплового шока 90

Дж Иммунол

2005

174

384

394

Предварительная обработка липополисахаридом снижает размер инфаркта миокарда: возможный механизм, включающий 70-ингибирующий белок теплового шока комплекс каппа-B-альфа и ослабление ядерного фактора каппа-B

J Thorac Cardiovasc Surg

2002

124

933

941

Главный стрессовый белок Hsp70 взаимодействует с регуляторным комплексом NF-κB в клетках Т-лимфомы человека

Шапероны клеточного стресса

1997

2

132

139

Связь белка теплового шока 27 с киназным комплексом I каппа B регулирует активацию NF-каппа B, индуцированную фактором некроза опухоли альфа

J Biol Chem

2003

278

35272

35278

HSP70 и фактор теплового шока 1 взаимодействуют для репрессии индуцированной Ras транскрипционной активации гена c-fos

Шапероны клеточного стресса

2000

5

406

411

Ответ на тепловой шок подавляет экспрессию IL-18 через путь JNK в перитонеальных макрофагах мыши

Biochem Biophys Res Commun

2002

296

742

748

Обработка тепловым шоком подавляет SP-1 и AP-1, индуцированные ангиотензином II, и стимулирует ДНК-связывающую активность Oct-1 в сердце

Inflamm Res

2005

54

Заметки автора

Авторские права © 2005, Европейское общество кардиологов

PLDα1-нокдаун семян сои демонстрируют более высокое содержание ненасыщенных глицеролипидов и рост семян при высокой температуре и влажности | Биотехнология для производства биотоплива

Получение трансгенных растений сои со специфическим для семян нокдауном

Соя PLDα1KD Трансгенные растения были получены путем стабильной трансформации сорта сои Jack конструкцией РНК-интерференции (RNAi) GmPLDα1 сои под контролем специфичного для семян промотора β-конглицинина (рис. 1a, Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Трансгенные растения T0 и T2 подвергали скринингу с помощью qRT-PCR и иммуноблоттинга с использованием антител против PLDα1 Arabidopsis. Это антитело специфически распознавало GmPLDα1 с массой ~ 92 кДа как в тканях листа, так и в тканях семян сои (рис. 1). У трансгенного и фонового сорта Джек семена наблюдались разные уровни накопления PLDα1 (рис. 1). Иммуноблоттинг-скрининг регенерированных трансгенных линий сои показал, что в линии # 1020 ( PLDα1KD2 ) белки PLDα1 в развивающихся и зрелых семенах почти полностью уменьшились за счет экспрессии PLDα1RNAi (рис.1b), тогда как в другой регенерированной трансгенной линии сои № 1048 ( PLDα1KD1 ) обнаружено около 25% от таковой у сорта сои дикого типа Jack (рис. 1c). Для подтверждения специфической для семян экспрессии PLDα1RNAi и специфического для семян подавления PLDα1 сои белки, экстрагированные из листьев и семян двух линий PLDα1KD и контроля дикого типа (Jack), были иммуноблотированы на PLDα1, и белки PLDα1 оставались в листьях. обеих трансгенных линий PLDα1KD1 и PLDα1KD2 , но в их семенах было значительно меньше (рис.1г). Анализ активности PLDα1 показал, что активность PLD в PLDα1KD1 и PLDα1KD2 составляла 23% и 10% от таковой у дикого типа, соответственно (рис. 1e).

Генерация нокдаун-линий сои PLDα1 . Трансгенные растения сои PLDα1KD получали путем стабильной трансформации сорта сои Jack конструкцией РНК-интерференции (РНКи) PLDα1 сои. Для анализа использовали трансгенные растения сои. a Строительство сои PLDα1KD .1151 п.н. одно вперед, а другое наоборот и разделенные фрагментом ДНК Pdk — I гена, управляется семяспецифическим промотором для сои β — ген конглицинина , кодирующий основной запасной белок семян в семенах и оканчивается терминатором гена Phaseo . b Иммуноблоттинг, скрининг PLDα1 в семенах трансгенных растений сои 1020 ( PLDα1KD1 ). 1-6 обозначают отдельные растения из трансгенной линии или Джека дикого типа (контроль). c Обнаружение иммуноблоттингом PLDα1 в семенах другой трансгенной линии сои 1048 ( PLDα1KD2 ). 1-3 обозначают отдельные растения от каждой трансгенной линии или Джека дикого типа (контроль). d Иммуноблоттинг PLDα1 с использованием белков, экстрагированных из листьев и семян двух линий PLDα1KD 1. e Активность PLDα1 в двух линиях 1 PLDα1KD и линии Jack1 дикого типа (контроль) в развивающихся семенах

Влияние

Семейство PLD сои состоит из 23 членов (дополнительный файл 1: рисунок S2a, дополнительный файл 2: таблица S2, данные S1).Чтобы оценить влияние PLDα1KD на паттерны экспрессии различных PLD, были протестированы развивающиеся семена PLDα1KD из поколений T3 и T5 трансгенных линий PLDα1KD (фиг. 2). Три GmPLDα имеют высокую экспрессию (дополнительный файл 2: таблица S3) [32]. У мутантов PLDα1KD экспрессия различных PLDα , включая нацеленные PLDα1 , была значительно снижена по сравнению с контрольной группой на разных стадиях развития (рис.2, Дополнительный файл 1: Рисунок S2c, d). В контрольных семенах Jack GmPLDα3 имеет наиболее высокую экспрессию, GmPLDα1 является вторым по величине, а GmPLDα4 является третьим наиболее высоко экспрессируемым геном PLD в развивающихся семенах (рис. 2, дополнительный файл 1: рис. S2b). , Дополнительный файл 2: Таблица S4) [33]. При использовании пары праймеров, которые амплифицируют все GmPLDα s, общая экспрессия GmPLDα демонстрирует аналогичный паттерн, как и для вышеуказанного основного GmPLDα s. GmPLDβ3 мутантов PLDα1KD были ниже, чем у мутантов дикого типа на ранних стадиях развития семян, но выше, чем у Джека на поздних стадиях развития семян (дополнительный файл 1: рисунок S2c). Среди GmPLDβ s, GmPLDβ4 показал самый высокий уровень экспрессии в развивающихся семенах, а затем GmPLDβ1 . Большинство других PLDβ экспрессируются на низком уровне в развивающихся семенах сои (рис. 2, дополнительный файл 1: рисунок S2b, дополнительный файл 2: таблица S4) [33].Среди двух основных GmPLDδ , экспрессируемых в развивающихся семенах, GmPLDδ1 был ниже на стадиях 4 и 5, а GmPLDδ2 был ниже на стадиях 2 и 5, чем у дикого типа (рис. 2). Результаты показывают, что GmPLDα1 РНКи также мешает транскриптам других генов PLD , вероятно, из-за высокого сходства последовательностей среди генов PLD .

Профили экспрессии генов GmPLD в PLDα1KD и развивающихся семенах дикого типа.KD1 : PLDα1KD линия 1; KD2: PLDα1KD линия 2. 1, 2, 3, 4, 5 обозначают различные стадии развития семян, соответствующие свежему весу: стадия 1, 30–70 мг; 2 стадия 100–150 мг; 3 стадия 200–250 мг; 4 стадия — 300–350 мг; 5 этап, 400–480 мг. Данные являются средними ± стандартное отклонение. ( n = 3). * и ** Обозначить значимость при P <0,05 и P <0,01, соответственно, по сравнению с контролем по критерию Стьюдента t . a Внешний вид семян PLDα1KD и Jack (WT) дикого типа на разных стадиях развития. b Профили экспрессии основных PLD s во время развития семян. Суммарная РНК была выделена из развивающихся семян на разных стадиях развития

Большинство тканей растений в условиях абиотического стресса, таких как засуха, засоление, озон, высокая температура и наводнения, обычно генерируют более активные формы кислорода (АФК), что часто бывает связаны с синтезом большего количества ферментов, участвующих в улавливании АФК, чтобы уменьшить окислительное повреждение [6, 34,35,36].При высокой температуре и влажности развивающиеся семена дикого типа демонстрировали повышенные уровни экспрессии генов, улавливающих АФК, что указывает на то, что семена могут столкнуться с повышенным образованием АФК (дополнительный файл 1: Рисунок S3). Экспрессия нескольких генов, таких как глутатион S-трансферазы ( GST23 ), пероксидазы ( POD ), каталазы ( CAT1 ), супероксиддисмутазы ( SOD1 ), пероксидазы аскорбиновой кислоты ( APX ), а также белок теплового шока STI [6, 35], сильно индуцировались с течением времени во время стресса при высокой температуре и влажности (дополнительный файл 1: Рисунок S3).Уровень транскрипта GmPLDα1 также увеличился в девять раз через 6 часов после термообработки по сравнению с семенами при нормальной температуре (дополнительный файл 1: Рисунок S3). Большинство генов, реагирующих на стресс и поглощающих АФК, таких как GST23 , POD , CAT1 , SOD1 , STI и APX , в семенах PLDα1KD1, развивающих более высокий транскрипт и PLDα1 уровни, чем в контроле дикого типа в условиях высокой температуры и влажности (рис.3б).

Рис. 3

Погодные условия в районах Средней части реки Янцзы и тепловой стресс, вызванный окислительным стрессом и генами, поглощающими АФК, в развивающихся семенах. a Изменения температуры и влажности в среднем течении реки Янцзы за последние 10 лет. Данные были загружены с сайта https://tianqi.911cha.com. b Экспрессию генов, связанных со стрессом, в семенах Jack (WT) дикого типа (WT) и PLDα1 KD , выращенных в условиях высокой температуры и смирения, исследовали с помощью qRT-PCR.KD1: PLDα1 , линия нокдауна 1; KD2: PLDα1 , нокдаун, линия 2. 1, 2, 3, 4, 5 указывают различные стадии развития семян, соответствующие свежему весу, как описано выше. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * и ** Обозначить значимость при P <0,05 и P <0,01, соответственно, по сравнению с Jack дикого типа (WT) на основе теста Стьюдента t

Повышение уровня ненасыщенных жирных кислот ТАГ и фосфолипидов в

PLDα1KD семян

Мы исследовали изменения содержания ТАГ и жирнокислотного состава PLDα1KD и линий сои дикого типа на разных стадиях развития. Общее содержание жирных кислот постоянно увеличивалось по мере созревания семян (рис. 4, дополнительный файл 1: рис. S4). Кроме того, четкие различия между PLDα1KD и семенами дикого типа в ненасыщенных жирных кислотах, 18: 1, 18: 2 и 18: 3, были обнаружены на всех стадиях развития семян. Соевое масло дикого типа содержит 13% пальмитиновой кислоты (16: 0), 4% стеариновой кислоты (18: 0), 20% олеиновой кислоты (18: 1), 55% линолевой кислоты (18: 2) и 8% линоленовой кислоты. acid (18: 3) (рис. 4, дополнительный файл 1: рис. S4).Более высокое содержание ненасыщенных жирных кислот в ТАГ наблюдалось в семенах PLDα1KD , чем в семенах Jack дикого типа при нормальных условиях (рис. 4, дополнительный файл 1: рис. S4). Различия между PLDα1KD2 и диким типом стали больше, чем между PLDα1KD1 и диким типом в стрессовых условиях, что позволяет предположить, что степень подавления PLDα1 может быть пропорциональна содержанию ненасыщенных жирных кислот. Чтобы определить, является ли разница в ненасыщенности результатом жирных кислот в ТАГ или фосфолипидов, мы проанализировали состав жирных кислот в ТАГ и фосфолипидах, разделенных с помощью ТСХ. Общее содержание ТАГ в мутантных семенах PLDα1KD было выше, чем в семенах дикого типа на большинстве стадий развития (фиг. 4, дополнительный файл 1: фиг. S4). Соответственно, содержание общих ненасыщенных жирных кислот (в основном 18: 1 и 18: 2) в семенах стадии 5 мутантных линий PLDα1KD1 и 2 было сопоставимым. Оба были примерно в два и десять раз выше, чем у семян дикого типа при нормальных условиях роста и условиях высокой температуры и влажности, соответственно (рис.4, Дополнительный файл 1: Рисунок S4). Общее содержание жирных кислот в WT при нормальных условиях было в 1,5 раза выше, чем при высокой температуре и влажности в семенах стадии 3. Этот результат согласуется с предыдущим наблюдением о том, что высокая температура снижает содержание масла в семенах сои [6]. Однако общее содержание жирных кислот в развивающихся семенах GmPLDα1KD практически не изменилось, что может означать, что нокдаун GmPLDα1 стабилизирует содержание жирных кислот в семенах при высокой температуре (рис. 4, Дополнительный файл 1: Рисунок S4).

Рис. 4

Анализ тепловой карты жирнокислотного состава общих липидов и ТАГ из PLDα1KD и развивающихся семян дикого типа. Точные количественные данные см. В Дополнительном файле 1: Рисунок S4. Представленные значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение по крайней мере для трех независимых повторов. KD1-h, KD2-h и WT-h: PLDα1 , нокдаун, линия 1, 2 и домкрат дикого типа, соответственно, при высокой температуре и влажности, для которых использовались жирные линии; KD1-n, KD2-n и WT-n: PLDα1 , нокдаун линии 1, 2 и Jack дикого типа, соответственно, при нормальной температуре и влажности.1, 2, 3, 4 и 5 обозначают различные стадии развития семян, соответствующие свежему весу, как описано ранее. Значения взяты из среднего ± стандартное отклонение ( n = 3)

Повышение регуляции

FAD s в развивающихся семенах PLDα1KD по сравнению с диким типом

В ER FAD2 синтезирует линолевую кислоту из олеиновой кислоты, а FAD3 катализирует превращение линолевой кислоты в α-линоленовую кислоту на ПК ( Рис. 5а). FAD2 — 2A (Glyma.19G147400), FAD2 — 2B (Glyma.19G147300), FAD2 — 2C (Glyma.15G195200) и GmFAD2 — 2D (Glyma.03G144500 конститутивно экспрессировались в развивающихся семенах). ткани сои [37,38,39], тогда как FAD2 — 1A (Glyma.10G278000) и FAD2 — 1B (Glyma.20G111000) специфически экспрессируются в развивающихся семенах и играют важную роль в контроле уровень олеиновой кислоты в развивающихся семенах сои (дополнительный файл 1: Рисунок S5) [32, 33].Признак низкого содержания линоленовой кислоты у сои требует комбинации до трех различных рецессивных аллелей генов FAD3 , которые кодируют десатуразы жирных кислот омега-3 [40, 41]. GmFAD3 включает GmFAD3A (Glyma.14G194300), GmFAD3B (Glyma.02G227200) и GmFAD3C (Glyma.18G062000).

Рис. 5

Паттерны экспрессии генов FAD в PLDα1KD и развивающихся семенах дикого типа. Ферменты a FAD участвуют в десатурации фосфолипидов с различными молекулами ПК в качестве предпочтительных субстратов. b Экспрессия генов FAD в развивающихся семенах сои разного генетического фона в различных условиях роста. FAD2, микросомальная Δ12-десатураза; FAD3, микросомальная ω3-десатураза; FAD6, пластидиальная Δ12-десатураза. Номера осей X обозначают каждую стадию разработки. KD1-h, KD2-h и WT-h: PLDα1 , нокдаун линии 1 и 2 и домкрат дикого типа, соответственно, при высокой температуре и влажности; KD1-n, KD2-n и WT-n: PLDα1 , нокдаун линии 1 и 2 и Jack дикого типа, соответственно, при нормальной температуре и влажности.1–5 указывают на разные стадии развития семян, соответствующие свежему весу, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения представляют собой среднее значение + стандартное отклонение ( n = 3). * и ** Обозначить значимость при P <0,05 и P <0,01, соответственно, по сравнению с Джеком дикого типа (WT) на основе теста Стьюдента t

Количественные результаты ОТ-ПЦР показали, что экспрессия FAD2 — 1B была намного выше в развивающихся семенах PLDα1KD , чем в семенах дикого типа как в нормальных, так и в стрессовых условиях (рис. 5б). Данные микрочипов показали, что FAD2 s были высоко экспрессированы в семенах во время развития [33]. FAD2 — 1B и FAD2 — 1A в основном экспрессировались на поздних стадиях развития семян, и их транскрипты были выше у PLDα1KD , чем у дикого типа в обоих условиях. Уровни транскриптов GmFAD3A , GmFAD3B и GmFAD3C обычно были высокими в развивающихся семенах (фиг. 5b, дополнительный файл 1: фиг. S5).При высокой температуре уровень экспрессии FAD3B увеличился до максимального уровня на стадии 4, а затем снизился. Однако в нормальных условиях уровень транскрипта FAD3B был выше на всех стадиях развития по сравнению с таковым в стрессовых условиях. Кроме того, уровень транскрипта FAD3B был намного выше в PLDα1KD1 , чем в семенах дикого типа при нормальных условиях (фиг. 5b). Уровни экспрессии основных FAD в семенах были выше при нормальных условиях, чем при высоких температурах, за исключением GmFAD2 — 2A и GmFAD3C , уровни экспрессии которых в нормальных условиях были обычно низкими и увеличивались в ответ. к повышенным температурам.Экспрессия локализованного в хлоропласте GmFAD6A также была выше в PLDα1KDs , чем у дикого типа, и повышалась в стрессовых условиях (фиг. 5b).

Повышенное содержание PC и PE в семенах

PLDα1KD

Содержание PC и PE между линиями дикого типа и обеими линиями PLDα1KDs было сравнимо при нормальных условиях роста (рис. 6a), но они стали разными при высокой температуре и влажности условий (рис. 6б). Чтобы сравнить статус ненасыщенности фосфолипидов в семенах PLDα1KD с диким типом на разных стадиях развития в условиях стресса, мы профилировали фосфолипиды на стадиях развития 2, 3 и 4, поскольку экспрессия PLDα1 была выше на этих стадиях.Уровень большинства фосфолипидов существенно не изменился на этих трех стадиях (рис. 6b). Однако семена растений PLDα1KD1 и 2 имели в среднем на 132% PC и 47% PE выше, чем у семян дикого типа на стадии 3 (фиг. 6b). Уровень PC, особенно с ацильными цепями ненасыщенных жирных кислот, был значительно выше в семенах PLDα1KD , чем в семенах дикого типа. PLDα1KD семена имели более высокие уровни PC и PE с ацильными цепями 36: 5, 36: 6, 36: 4, 36: 3, 36: 2, 34: 3, 34: 2 (общее количество ацильных углеродов: общее количество ацильных двойных связей) (Инжир.6б). Уровень PA в семенах PLDα1KD на всех трех стадиях был намного ниже, чем у семян дикого типа, со снижением более чем на 81% (рис. 6b). Кроме того, общие уровни LPC, лизофосфатидилэтаноламина (LPE) и лизофосфатидилглицерина (LPG) были ниже в семенах PLDα1KD , чем в семенах дикого типа, при этом LPC и LPE были снижены на 90% в семенах стадии 3 (рис. 7). Общий MGDG увеличился в семенах PLDα1KD по сравнению с семенами дикого типа, тогда как содержание DGDG осталось неизменным.Разница в содержании ПК между GmPLDα1KD и семенами дикого типа при высокой температуре и влажности была больше, чем в нормальных условиях (рис. 6, 7).

Рис. 6

Профили фосфолипидов в PLDα1KD и развивающихся семенах дикого типа. a Профили фосфолипидов в зрелых семенах KD ( PLDα1KD ) и Джека дикого типа (WT) по данным ESI-MS / MS. Все семена собраны с растений сои, выращенных в нормальных условиях. b Общее содержание липидов основных липидов и молекулярных форм (общее количество ацильных цепей: двойные связи).Все растения выращивали при высокой температуре и влажности. Все растения выращивали при высокой температуре и влажности. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ( n = 4 или 5). WT-2: Джек дикого типа на стадии 2; КД1-2: линия нокдауна 1 на этапе 2; КД2-2: линия нокдауна 2 на этапе 2; Остальное можно объяснить так же. Все * и ** обозначают значимость при P <0,05 и P <0,01, соответственно, по сравнению с Jack дикого типа (WT) на основе теста Стьюдента t

Рис.7

Профили лизофосфолипидов в PLDα1KD и развивающихся семенах дикого типа. Общее содержание lysoPG, lysoPC, lysoPE и соответствующих видов молекул измеряли с помощью ESI-MS / MS. Все растения выращивали при высокой температуре и влажности. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ( n = 4 или 5). WT-2: Джек дикого типа на стадии 2; КД1-2: линия нокдауна 1 на этапе 2; КД2-2: линия нокдауна 2 на этапе 2; Остальное можно объяснить так же. Все * и ** обозначают значимость при P <0.05 и P <0,01, соответственно, по сравнению с Jack дикого типа (WT) на основе теста Стьюдента t

Уменьшение пулов PA в

PLDα1KD семенах

Мы дополнительно исследовали экспрессию генов, участвующих в биосинтезе PA. и катаболизм в семенах PLDα1KD (фиг. 8a). LPAATs , которые продуцируют PA из лизоПА, гидролазы PA (PAHs), которые дефосфорилируют PA с образованием DAG, и PLD, которые продуцируют PA в результате гидролиза фосфолипидов, все вносят вклад в изменения уровней PA.Геном сои содержит несколько генов, кодирующих LPAAT , соответствующих Arabidopsis AtLPAAT 1–5, которые являются важными ферментами для биосинтеза de novo PA как в эукариотических, так и в прокариотических путях биосинтеза глицеролипидов [42, 43]. Функция LPAAT в биосинтезе ТАГ у сои и арабидопсиса была задействована [16]. В развивающихся семенах сои основные транскрипты GmLPAAT и , в том числе GmLPAAT2α1 , GmLPAAT2α2 , накапливались по аналогичным схемам по сравнению с DGAT , PDAT или другими генами TAG, которые колебались в генах развивающихся генов (рис. .8, 9, 10, Дополнительный файл 1: Рисунок S6) [33]. Эти транскрипты GmLPAAT увеличились более чем на 21% в семенах PLDα1KD по сравнению с диким типом на 5 стадии развития в обоих условиях. Гены LPAAT2α1 и LPAAT2α2 были подавлены в генах дикого типа, и в обеих линиях PLDα1KD уровень транскрипта LPAAT2α2 был подавлен, но LPAAT2α1 оставался высоким в ответ на высокую температуру и влажность. напряжение (рис.8б).

Рис. 8

Профили экспрессии генов биосинтеза ТАГ в PLDα1KD и развивающихся семенах дикого типа. путь Кеннеди для биосинтеза ТАГ в ER. b Экспрессия основных генов, участвующих в пути Кеннеди, в развивающихся семенах сои с различным генетическим фоном при различных условиях роста. Номера осей X обозначают каждую стадию разработки. KD1-h, KD2-h и WT-h: линии нокдауна PLDα1 1, 2 и Jack дикого типа, соответственно, при высокой температуре и влажности, для которых использовались жирные линии; KD1-n, KD2-n и WT-n: линии нокдауна PLDα1 1, 2 и Jack дикого типа, соответственно, при нормальной температуре и влажности, для которых использовались тонкие линии.1, 2, 3, 4 и 5 обозначают различные стадии развития семян, соответствующие свежему весу, как описано ранее. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * и ** Обозначить значимость при P <0,05 и P <0,01, соответственно, по сравнению с Джеком дикого типа (WT) на основе теста Стьюдента t

Рис. 9

Дифференциальные паттерны экспрессии генов, участвующих в превращении PC-DAG в PLDα1KD и развивающихся семенах дикого типа. a Редактирование ацилов в фосфолипидах и TAG посредством преобразования PC – DAG. b Дифференциальная экспрессия генов, участвующих в конверсии PC – DAG, в развивающихся семенах разного генетического фона в различных условиях роста. Номера осей X обозначают каждую стадию разработки. KD1-h, KD2-h и WT-h: линии нокдауна PLDα1 1, 2 и Jack дикого типа, соответственно, при высокой температуре и влажности, для которых использовались жирные линии; KD1-n, KD2-n и WT-n: линии нокдауна PLDα1 1, 2 и Jack дикого типа, соответственно, при нормальной температуре и влажности, для которых использовались тонкие линии.1, 2, 3, 4 и 5 обозначают различные стадии развития семян, соответствующие свежему весу, как описано ранее. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * и ** Обозначьте значимость при P <0,05 и P <0,01, соответственно, по сравнению с Джеком дикого типа на основе теста Стьюдента t

Рис. 10

Экспрессия PLA и LPCAT , участвующих в редактировании ацила в PLDα1 KD и развивающихся семенах дикого типа. a Редактирование ацила в жирных ацильных цепях ПК посредством цикла PLA – LPCAT. b Экспрессия основных генов PLA и LPCAT , вовлеченных в развитие семян с разным генетическим фоном в различных условиях роста. Номера осей X обозначают каждую стадию разработки. KD1-h, KD2-h и WT-h: линии нокдауна PLDα1 1, 2 и Jack дикого типа при высокой температуре и влажности, в которых использовались жирные линии; KD1-n, KD2-n и WT-n: линии нокдауна PLDα1 1, 2 и Jack дикого типа при нормальной температуре и влажности, для которых использовались тонкие линии, соответственно.1, 2, 3, 4 и 5 обозначают различные стадии развития семян, соответствующие свежему весу, как описано ранее. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). * и ** Обозначить значимость при P <0,05 и P <0,01, соответственно, по сравнению с Джеком дикого типа (WT) на основе теста Стьюдента t

Три гена PAH , гомологичные AtPAh2 и AtPAh3 , присутствуют в геноме сои. Их два, Глыма.13G134500 ( GmPAHβ1 ) и Glyma.10G046400 ( GmPAHβ2 ) были высоко экспрессированы в развивающихся семенах в тенденции, совпадающей с накоплением масла в семенах (дополнительный файл 1: Рисунок S7) [33]. Уровни транскриптов для GmPAHβ1 и GmPAHβ2 в PLDα1KD были на один и два раза выше, соответственно, чем в семенах дикого типа на стадии 4 в обоих условиях, а экспрессия GmPAHs вообще не зависела от высокой температуры. за исключением GmPAHβ1 на стадии 2 и GmPAHβ2 на стадии 3 (рис.8б). Комбинированные эффекты подавления PLDα1KD и заметно более высокого уровня экспрессии PAH способствовали снижению уровней PA, что было подтверждено зрелыми и развивающимися семенами (рис. 6, 7).

Измененные уровни транскриптов

DGAT и PDAT s для биосинтеза TAG в семенах PLDα1KD

Чтобы изучить, как PLDα1KD влияет на биосинтез TAG и метаболизм фосфолипидов в нескольких основных путях генов сои, мы исследовали (Инжир.8б). DGAT синтезирует TAG путем переноса ацильной группы на DAG из вновь синтезированного или рециклированного ацил-CoA (рис. 8a). Семейство DGAT в геноме сои состоит из 10 членов. DGAT типа 1, Glyma.13G106100 , Glyma.09G065300 и Glyma.17G053300 , были высоко экспрессированы в семенах. Тип 3 DGAT Glyma.17G041600 также был высоко экспрессирован в семенах. По сравнению с DGAT типа 1 и 3, DGAT типа 2, например Glyma.16G115700 и Glyma.09G195400 , были экспрессированы на более низком уровне в семенах [44]. Уровень транскриптов этих генов неуклонно увеличивался по мере развития семян (дополнительный файл 1: рисунок S8) [33]. PLDα1KD линии имеют более низкие уровни транскриптов для нескольких специфичных для семян DGAT s, таких как GmDGAT1A (Glyma.13G106100), GmDGAT1C (Glyma.09G065300) и GmDGAT3BO GmDGAT3B. стадии в обоих условиях, что указывает на то, что линий PLDα1KD имеют сниженный вклад через путь DGAT в синтез ТАГ (рис.8б). Между тем, экспрессия GmDGAT1A и GmDGAT3B была увеличена, тогда как экспрессия GmDGAT1C была подавлена ​​в линиях PLDα1KD и дикого типа в условиях высоких температур по сравнению с нормальными условиями.

PDAT передает sn -2 ацильную группу от фосфатидилхолина или фосфатидилэтаноламина к DAG для производства TAG в растениях и дрожжах (рис. 8a) [45, 46], а в семенах сои DAG из PC в основном используется для биосинтеза TAG. .Было показано, что PDAT и DGAT имеют перекрывающиеся функции в биосинтезе ТАГ [47]. Геном сои содержит 6 предполагаемых генов PDAT , среди которых Glyma.12G084000 , Glyma.11G1 и Glyma.13G108100 , а также Glyma.07G036400 , были высоко экспрессированы в семенах. Транскрипты этих PDAT неуклонно увеличивались во время развития семян, за исключением Glyma.07G036400 (дополнительный файл 1: Рисунок S9) [33]. Уровень транскрипта генов PDAT в семенах PLDα1KD был более чем выше, чем в семенах дикого типа на стадиях 3–5 в обоих условиях, что позволяет предположить, что семена PLDα1KD имеют повышенный уровень PDAT-опосредованных, зависимых от DAG-PC TAG. биосинтез (рис.8б). Между тем, высокая температура и влажность подавляли экспрессию GmPDAT1B как в семенах PLDα1KD , так и в семенах дикого типа.

Повышенная конверсия PC – DAG и редактирование ацила в

PLDα1KD семенах сои

Чтобы проверить, вносит ли активный путь PC – DAG – PDAT вклад в больший биосинтез TAG в PLDα1KD , чем в PLDα1KD дикого типа, мы сравнили уровни транскриптов соответствующие гены. Для синтеза PC холин / этаноламинкиназа (CEK) производит фосфохолин, который используется CTP: фосфохолинцитидилилтрансферазой (CCT) для синтеза CDP-холина (дополнительный файл 1: рисунки S10, S11).DAG: холинфосфотрансфераза (CPT) затем переносит холин из CDP-холина в DAG для генерации PC (фиг. 9a). В геноме сои есть два гена CCT, CCT1 ( Glyma.09G051200 ) и CCT2 ( Glyma.15G157500 ), и их уровни транскриптов колебались во время развития семян (рис. 9b, дополнительный файл 1: рис. S11). [33]. Однако транскрипты CCT s в линиях PLDα1KD подавлялись примерно на 18% на стадии 3 в обоих условиях.Экспрессия GmCCTs подавлялась как в линиях PLDα1KD , так и в семенах дикого типа в условиях высокой температуры и влажности.

DAG-CPT и PDCT формируют важный цикл обмена / преобразования PC-DAG для обеспечения ацильного редактирования TAGs (Fig. 9a). В развивающихся семенах PLDα1KD , DAG: CPT (также называемых AAPT), DAG: CPT1 и 2 ( Glyma.12G081900 и Glyma.02G128300 , соответственно), были усилены по сравнению с таковыми в в обоих условиях развиваются семена дикого типа (рис.9b, Дополнительный файл 1: Рисунок S12). Геном сои содержит два гена PDCT , GmPDCT1 ( Glyma.07G029800 ) и 2 ( Glyma.08G213100 ). Эти два гена были высоко экспрессированы в развивающихся семенах сои (дополнительный файл 1: рисунок S13) [33]. Транскрипт GmPDCT2 активируется на ранних стадиях развития, а затем снижается на поздних стадиях посева в обоих условиях. GmPDCT1 и 2 были значительно активированы на стадиях 2-3 в развивающихся семенах PLDα1KD в обоих условиях (рис.9б). Экспрессия GmPDCT1 и GmDAG — CPT2 подавлялась на стадиях 3-5 в развивающихся семенах PLDα1KD в условиях высокой температуры и влажности. Два других гена GmPDCT2 и GmDAG — CPT1 показали сложные паттерны экспрессии в развивающихся семенах дикого типа и PLDα1KD в обеих средах. Эти данные предполагают, что активность взаимопревращения PC и DAG увеличивается, когда PLDα1 подавляется в развивающихся семенах сои.

Пониженные уровни транскрипта

PLA s, но повышенные уровни LPCAT в семенах PLDα1KD

Поскольку pPLA влияет на биосинтез TAG [15], мы исследовали экспрессию pPLA , которые были либо специфически, либо высоко экспрессированы в выращивание семян сои. Геном сои содержит большое семейство генов pPLA , и несколько pPLA сильно экспрессировались в развивающихся семенах, например Glyma.08g028800 , Glyma.11g036900 и Glyma.17G145900. pPLA s, Glyma.18g251500 и Glyma.09g243100 , экспрессировались только в семенах (дополнительный файл 1: Рисунок S14) [32, 33]. Транскрипты pPLA s ( Glyma01G.002400 и Glyma08G.028800 ) в семенах сои PLDα1KD были в среднем на 44% ниже, чем в семенах дикого типа на стадии 4 в обоих условиях, что соответствует более высоким уровням ПК в семенах сои PLDα1KD и более низким уровням лизофосфолипидов (фиг.6, 7, 10б). Между тем, высокая температура и влажность подавляли экспрессию GmPLA2s как в линиях PLDα1KD , так и в семенах WT. Подавление экспрессии PLD и PLA может объяснить более высокий уровень PC в семенах PLDα1KD .

Поскольку содержание LPC и LPE значительно снизилось в PLDα1KD , чем в семенах дикого типа, более чем в десять раз на стадии 3, мы исследовали экспрессию генов, участвующих в цикле LPC и PC.LPC-ацилтрансфераза ( LPCAT ) катализирует синтез PC из LPC с использованием нового жирного ацил-КоА (рис. 10a). AtLPCAT1, и 2 в Arabidopsis контролируют процесс редактирования ацила, действуя в качестве основного входа ненасыщенных ЖК в ПК [16]. Мутант lpcat1 / lpcat2 показал снижение ПНЖК в ТАГ семян [16, 17]. Геном сои содержит два LPCAT: Glyma.17G131500 ( GmLPCAT1 ) и Glyma.05G049500 ( GmLPCAT2 ). Уровни транскриптов двух генов увеличивались до максимальных уровней на средних стадиях, а затем снижались на более поздних стадиях развития семян у обеих линий PLDα1KD в стрессовых условиях (рис.10b, Дополнительный файл 1: Рисунок S15) [33]. Оба транскрипта GmLPCAT были на 17% выше в семенах PLDα1KD , чем в семенах дикого типа на более поздних стадиях в стрессовых условиях (фиг. 10b). Между тем, оба гена активировались как в линиях PLDα1KD, , так и в генах дикого типа в условиях стресса. Понижающая регуляция GmPLA s и повышающая регуляция GmLPCAT в семенах сои PLDα1KD может привести к снижению содержания LPC и LPE по сравнению с диким типом (фиг.6, 7, 10).

Повышенная всхожесть семян

PLDα1KD

Чтобы устранить влияние PLDα1KD на жизнеспособность семян сои после сбора в условиях высокой температуры и влажности, мы протестировали силу семян и скорость прорастания этих нокдаун-линий и линий дикого типа после хранить при высокой температуре и влажности в течение трех месяцев (28 ± 3 ° C в темноте и влажности ~ 50%). Семена PLDα1KD показали более высокую всхожесть, чем семена дикого типа в условиях высокой температуры и влажности.В стрессовых условиях всхожесть семян дикого типа PLDα1KD 2 и PLDα1KD1 составляла 80%, 91% и 95% соответственно, тогда как в нормальных условиях они составляли 88%, 96% и 96% ( Рис. 11а, б). Однако скорость прорастания PLDα1KD1 была ниже, чем у дикого типа на ранней стадии, но затем догнала и стала выше, чем у дикого типа на более поздних стадиях. Мы дополнительно проанализировали уровни гормонов в этих проросших семенах в разные дни после набухания. Было обнаружено более высокое содержание АБК в семенах PLDα1KD , чем в семенах дикого типа, что позволяет предположить, что семена PLDα1KD имели более глубокий покой семян, чем семена дикого типа, и меньшее потребление питательных веществ в семенах PLDα1KD , чем в семенах дикого типа во время хранения.Между тем, семена PLDα1KD изначально имели более низкий уровень индолуксусной кислоты (ИУК), но позже более высокий уровень ИУК, чем семена дикого типа (фиг. 11c). Аналогичным образом, семена двух линий PLDα1KD показали разницу в уровне жасмоната (JA) и Ile-конъюгированного JA от дикого типа (фиг. 11c). PLDα1KD Семена линии 1 (KD1) имели более низкие общие JA и более низкую скорость прорастания, тогда как PLDα1KD линия 2 имела более высокие общие JA и более высокую скорость прорастания, чем семена дикого типа (рис.11в). Содержание МДА было снижено в семенах PLDα1KD , прорастающих в течение 1 дня, и не имело значимых различий в течение 2–4 дней по сравнению с семенами дикого типа. Также не было значительной разницы в содержании растворимого сахара как в проросших семенах PLDα1KD , так и в прорастающих семенах дикого типа (фиг. 11d).

Рис. 11

Скорость прорастания и уровни гормонов PLDα1KD — и семян дикого типа. a Скорость прорастания семян PLDα1KD и дикого типа Jack (WT) в нормальных условиях после созревания в условиях высокой температуры (30–36 ° C) и влажности (70–85%).Значения являются средними ± стандартное отклонение ( n = 30 в одной повторности). b Проращивание семян PLDα1KD и сои дикого типа Jack (WT) в течение 3 дней. c Уровни гормонов в прорастающих семенах PLDα1KD и Джека дикого типа (WT). d Содержание малонового альдегида и растворимых сахаров. KD1: PLDα1 , линия нокдауна 1; KD2: PLDα1 , линия 2 нокдауна; WT: Джек дикого типа. Все данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3).