Наталья чекулаева: Наталья Чекулаева – ФотоКто
Наталья Чекулаева, участница рейтинга ТОП-100 самых красивых девушек Тюмени
Знак зодиака: Рак
Любимый писатель: Александр Сергеевич Пушкин, самый любимый роман — «Евгений Онегин», так же люблю произведение «Мастер и Маргарита» Михаила Булгакова
Лучший фотограф Тюмени: Их два:Helen Yushkova и Сергей Ермолаев
Родилась я в самый солнечный прекрасный день – 25 июня 1989 года в Куйбышевской области, где прошло мое детство и закончила 8 классов.
В 14 лет переехала в Ямало-Ненецкий автономный округ, город Надым, в котором закончила 11 классов и поступила в Тюменский государственный нефтегазовый университет. В 2006 проходила военную подготовку в Детско-юношеском центре «Альфа». Благодаря которому стала заниматься спортом: пулевой стрельбой из пневматического оружия, участвовала в соревнованиях, занимала первые и вторые места. Отучившись два года на очном отделении я перешла на заочное. Трудовую деятельность начала в 2007 году в городе Надым. В июле 2014 года переехала в город Тюмень. Зимой повысила разряд по профессии «Оператор по добыче нефти и газа». В свободное время занимаюсь рукопашным боем и занимаюсь вышиванием стразами. Так же летом люблю фотографировать.
✅ ИП ЧЕКУЛАЕВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА, 🏙 Биробиджан (OГРН 304790124400018, ИНН 790100676790) — 📄 реквизиты, 📞 контакты, ⭐ рейтинг
Последствия пандемии
В полной версии сервиса доступна вся информация по компаниям, которых коснулись последствия пандемии коронавируса: данные об ограничениях работы и о программе помощи от государства тем отраслям, которые испытывают падение спроса
Получить доступКраткая справка
ИП ЧЕКУЛАЕВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА было зарегистрировано 08 февраля 1999 (существует 22 года) под
ИНН 790100676790 и
ОГРНИП 304790124400018.
Местонахождение Еврейская автономная область, город Биробиджан.
Основной вид деятельности ИП ЧЕКУЛАЕВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА: 47.52.1 Торговля розничная скобяными изделиями в специализированных магазинах.
Телефон, адрес электронной почты, адрес официального сайта и другие контактные данные ИП ЧЕКУЛАЕВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА отсутствуют в ЕГРИП.
Информация на сайте предоставлена из официальных открытых государственных источников.
Контакты ИП ЧЕКУЛАЕВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА
Местонахождение
Россия, Еврейская автономная область, город Биробиджан
Зарегистрирован 08 февраля 1999
Перейти ко всем адресам
Телефоны
—Электронная почта
—Конференция «Управление коммерческими закупками в промышленности»
группа Prosperity Media при поддержке портала CFO Russia провела конференцию «Управление коммерческими закупками в промышленности».
Конференция «Управление коммерческими закупками в промышленности».
На мероприятии спикеры из ведущих компаний раскрыли самую значимую и актуальную информацию и представили множество подробных практических кейсов. Партнером конференции стал «Tern Group».
Основные направления повышения эффективности коммерческих закупок рассмотрели: Жанна Баландина, руководитель группы закупок REHAU, Альфред Набиуллин, заместитель директора департамента закупочной деятельности ОАК, и Эдуард Федечкин, ведущий эксперт по системам бизнес-аналитики, «Терн».
В круглом столе «Взаимодействие между закупками и бизнесом для повышения операционной эффективности» приняли участие: Ксения Мелешкина, директор по закупкам «Алкогольная Сибирская Группа» (модератор), Наталья Чекулаева, руководитель региональной группы категории непрямые закупки Rockwool, Яна Корсакова, менеджер по непроизводственным закупкам «Данфосс», Наталья Хазова, директор департамента закупок и логистики SYMRISE. Участники обсудили следующие темы:
- кроссфункциональное взаимодействие закупщиков и внутренних клиентов;
- инструменты получения обратной связи;
- контакты с поставщиками: служба одного окна;
- как обосновать ценовые условия по контрактам;
- управление дебиторской задолженностью;
- централизация закупок для снижения расходов компании;
- развитие категорий закупок – развитие категорийных закупок.
Виктор Симоненко, руководитель направления электронных закупок «Россети», Анастасия Топорина, руководитель по закупкам логистических услуг IDS BORJOMI RUSSIA, Ксения Кравцова, руководитель службы закупок «НоваМедика», и Виктор Волков, начальник управления логистики и закупок «ГЕНЕРИУМ» в рамках своих кейсов раскрыли тему «Автоматизация и цифровизация в закупках».
Мария Кулиш, руководитель департамента закупок услуг строительства и аутсорсинга сетей «ВымпелКом», Наталья Хазова, директор департамента закупок и логистики SYMRISE, и Елена Жукова, старший менеджер по методологической поддержке закупок «Северсталь Менеджмент», выступили с докладами на тему «Планирование закупочного процесса».
Прочитать подробный отчет вы сможете на сайте CFO-Russia.ru.
Электронная почта и телефон Натальи Чекулаевой
Мы установили стандарт поиска электронных писем
Нам доверяют более 10,1 миллиона пользователей и 95% участников S&P 500.
Нам не с чего было начинать. Прочесывание сети в любое время ночи не поможет.RocketReach дал нам отличное место для старта. Наш рабочий процесс теперь имеет четкое направление — у нас есть процесс, который начинается с RocketReach и заканчивается огромным списком контактов для нашей команды продаж. Это, вероятно, экономит Feedtrail около 3 месяцев работы с точки зрения сбора потенциальных клиентов. Теперь мы можем отвлечь наше внимание на то, чтобы на самом деле преследовать клиента!
Отлично подходит для создания списка лидов.
Мне понравилась возможность определять личные электронные письма практически любого человека в Интернете с помощью RocketReach. Недавно мне поручили проект, который касался связей с общественностью, партнерства и информационно-разъяснительной работы, и RocketReach не только связал меня с потенциальными людьми, но и позволил оптимизировать мой подход к поиску на основе местоположения, набора навыков и ключевого слова.
До RocketReach мы обращались к людям через профессиональные сетевые сайты, такие как Linkedln.
Но нас раздражало то, что нам приходилось ждать, пока люди примут наши запросы на подключение (если они вообще их принимали), а отправка обходится слишком дорого. огромное количество контактов, которые мы смогли найти с помощью RocketReach, платформа, вероятно, сэкономила нам почти пять лет ожидания.
Это лучшая и самая эффективная поисковая система электронной почты, которую я когда-либо использовал, и я пробовал несколько.Как по объему поиска, так и по количеству найденных электронных писем я считаю, что он превосходит другие. Мне также нравится макет, который удобен для глаз, более привлекателен и эффективен. Суть в том, что это был эффективный инструмент в моей работе как некоммерческой организации, направленной на руководство.
До RocketReach процесс поиска адресов электронной почты состоял из поиска в Интернете, опроса общих друзей или поиска в LinkedIn.
Поиск электронных писем для целевого охвата был ручным и отнимал очень много времени. Когда я попробовал RocketReach и нашел бизнес-информацию о ключевых людях за считанные секунды в простом и беспроблемном процессе, я попался на крючок! Инструмент сократил время установления контакта с новыми потенциальными клиентами почти на 90%.
Big Fish Games | ||||||||||||||||||||||||||||
| Isaias Vallejo | ||||||||||||||||||||||||||||
| продюсер из свинца | Zachary Hines (Zach Hines) | |||||||||||||||||||||||||||
| Ведущий продюсер | Анна Рикс | |||||||||||||||||||||||||||
| Поддерживающие Производители | Кристин Дэвис, Ким Bartlett | |||||||||||||||||||||||||||
| Lead Художественная Дизайнер | Lisa Брюнет | |||||||||||||||||||||||||||
| Сюжетные Дизайнер | Фей Hoerauf | |||||||||||||||||||||||||||
Elephant Игры | ||||||||||||||||||||||||||||
| Главный исполнительный директор | Андрей Pahmutov (Андрей Пахмутов) сотрудник | |||||||||||||||||||||||||||
| Главный продукт | Петр Ефимов | |||||||||||||||||||||||||||
| Главный технический директор | Дмитрий Гаязов | |||||||||||||||||||||||||||
| Игровой конструктор | Петр Ефимов | |||||||||||||||||||||||||||
| Project Менеджер 9 0038 | Александр Tovashov | |||||||||||||||||||||||||||
| Дополнительные игры Дизайн | Ян Шевченко, Александр Yanalov, Александр Tovashov | |||||||||||||||||||||||||||
| Программисты | Елена Огнева | |||||||||||||||||||||||||||
| Lead Level Designer | Иван Суслов | |||||||||||||||||||||||||||
| Уровень Конструкторы | Артем Пономаренко, Евгений Колин | |||||||||||||||||||||||||||
| Level Design Assist | Вадим Федосов, Николай Мирошин | |||||||||||||||||||||||||||
| Ведущих Художники | Дарья Мосолова Ирина Пахмутова | |||||||||||||||||||||||||||
| 2D Художники | Анна Kapelkina, Елена Тимакова, Екатерина Тараненко | |||||||||||||||||||||||||||
| 3D Художники | Максим Sutov, Сергей Мозолин, Юнис Mukmenov, Василий Рожков | |||||||||||||||||||||||||||
| Музыка | Юрий Гинзбург | |||||||||||||||||||||||||||
| Sound Fx | Юрий Гинзбург | |||||||||||||||||||||||||||
| Голос Таланты | Kellie Fitzgerald (телеведущая и сигнализации , женщина), Крис А. Керман (Рассказчик), Тим Симмонс (Пиковая авеню), Стив Войтас (Джеймс Карр), Фелиция Гринфилд (Келли Астер), Майк Дивайн (Бубновый туз, офицер-мужчина) | |||||||||||||||||||||||||||
| В ролях | Юрий Синьковский (Арчибальд Карр) , Антон Типикин (Джеймс Карр), Вера Воздвиженская (Келли Астер), Ян Шевченко (Эйс), Александр Товашов (Эйс), Иван Суслов (Жертва 1), Дмитрий Белов (Жертва 2), Артем Пономаренко (Жертва 3), Елена Подузова (Жертва 4) | |||||||||||||||||||||||||||
| Кинооператор | Вадим Каипов | |||||||||||||||||||||||||||
| Писатели | Александр Yanalov, Наталья Чекулаева, Елена Полякова | |||||||||||||||||||||||||||
| Перевод | Наталья Трегубова (Наталья Трегубова), Наталья Чекулаева, Елена Полякова | |||||||||||||||||||||||||||
| Тестирование | Олег Тузов, Максим Кузнецов, Алексей Софронов, Николай Омелинский, Александр Ковенков | |||||||||||||||||||||||||||
| Техническая поддержка | Сергей Распопов, Егор Фетисов | |||||||||||||||||||||||||||
Elephant Games] Эта игра была создана с использованием PlayGround SDK™. Все права защищены.ЙОКОГАМА (Чемпионат мира по баскетболу INAS-FID 2006 г.) — Yokohama Cultural Gymnasium является местом проведения чемпионата мира по баскетболу INAS-FID 2006 г. среди мужчин и женщин, который проходит с 30 сентября по 6 октября. Из-за позднего ухода сборной Бразилии из мужской и женской команд из-за финансовых проблем технический делегат INAB-FID Фаусто Перейра столкнулся с трудным решением о том, как действовать дальше. После утешения с принимающей организацией и командами было решено, что все пять женских команд будут играть в одном круговом турнире с финалом, а мужчины — в двух группах с медальным раундом и утешительным раундом. Все согласились с тем, что это был самый честный способ действовать на благо команд. Мужчины — В первой игре первого дня Португалия, занявшая первое место в мире, победила принимающую страну Японию со счетом 108-36. Лучшими бомбардирами сборной Португалии стали Рикардо Мартинс с 39 очками и Карлос Луз с 21 очком. Во второй игре Австралия обыграла Грецию (64-62) в дополнительное время. Адам Мередит стал лидером Австралии по результативности с 19 очками, за ним последовал Николас Марони с 18 очками. Зографакис Трасивулос с 22 очками, включая 8 из последних 10, был лучшим для Греции, за ним последовал Бернхэм Глен с 11 очками. Польша обыграла ЮАР (119: 47) в третьей игре дня. Лучшими бомбардирами стали Тадеуш Трушчински и Томас Мадей, набравшие по 20 очков каждый, а также Томас Мачолл с 16 из Польши и Мксолиси Коса с 17 и Тато Морве с 11 из Южной Африки. Женщины — Польша обыграла принимающую Японию со счетом 100-48 благодаря результативности Онорате Фуява (28), Моники Стыба (22) и Каролины Латушек (21). Лучшим бомбардиром сборной Японии стала Нодока Хатагуити (18). Во втором женском матче Россия обыграла Мексику со счетом 53:42.Лучшими бомбардирами сборной России стали Екатерина Каминова (15) и Наталья Чекулаева (13). Россия обыграла Польшу 90 — 76. Голы за Россию набрали Ксения Хохлова (31), Екатерина Каминова (28) и Наталья Чекулаева (15) Ферандес (25) и Рикардо Мартинс (13).У Австралии по 8 очков у Николаса Марони, Девина Каррачера и Эвана Джонсона. Греция переиграла Японию в равной игре со счетом 63: 61. Георгиос Макридис (18) стал лучшим бомбардиром сборной Греции, набрав 12 очков из-за трехочковой линии. Дмитриос Зографакис добавил еще 15 для Греции. Шохей Цуэ с 20 и Юичиро Накагава с 18 были лучшими для Японии. В заключительной игре дня Россия победила ЮАР со счетом 116:61. За Россию забили Сергей Сорокин с 38 геймами, Александр Огурцов с 23 и Артур Мелконян с 17.Тато Морве стал лучшим бомбардиром сборной Южной Африки, набрав 33 очка в проигрыше.
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Настройка браузера на прием файлов cookieСуществует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:
Почему этому сайту требуются файлы cookie?Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня. Что сохраняется в файле cookie?Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется. Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. границ | Множественные роли полицистронного гена Tarsal-less/Mille-Pattes/Polished-Rice во время эмбриогенеза целующегося жука Rhodnius prolixusВведение В результате генетического скрининга модельных организмов, таких как плодовая муха Drosophila melanogaster (e.г., Нюссляйн-Фольхард и Вишаус, 1980). В то время как большинство локусов, важных для процессов развития, были идентифицированы в этих первоначальных скринингах, недавний анализ генетики и экспрессии у D. melanogaster и у жука Tribolium castaneum показал, что гены, ранее классифицированные как предполагаемые некодирующие РНК, кодируют функциональные небольшие открытые рамки считывания. Позже экспериментальный анализ консервативных smORF, таких как сарколамбан (scl) , консервативный пептид, участвующий в поглощении Ca 2+ в сарко-эндоплазматическом ретикулуме (Magny et al., 2013) и гемотин (Pueyo et al., 2016b), консервативный регулятор фагоцитоза, предоставили дополнительные доказательства того, что гены, содержащие smORF, могут составлять резервуар важных игроков в геномах многоклеточных животных. В то время как биоинформационные исследования указывают на сотни или тысячи генов, содержащих предполагаемые smORF, было проведено лишь несколько функциональных исследований. У насекомых функция члена-основателя smORF mille-pattes (mlpt) была подробно исследована только у насекомых с голометаболом, таких как D. melanogaster и T. castaneum (Savard et al., 2006; Галиндо и др. В то время как у D. melanogaster, mlpt ранняя экспрессия эмбрионального гена является сегментарной, демонстрируя паттерн парных правил, мутанты не обнаруживают сегментации или гомеотических изменений, как сообщалось у T. castaneum . Эмбриональные мутантные фенотипы D. melanogaster включают сломанную трахею, потерю черепно-глоточного скелета, аномальные задние дыхальца и отсутствие поясков зубцов, структуры экспрессии позднего эмбриона mlpt (Galindo et al., 2007). Чтобы выяснить, является ли функция сегментации mlpt наследственной, но утраченной в линии, давшей начало D. melanogaster , или это недавно возникшая специализация T. castaneum , важно изучить . mlpt функционируют в других группах насекомых. Поскольку полужесткокрылые, как полуметаболические, составляют сестринскую группу голометаболических насекомых (обзор в Panfilio and Angelini, 2018), функциональная характеристика mlpt в эмерджентной модели полужесткокрылых, клоп-поцелуй Rhodnius prolixus был бы важен (Nunes-da -Фонсека и др. Здесь мы сообщаем об интересных консервативных и новых функциональных аспектах прототипа гена smORF mlpt R. Результаты Недавнее описание нескольких биологически важных генов, кодирующих smORF у многоклеточных животных, открыло новые возможности для исследований в области молекулярной биологии и функциональной геномики (Saghatelian and Couso, 2015; Pueyo et al. Предыдущие поиски BLAST генов, кодирующих пептиды mlpt в отношении различных геномов и транскриптомов членистоногих, показали, что этот ген, содержащий smORF, ограничен насекомыми и ракообразными (Galindo et al., 2007). Увеличение геномных последовательностей в последние годы (Tribolium Genome Sequencing Consortium et al., 2008; Schwager et al., 2017; Panfilio et al., 2019) позволило нам провести полный поиск в доступных геномах членистоногих. Используя нестрогий подход BLAST (подробности см. В методах), мы идентифицировали ортологов mlpt в доступных геномах насекомых (дополнительная таблица 1). Рисунок 1 . mlpt эволюционный анализ и предполагаемая регуляция. (A) Филогенетическое представление распределения mlpt среди видов членистоногих и примерное время видообразования узлов на основе онлайн-сервера TimeTree (Kumar et al., 2017). mlpt полицистронная организация мРНК. Черные линии включают всю полицистронную мРНК, содержащую smORF, кодирующие пептиды, показанные в красных, зеленых и розовых прямоугольниках. (B) Выравнивание ранее описанного небольшого пептида (красные прямоугольники в A ), содержащего домен LDPTG (Savard et al., 2006; Галиндо и др., 2007 г.; Kondo et al., 2007), сохранившийся у нескольких видов членистоногих и у которого количество паралогов в одном полицистронном гене варьирует среди видов членистоногих. Shavenbaby-мл Binding Affinity, Interaction Modes, and Hotspots Predictions Предыдущая работа в D.melanogaster идентифицировал 31 N-концевой остаток фактора транскрипции (TF) Shavenbaby (Svb) как Mlpt-зависимый сигнал деградации, или degron (Zanet et al., 2015). Для исследования способов взаимодействия между пептидами, кодируемыми полицистронной мРНК mlpt , и Svb TF из D. melanogaster (Dmel-Svb) и R. prolixus (Rprol-Svb), были предсказаны трехмерные структуры. с помощью подхода ab initio и анализов стыковки белок-пептид.Во-первых, был проведен исчерпывающий анализ профиля вторичной структуры и неупорядоченных областей аминокислотных последовательностей Dmel-Svb и Rprol-Svb. Рисунок 2 . Прогнозирование взаимодействия Shavenbaby-Mlpts. Анализы стыковки Svbs-Mlpts были основаны на результатах (Zanet et al., 2015) и на анализе предсказания сайтов связывания белков на N-концах Svbs с помощью DISOPRED. Электростатический потенциал представлен на молекулярной поверхности Dmel-Svb (A,D,E,G,H) , Dmel-Mlpt1 (E,F) , Dmel-Mlpt4 (H,I) , Rprol -Svb (D,J,M,N,P,Q) , Rprol-Mlpt1 (N,O) , Rprol-Mlpt2 (Q,R) , с отрицательными значениями (-10 кэВ) в красном , нейтральное — белым, положительные значения (+10 кэВ) — синим. Анализы стыковки были сосредоточены на предсказанных сайтах связывания белка на N-конце Svb. Наши результаты показывают, что по крайней мере половина остатков мотивов LDPTG(L/Q/T)Y из пептидов Mlpts участвует в комплексообразовании (дополнительная таблица 2). mlpt первоначально была описана у жука T. castaneum и характеризовалась очень динамичным формированием паттерна (Savard et al., 2006). У D. melanogaster экспрессия mlpt коррелировала со складками тканей, действуя как связь между формированием паттерна и морфогенезом (Galindo et al., 2007). Ранняя экспрессия D. melanogaster mlpt начинается с семи полосок бластодермы и скопления клеток в передней части эмбриона, хотя сегментация не затрагивается у мутантов mlpt (Galindo et al., 2007). Позже, после сегментации, mlpt присутствуют в трахее, задних дыхальцах, глотке, задней кишке и презумптивных зубчатых поясках. Мутанты D. melanogaster mlpt демонстрируют редуцированные кутикулярные структуры, а эктопическая экспрессия mlpt в голове индуцирует дополнительные компоненты скелета (Galindo et al. Для исследования экспрессии mlpt в R. prolixus во время эмбриогенеза была проведена гибридизация in situ нескольких эмбриональных стадий.Исходные данные экспрессии Rp-mlpt с использованием колориметрического субстрата и окрашивания DAPI представлены на дополнительной фигуре 5, а для простоты наложенные изображения экспрессии псевдофлуоресценции и окрашивания DAPI представлены на фигуре 3. Rp-mlpt отчетливая экспрессия может наблюдаться на стадии 1B, между 6 и 12 часами после откладки яиц (AEL), в переднем домене (рис. 3A), который соответствует предполагаемым долям головы, за которым следует появление заднего домена экспрессии незадолго до задняя инвагинация на стадии 2A (рис. Рисунок 3 . Экспрессия mlpt во время эмбриогенеза R. prolixus . Передняя часть яйца слева на всех панелях.При процессах анатрепсиса и кататрепсиса ориентация эмбриона смещается вдоль передне-задней и DV-осей (подробнее см. Nunes-da-Fonseca et al., 2017 и Berni et al., 2014). Выражение mlpt отображается искусственным красным цветом, а DAPI — синим. Чтобы выяснить, изменяются ли уровни экспрессии mlpt в ходе эмбрионального развития, мы исследовали его экспрессию с помощью ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Небольшие изменения экспрессии Rp-mlpt наблюдались между неоплодотворенными (0–6 ч NF) и ранними оплодотворенными яйцами (0–6 ч AEL), в то время как 10-кратное увеличение экспрессии было обнаружено при анализе 36– 48-часовые яйца AEL (дополнительная фигура 6A). Поскольку ген Rp-mlpt демонстрирует сложный паттерн экспрессии во время эмбриогенеза, мы попытались проанализировать его функцию с помощью родительской РНК-интерференции (pRNAi) в R. prolixus , как описано ранее (Berni et al., 2014). В этом методе самкам вводят двухцепочечную (дцРНК), синтезированную против интересующего гена, и оценивают фенотипические эффекты у потомства. Яйца Rp-mlpt дцРНК показали снижение до 60–70% экспрессии Rp-mlpt по сравнению с его экспрессией в контрольной группе дцРНК, что подтверждает нокдаун (дополнительная фигура 6B). Увеличение концентрации дцРНК Rp-mlpt при инъекции до шести микрограммов на микролитр (6 мкг/мкл) не приводило к дальнейшему увеличению эффективности нокдауна (данные не показаны). После сбора и фиксации яиц было выполнено ядерное окрашивание DAPI, и было обнаружено множество эмбриональных мутантных фенотипов. Первый фенотипический класс эмбрионов Rp-mlpt RNAi включает эмбрионы с числом сегментов дикого типа, но со слиянием грудных или гнатальных сегментов. Эмбрионы с такой морфологией были видны на стадиях 5 и 7 (рис. 4B, B’, C, C’). Второй фенотипический класс состоял из эмбрионов с четырьмя парами ног в РНКи Rp-mlpt вместо трех пар, наблюдаемых в контроле (рис. 4E,E’).Наконец, третий фенотипический класс эмбрионов Rp-mlpt RNAi показал неправильную удлиненность зародышевых полос и отсутствие задней области на стадии 3 (рис. 4A, A’), что более очевидно на стадии 9, когда отсутствует брюшная сегментация. наблюдались сросшиеся ноги (рис. 4D, D′). Рисунок 4 . mlpt Дефекты сегментации с нокдауном. Окрашивание DAPI контрольных и mlpt эмбрионов РНКи. Передняя область яйца слева на всех панелях. Эти фенотипические классы также можно наблюдать при вскрытии эмбрионов на очень поздних стадиях, когда окрашивание ядер DAPI невозможно из-за образования кутикулы (рис. Рисунок 5 . Интересно, что введение дцРНК Rp-mlpt в более низких концентрациях (до 1 мкг/мкл) самкам R. prolixus приводит к небольшому проценту нимф, способных покидать яичную скорлупу (10–15%). .Некоторые из этих нимф Rp-mlpt dsRNA обнаруживают одностороннее сегментарное слияние первого и второго грудных сегментов, приводящее к аномальной морфологии дистальных отделов ног (Рис. 6A,B). Дистальные области ног R. prolixus дикого типа состоят из стереотипного рисунка большеберцовой кости, предплюсны и пары когтей (рис. 6А). dsRNA Rp-mlpt нимфы демонстрируют неправильное затемнение кутикулы и различные типы отклонений ног от паттерна дикого типа, включая отсутствие надлежащего различия между лапкой и когтями (Рисунки 6B′, B″).В целом, наши результаты показывают, что Rp-mlpt важен для различения грудных и брюшных сегментов, для процесса удлинения зародышевых полос и формирования паттерна дистальных отделов ног. Рисунок 6 . Снижение экспрессии Rp-mlpt повлияло на формирование сегмента с четкими фенотипическими эффектами в грудной клетке и брюшной полости, перед задней инвагинацией и на более поздних стадиях сегментации (рис. Рисунок 7 . Слияние сегментов и экспрессия гена Hox у эмбрионов с нокдауном mlpt и других генов развития. (A) Гибридизация in situ для hedgehog ( hh ) и контрастное окрашивание ядер с помощью DAPI для контроля (ctrl) слева и прогрессирующие более сильные фенотипы mlpt dsRNA слева направо.Желтые стрелки указывают на явные сегментарные слияния в грудном отделе. В самом сильном фенотипе (самый правый) поражена головка (звездочка), а удлинение зародышевой полосы не происходит. (A ‘ ) На стадии 9 один контрольный (ctrl) один сильно поражен mlpt эмбриона дцРНК, демонстрируя сегментацию и дефекты головки. Сравнение нокдаун-фенотиповmlpt и других генов развития Предыдущий функциональный анализ mlpt у T. castaneum и D. melanogaster показал, что этот ген необходим для раннего формирования паттерна у жуков, но не у плодовых мушек. У жуков mlpt действует как гэп-ген, в то время как его роль у дрозофил ограничивается более поздними (постсегментарными) эмбриональными стадиями (Savard et al., 2006; Галиндо и др., 2007 г.; Кондо и др., 2007, 2010; Рэй и др., 2019). Недавний анализ функции mlpt у двух других видов полужесткокрылых и у осы показал потребность в ранних процессах формирования паттерна, предполагая, что это наследственная функция гена (Ray et al., 2019). Из нашего фенотипического анализа остается открытым вопрос о том, приводит ли нокдаун Rp-mlpt к аналогичным морфологическим изменениям, что и нокдаун классических генов gap, факторов транскрипции Круппеля (Kr), гигантского ( gt ) и горбатого. Экспрессию гена Hox Ultrabithorax ( Ubx) также оценивали в контроле и в нокдаунах mlpt и других генов гэпа. У контрольных эмбрионов R. prolixus Ubx сильно экспрессируется в первом сегменте брюшка и в концентрических кольцах вокруг третьей ноги (L3) (рис. 7С).Как описано ранее, эффект mlpt RNAi может генерировать по крайней мере три класса эмбриональных фенотипов. Наконец, был проведен морфологический анализ нокдауна партнера по взаимодействию mlpt , фактора транскрипции svb (Kondo et al., 2010; Ray et al., 2019). Как недавно продемонстрировали Ray et al. (2019) у двух видов полужесткокрылых, mlpt и svb , фенотипы RNAi кажутся удивительно сходными. Как и в случае mlpt РНКи, svb РНКи также не обнаруживали каких-либо изменений в характере экспрессии pb или Ubx , хотя удлинение зародышевой полосы и различие между грудным ибрюшная сегментация была явно затронута (рис. 7C). ОбсуждениеАнализ последовательности нуклеотидов и пептидовдает представление об эволюции функции генаmlpt В последние годы гены, кодирующие smORF, были охарактеризованы как новые и важные игроки неизвестной части геномов животных (Saghatelian and Couso, 2015; Zanet et al. Предыдущие анализы выявили специфические роли коротких пептидов mlpt , содержащих мотивы LDPTG(L/Q/T)Y, у насекомых D. melanogaster , в то время как функция второго слабоконсервативного предсказанного пептида (ORF-B в Galindo et al. ., 2007), остается открытым, поскольку не переведен в D.melanogaster и функционально не требуется в экспериментах по спасению (Galindo et al., 2007; Kondo et al., 2007). Механически небольшие пептиды из mlpt , содержащие мотивы LDPTG(L/Q/T)Y, необходимы для селективного протеасом-опосредованного N-концевого процессинга и активации транскрипционного фактора svb (Kondo et al., 2010; Zanet et al. Насколько нам известно, это первое исследование, предоставляющее теоретическую модель взаимодействия комплексов Svb-Mlpt для D. melanogaster (Dmel) и R. prolixus (Rprol). Наши прогнозы смогли зафиксировать ранее опубликованные данные для D.melanogaster (Zanet et al., 2015), даже при отсутствии экспериментально подтвержденных трехмерных структур из D. Сохранениеmlpt Экспрессия среди насекомых Анализ гибридизации in situ гена Rp-mlpt во время эмбрионального развития показывает сложную модель пространственной экспрессии, сходную с ранее описанными моделями экспрессии у жуков, дрозофил и других голометаболических насекомых (Savard et al., 2006; Galindo et al., 2007; Cao et al., 2018; Jimenez-Guri et al., 2018; Zhu et al., 2018; Ray et al., 2019). Большинство различий в экспрессии наблюдается на ранних стадиях развития.У D. melanogaster экспрессия происходит в виде семи бластодермальных полосок, образующих парные правила, в то время как у большинства других видов насекомых, включая базально ветвящихся двукрылых мошек Clogmia albipunctata , экспрессия проявляется в виде щелевого домена (Jiménez-Guri). Сравнение экспрессии Rp-mlpt с помощью ОТ-ПЦР между оплодотворенными и неоплодотворенными яйцами в течение первых часов развития (0–6 ч AEL) и 36–48 AEL показывает в 10 раз более высокую экспрессию на более поздних стадиях по сравнению со свежими яйцами. Три фенотипических класса наблюдались у mlpt нокдаунных эмбрионов, в основном влияющих на формирование сегментов (рис. 4, 5). Сравнение морфологических дефектов эмбрионов с нокдауном mlpt с дефектами нокдаунов гена пробела фактора транскрипции, таких как Kr, Hb и Gt (рис. Рисунок 8 . Сравнение функции mlpt у R. prolixus и других видов насекомых. (A,A ‘ ) В R. prolixus mlpt требуется для правильной спецификации грудных и брюшных сегментов, формирования рисунка дистальных структур ног и формирования головы у сильно пораженных эмбрионов. Наконец, после Rp-mlpt RNAi наблюдалось несколько дистальных дупликаций сегментов ног и пороков развития ног (рис. 6). В то время как некоторые дефекты ног могут быть связаны со слиянием грудного сегмента, по крайней мере, некоторые примеры дистальных удвоений, вероятно, вызваны локальными эффектами Rp-mlpt в ногах. Мы не обнаружили множественных колец экспрессии Rp-mlpt в R.проликсус ; однако такие кольца наблюдались у Periplaneta , а также у других видов полужесткокрылых (Chesebro, 2013). Таким образом, наши данные согласуются с моделью, согласно которой mlpt требуется на ранних стадиях развития R. prolixus для различия между грудной и брюшной сегментацией, во время удлинения зародышевой полосы и для формирования головы (рис. Материалы и методыБиоинформатический анализПептидные последовательности Mlpt из D. Структурное моделирование и анализы стыковки Shavenbaby-mlpts Трехмерные модели Dmel-Svb (1351 а.о.; Uniprot: P51521-1) и Rprol-Svb (834 а.о.; VectorBase: GECK01059228) были предсказаны путем моделирования ab initio с использованием программы I-Tasser (Yang et al., 2015). Трехмерные структуры Mlpts (Dmel-pptd1 и 4) были предсказаны с помощью CABS-dock (Kurcinski et al., 2015) и I-Tasser соответственно; Rprol-pptd1 и 2, оба через CABS-док. Выращивание, фиксация и вскрытие насекомыхВыращивание насекомых проводилось, как описано Souza-Ferreira et al. (2014). Примерно через 1 неделю после кормления кровью ежедневно собирали яйца и фиксировали их на разных стадиях развития.Для фиксации до 100 яиц кратковременно промывали дистиллированной водой для удаления дебриса, а затем переносили в микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл дистиллированной воды. Данную микропробирку выдерживали 90 с в кипящей воде, после чего воду заменяли 1 мл 12% параформальдегида (PBS) и фиксировали 1 ч (6–8°С). Затем эмбрионы инкубировали с 1 мл параформальдегида 4%, содержащего 0,1% Tween 20, при перемешивании (200 об/мин) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем яйца повторно промывали PBST (PBS 1X, Tween 200.1%). Для длительного хранения эмбрионы постепенно переносили в 100%-ный этанол и затем хранили при температуре -20°С. Для рассечения использовали два щипца (Dumont № 5). Яйцо удерживается с помощью одного из них, а другой используется для оказания давления на ободок хориона для удаления крышки. Хорионический ободок удерживается, а оболочка вскрывается поперечно, что приводит к освобождению эмбриона. На более поздних стадиях, когда сегментация завершена, по крайней мере на стадии 6, желток легко удаляется либо с помощью тонкого щипца, либо стеклянной иглы, не повреждая зародыш. In situ Гибридизация, окрашивание ядер и антителЭмбрионы, хранившиеся в 100% этаноле при -20°C, постепенно переносили в PBST при комнатной температуре. Гибридизацию in situ и синтез зонда проводили, как описано (Sachs et al., 2015), включая обработку протеиназой К. Окрашивание DAPI (4′,6-диамидин-2′-фенилиндола дигидрохлорид, SIGMA) проводили, как в Berni et al. (2014). Окрашивание антителами проводили по протоколу, описанному Santos et al.(2013). Все изображения были получены с помощью стереоскопа Leica M205, обработаны и проанализированы с помощью программного обеспечения Leica Application Suite Advanced Fluorescence Version 0.4 (LAS AF v4 — Leica Microsystems). Изображения собирали, и гибридизационное окрашивание in situ (NBT/BCIP) преобразовывали в ложную флуоресценцию, как описано в Benton et al. (2016). РНК-интерференция и ПЦР в реальном времениРНК-интерференцию (РНКи) проводили аналогично Berni et al. (2014), используя неродственную дцРНК в качестве контроля (неомицин дцРНК-дцнео).Для Rp-mlpt два неперекрывающихся ПЦР-фрагмента, содержащих сайты инициации промотора Т7 на обоих концах, использовали в качестве матриц для синтеза дцРНК с использованием набора Ambion T7 Megascript (кат. № AM1334). Количество и целостность образцов дцРНК измеряли с помощью спектрофотометрии и электрофореза в агарозном геле соответственно. Для каждого молчащего гена вводили от 6 до 12 мкг дцРНК. Количественную оценку эффективности РНКи и сравнение экспрессии генов после молчания измеряли с помощью ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР), как это было выполнено Berni et al.(2014), используя ген фактора элонгации-1 (Ef1) в качестве эндогенного эталонного гена. Номера доступа к банку генов или базе векторов для генов, проанализированных с помощью гибридизации in situ или ОТ-ПЦР, представлены в дополнительной таблице 4. Для анализа ОТ-ПЦР РНК экстрагировали в биологических тройных повторах из яиц в соответствующие часы после откладки яиц ( АЭЛ). Для анализа использовали оплодотворенные яйца (0–6 и 36–48 ч AEL) и неоплодотворенные яйца, полученные от самок-девственниц (0–6 ч AEL). Заявление о доступности данныхНаборы данных, созданные для этого исследования, можно найти в NCBI. Вклад авторовVT-S, DG-A, FM, LR, MB, HA, CL, NF, JS-M, EP и RN: генерация и интерпретация экспериментальных данных. HA, CL и RN: привлечение финансирования. ВТ-С и РН: черновик рукописи. ФинансированиеRN был поддержан CNPq (307952/2017-7 и 431354/2016-2) и FAPERJ (E-26/210-150/2016 и E-26/203.298/2016). VT-S и DG-A были магистрантами PPG-PRODBIO-Macaé (стипендии CAPES), MB и доктором философии. студент PPG-PCM-ICB-UFRJ, а LR был постдоком со стипендией CAPES Национального института молекулярной энтомологии / CNPq (INCT-EM). Конфликт интересовАвторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов. БлагодарностиАвторы благодарят Роланда Зимма за полезные предложения в рукописи. Дополнительный материалДополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2019.00379/полный#дополнительный материал Каталожные номераАль Хайек, С., Алсавади, А., Камбрис, З., Бокете, Ж.-П., Боэр, Дж., Ронсин, Б., и др. (2019). Изоформы белка Shavenbaby управляют самообновлением по сравнению с дифференцировкой стволовых клеток кишечника дрозофилы. биоРксив . дои: 10.1101/627554 Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., et al. (1997). Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска белковых баз данных. Рез. нуклеиновых кислот. 25, 3389–3402. doi: 10.1093/нар/25.17.3389 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Aspden, J.L., Eyre-Walker, Y.C., Phillips, R.J., Amin, U., Mumtaz, M.A., Brocard, M., et al. (2014). Обширный перевод небольших открытых рамок считывания, обнаруженных Poly-Ribo-Seq. eLife 3:e03528. doi: 10.7554/eLife.03528 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Ауман, Т., Вриде, Б.М.И., Вайс А., Хестер С.Д., Уильямс Т.А., Наги Л.М. и соавт. (2017). Динамика формирования зон роста у молочая Oncopeltus fasciatus . Развитие 144, 1896–1905 гг. doi: 10.1242/dev.142091 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Азуара, К., Линдал, Э., Коэль, П., Орланд, Х., и Деларю, М. (2006). PDB_Hydro: включение диполярных растворителей с переменной плотностью в обработку Пуассона-Больцмана электростатики макромолекул. Рез. нуклеиновых кислот. 34, W38–42. doi: 10.1093/нар/gkl072 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Бентон, Массачусетс (2018). Пересмотренное понимание морфогенеза Tribolium дополнительно примиряет короткое и длинное развитие зародыша. PLoS Биол. 16:e2005093. doi: 10.1371/journal.pbio.2005093 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Бентон, М. А., Пехманн, М., Фрей, Н., Стапперт, Д., Конрадс, К.Х., Чен, Ю.Т. и соавт. (2016). Гены Toll играют наследственную роль в удлинении оси. Курс. биол. 26, 1609–1615. doi: 10.1016/j.cub.2016.04.055 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Берни, М., Фонтенеле, М. Р., Тобиас-Сантос, В., Касерес-Родригес, А., Мури, Ф. Б., Вионетт-ду-Амарал, Р., и соавт. (2014). Сигналы Toll регулируют формирование дорсально-вентрального паттерна и передне-заднее размещение эмбриона у полужесткокрылых Rhodnius prolixus . Еводево 5:38. дои: 10.1186/2041-9139-5-38 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Бхаттачарья Д., Новотны Дж., Цао Р. и Ченг Дж. (2016). 3Drefine: интерактивный веб-сервер для эффективного уточнения структуры белка. Рез. нуклеиновых кислот. 44, W406–W409. дои: 10.1093/нар/gkw336 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Брито Т., Хулио А., Берни М., де Кастро Понсио Л., Бернардес Э.С., Араужо Х. и др. (2018). Транскриптомный и функциональный анализ пути piRNA в переносчике болезни Шагаса Rhodnius prolixus . PLoS Negl Trop Dis 12:e0006760. doi: 10.1371/journal.pntd.0006760 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Цао Г., Гонг Ю., Ху Х., Чжу М., Лян З., Хуанг Л. и др. (2018). Идентификация бестарзальных пептидов тутового шелкопряда Bombyx mori. Заяв. микробиол. Биотехнолог. 102, 1809–1822 гг.doi: 10.1007/s00253-017-8708-4 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Цао, Р., Бхаттачарья, Д., Хоу, Дж., и Ченг, Дж. (2016). DeepQA: улучшение оценки качества модели одного белка с помощью сетей глубокого доверия. Биоинформатика BMC 17:495. doi: 10.1186/s12859-016-1405-y Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Чанут-Делаланд, Х., Хашимото, Ю., Пелисье-Монье, А., Спокони, Р., Диб, А., Кондо Т. и др. (2014). Pri-пептиды являются медиаторами экдизона для временного контроля развития. Нац. Клеточная биол. 16, 1035–1044. дои: 10.1038/ncb3052 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Chen, V.B., Arendall, W.B. III., Headd, J.J., Keedy, D.A., Immormino, R.M., Kapral, G.J., et al. (2010). MolProbity: проверка структуры всех атомов для макромолекулярной кристаллографии. Acta Crystallogr D Biol. Кристаллогр. 66, 12–21.дои: 10.1107/S0490 73Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Чесебро, Дж. (2013). Механизмы сегментации американского таракана, Periplaneta americana (Докторская диссертация, PhD). Сассекс: Университет Сассекса. Академия Google Долински, Т.Дж., Нильсен, Дж.Е., Маккаммон, Дж.А., и Бейкер, Н.А. (2004). PDB2PQR: автоматизированный конвейер для настройки электростатических расчетов Пуассона-Больцмана. Рез. нуклеиновых кислот. 32, W665–W667. doi: 10.1093/nar/gkh481 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Айзенберг Д., Люти Р. и Боуи Дж. У. (1997). VERIFY3D: оценка моделей белков с трехмерными профилями. Методы Фермент. 277, 396–404. doi: 10.1016/S0076-6879(97)77022-8 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Галиндо, М.И., Пуэйо, Дж.И., Фуикс, С., Бишоп, С.А., и Кузо, Дж.П. (2007). Пептиды, кодируемые короткими ORF, контролируют развитие и определяют новое семейство эукариотических генов. PLoS Биол. 5:e106. doi: 10.1371/journal.pbio.0050106 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Жиль, А.Ф., Шинко, Дж.Б., и Авероф, М. (2015). Эффективное нацеливание генов с помощью CRISPR и замена трансгенов у жука Tribolium castaneum . Разработка 142, 2832–2839. doi: 10.1242/dev.125054 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Хэнсон Дж., Ян Ю., Паливал К.и Чжоу Ю. (2017). Улучшение прогнозирования белковых расстройств с помощью рекуррентных нейронных сетей с глубокой двунаправленной длинной краткосрочной памятью. Биоинформатика 33, 685–692. doi: 10.1093/биоинформатика/btw678 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Хео, Л., Ли, Х., и Сок, К. (2016). GalaxyRefineComplex: уточнение структур модели белково-белкового комплекса за счет переупаковки интерфейса. Науч. Респ. 6:32153. дои: 10.1038/srep32153 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Хименес-Гури, Э., Уоттон, К.Р., и Джагер, Дж. (2018). tarsal-less экспрессируется как ген gap, но не имеет фенотипа гена gap у мотылька Clogmia albipunctata. Р. Соц. Открытая наука. 5:180458. doi: 10.1098/rsos.180458 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Джонс, Д. Т., и Коццетто, Д. (2015). DISOPRED3: точное предсказание неупорядоченной области с аннотированной активностью связывания белка. Биоинформатика 31, 857–63. doi: 10.1093/биоинформатика/btu744 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Кондо, Т., Хашимото Ю., Като К., Инагаки С., Хаяши С. и Кагеяма Ю. (2007). Малые пептидные регуляторы актинового морфогенеза клеток, кодируемые полицистронной мРНК. Нац. Клеточная биол. 9, 660–665. дои: 10.1038/ncb1595 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Кондо, Т., Плаза, С., Занет, Дж., Бенраба, Э., Валенти, П., Хашимото, Ю., и другие. (2010). Малые пептиды переключают транскрипционную активность Shavenbaby во время эмбриогенеза дрозофилы. Наука 329, 336–339. doi: 10.1126/science.1188158 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Кумар, С., Стечер, Г., Сулески, М., и Хеджес, С. Б. (2017). TimeTree: ресурс для временных шкал, временных деревьев и времени расхождения. Мол. биол. Эвол. 34, 1812–1819 гг. doi: 10.1093/molbev/msx116 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Курчинский М., Ямроз М., Блащик М., Колинский А. и Кмечик С.(2015). Веб-сервер CABS-dock для гибкой стыковки пептидов с белками без предварительного знания сайта связывания. Рез. нуклеиновых кислот. 43, W419–W424. doi: 10.1093/нар/gkv456 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Ладукакис, Э., Перейра, В., Маньи, Э. Г., Эйр-Уокер, А., и Кузо, Дж. П. (2011). Сотни предположительно функциональных маленьких открытых рамок для чтения у дрозофилы. Геном Биол. 12:R118. doi: 10.1186/gb-2011-12-11-r118 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Ласковски, Р.А., Яблонска Дж., Правда Л., Варекова Р.С. и Торнтон Дж.М. (2018). PDBsum: структурные сводки записей PDB. Науки о белках. 27, 129–134. doi: 10.1002/pro.3289 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Лавор, А., Эспонда-Беренс, Н., Пагола, Л., и Ривера-Помар, Р. (2014). Гэп-ген Круппеля Rhodnius prolixus необходим для сегментации и для репрессии гомеозисного гена, редуцированного по половому признаку. Дев. биол. 387, 121–129. doi: 10.1016/j.ydbio.2013.12.030 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Лавор, А., Пагола, Л., Эспонда-Беренс, Н., и Ривера-Помар, Р. (2012). Гигантский ген разрыва Rhodnius prolixus экспрессируется по материнской линии и необходим для правильного формирования головы и брюшка. Дев. биол. 361, 147–155. doi: 10.1016/j.ydbio.2011.06.038 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Маньи, Э.Г., Пуэйо, Дж.И., Перл, Ф.М., Сеспедес, М.А., Нивен, Дж.Е., Бишоп, С.А., и соавт. (2013). Консервативная регуляция поглощения сердечного кальция пептидами, закодированными в небольших открытых рамках считывания. Наука 341, 1116–1120. doi: 10.1126/science.1238802 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Маршан, А., Мугель, Ф., Мендонса, В., Квартье, М., Жакен-Жоли, Э., да Роса, Дж. А., и соавт. (2016). Сравнение стратегий сборки транскриптома de novo и референтной путем применения их к кровососущему жуку Rhodnius prolixus . Биохимия насекомых. Мол. биол. 69, 25–33. doi: 10.1016/j.ibmb.2015.05.009 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Медейрос, М.Н., Логулло, Р., Рамос, И.Б., Соргин, М.Х., Пайва-Силва, Г.О., Мескита, Р.Д., и соавт. (2011). Транскриптом и профиль экспрессии генов ткани фолликула яичника триатомового клопа Rhodnius prolixus . Биохимия насекомых. Мол. биол. 41, 823–831. doi: 10.1016/j.ibmb.2011.06.004 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Мейрелеш, Л.М., Дёмлинг, А.С., и Камачо, К.Дж. (2010). ANCHOR: веб-сервер и база данных для анализа карманов связывания белок-белкового взаимодействия для обнаружения лекарств. Рез. нуклеиновых кислот. 38, W407–W411. doi: 10.1093/nar/gkq502 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Мескита, Р. Д., Вионетт-Амарал, Р. Дж., Ловенбергер, К., Ривера-Помар, Р., Монтейро, Ф. А., Минкс, П., и др. (2015). Геном Rhodnius prolixus , насекомого-переносчика болезни Шагаса, обнаруживает уникальные приспособления к гематофагии и заражению паразитами. Проц. Натл. акад. науч. США 112, 14936–14941. doi: 10.1073/pnas.1506226112 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Мирабелло, К., и Полластри, Г. (2013). Портер, PaleAle 4.0: высокоточное предсказание вторичной структуры белка и относительной доступности растворителя. Биоинформатика 29, 2056–2058. doi: 10.1093/биоинформатика/btt344 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Моал, И.Х., Хименес-Гарсия, Б., и Фернандес-Ресио, Дж. (2015). Веб-сервер CCharPPI: вычислительная характеристика белок-белковых взаимодействий по структуре. Биоинформатика 31, 123–125. doi: 10.1093/биоинформатика/btu594 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Нуньес-да-Фонсека Р., Берни М., Тобиас-Сантос В., Пане А. и Араужо Х.М. (2017). Rhodnius prolixus : от классической физиологии к современной биологии развития. Бытие 55, 1–11.doi: 10.1002/dvg.22995 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Паезе, К.Л.Б., Шенауэр, А., Лейте, Д.Дж., Рассел, С., и МакГрегор, А.П. (2018). Ген SoxB действует как ген переднего разрыва и регулирует добавление заднего сегмента у паука. eLife 7:e37567. doi: 10.7554/eLife.37567 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Панфилио, К.А., и Анджелини, Д.Р. (2018). На суше, в воздухе и на море: разнообразие полужесткокрылых через призму генома. Курс. мнение наук о насекомых. 25, 106–115. doi: 10.1016/j.cois.2017.12.005 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Панфилио, К. А., Варгас Дженцш, И. М., Бенуа, Дж. Б., Эрезилмаз, Д., Судзуки, Ю., Колелла, С., и др. (2019). Молекулярно-эволюционные тенденции и диверсификация экологии питания у Hemiptera, закрепленные геномом молочая. Геном Биол. 20:64. doi: 10.1186/s13059-019-1660-0 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Петтерсен, Э.F., Goddard, T.D., Huang, C.C., Couch, G.S., Greenblatt, D.M., Meng, E.C., et al. (2004). UCSF Chimera — система визуализации для поисковых исследований и анализа. Дж. Вычисл. хим. 25, 1605–1612. doi: 10.1002/jcc.20084 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Пуэйо, Дж. И., и Кузо, Дж. П. (2011). Пептиды без предплюсны контролируют передачу сигналов Notch через фактор транскрипции Shavenbaby. Дев. биол. 355, 183–193. дои: 10.1016/j.ydbio.2011.03.033 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Пуэйо, Дж. И., Магни, Э. Г., Сэмпсон, С. Дж., Амин, У., Эванс, И. Р., Бишоп, С. А., и соавт. (2016б). Гемотин, регулятор фагоцитоза, кодируемый небольшой ORF и сохраняющийся у многоклеточных животных. PLoS Биол. 14:e1002395. doi: 10.1371/journal.pbio.1002395 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Рэй, С., Розенберг, М. И., Чанут-Делаланд, Х., Decaras, A., Schwertner, B., Toubiana, W., et al. (2019). Модуль mlpt/Ubr3/Svb содержит древний онтогенетический переключатель для формирования эмбрионального паттерна. eLife 8:e39748. doi: 10.7554/eLife.39748 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Ribeiro, J.M., Genta, F.A., Sorgine, M.H., Logullo, R., Mesquita, R.D., Paiva-Silva, G.O., et al. (2014). Изучение транскриптома пищеварительного тракта кровососущего клопа Rhodnius prolixus . PLoS Негл. Троп. Дис. 8:e2594. doi: 10.1371/journal.pntd.0002594 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Sachs, L., Chen, Y.T., Drechsler, A., Lynch, J.A., Panfilio, K.A., Lässig, M., et al. (2015). Динамическая передача сигналов BMP, поляризованная Toll, формирует дорсовентральную ось у насекомого с гемиметаболизмом. eLife 4:e05502. doi: 10.7554/eLife.05502 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Сантос, В.T., Ribeiro, L., Fraga, A., de Barros, C.M., Campos, E., Moraes, J., et al. (2013). Эмбриогенез клеща Rhipicephalus (Boophilus) microplus: создание новой модельной системы хелицератов. Бытие 51, 803–818. doi: 10.1002/dvg.22717 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Савар, Дж., Маркес-Соуза, Х., Аранда, М., и Таутц, Д. (2006). Ген сегментации триболия продуцирует полицистронную мРНК, которая кодирует несколько консервативных пептидов. Сотовый 126, 559–569. doi: 10.1016/j.cell.2006.05.053 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Schwager, E.E., Sharma, P.P., Clarke, T., Leite, D.J., Wierschin, T., Pechmann, M., et al. (2017). Геном домашнего паука обнаруживает древнюю дупликацию всего генома во время эволюции паукообразных. БМС Биол. 15:62. doi: 10.1186/s12915-017-0399-x Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Соуза-Феррейра, П.С., Морейра, М.Ф., Ателла, Г.К., Оливейра-Карвалью, А.Л., Эйземберг, Р., Майерович, Д., и соавт. (2014). Молекулярная характеристика эмбриональной кутикулы Rhodnius prolixus ‘. Биохимия насекомых. Мол. биол. 51, 89–100. doi: 10.1016/j.ibmb.2013.12.005 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Сухвал, А., и Соудхамини, Р. (2015). PPCheck: веб-сервер для количественного анализа межбелковых интерфейсов и прогнозирования горячих точек остатков. Биоинформ Биол. Выводы 9, 141–151. doi: 10.4137/BBI.S25928 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Консорциум по секвенированию генома Tribolium, Richards, S., Gibbs, R.A., Weinstock, G.M., Brown, S.J., Denell, R., et al. (2008). Геном модельного жука-вредителя Tribolium castaneum . Природа 452, 949–955. doi: 10.1038/nature06784 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Унни, С., Huang, Y., Hanson, R.M., Tobias, M., Krishnan, S., Li, W.W., et al. (2011). Веб-серверы и сервисы для расчетов электростатики с помощью APBS и PDB2PQR. Дж. Вычисл. хим. 32, 1488–1491. doi: 10.1002/jcc.21720 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Узиела, К., Менендес Уртадо, Д., Шу, Н., Валлнер, Б., и Элофссон, А. (2017). ProQ3D: улучшена оценка качества модели с помощью глубокого обучения. Биоинформатика 33, 1578–1580.doi: 10.1093/биоинформатика/btw819 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google van Zundert, G.C.P., Rodrigues, J.P.G.L.M., Trellet, M., Schmitz, C., Kastritis, P.L., Karaca, E., et al. (2016). Веб-сервер HADDOCK2.2: удобное интегративное моделирование биомолекулярных комплексов. Дж. Мол. биол. 428, 720–725. doi: 10.1016/j.jmb.2015.09.014 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Венг Г., Ван Э., Wang, Z., Liu, H., Zhu, F., Li, D., et al. (2019). HawkDock: веб-сервер для прогнозирования и анализа белково-белкового комплекса на основе вычислительной стыковки и MM/GBSA. Рез. нуклеиновых кислот. 47, W322–W330. doi: 10.1093/nar/gkz397 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Видерштейн, М., и Сиппл, М.Дж. (2007). ProSA-web: интерактивный веб-сервис для распознавания ошибок в трехмерных структурах белков. Рез. нуклеиновых кислот. 35, W407–W410. doi: 10.1093/nar/gkm290 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Сюн П., Чжан К., Чжэн В. и Чжан Ю. (2017). BindProfX: оценка изменения аффинности связывания, вызванного мутацией, с помощью профилей интерфейса белка с псевдосчетчиками. Дж. Мол. биол. 429, 426–434. doi: 10.1016/j.jmb.2016.11.022 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Сюй Д. и Чжан Ю. (2011). Улучшение физического реализма и структурной точности моделей белков за счет двухэтапной минимизации энергии на атомном уровне. Биофиз. J. 101, 2525–2534. doi: 10.1016/j.bpj.2011.10.024 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Сюэ, Л. К., Родригес, Дж. П., Кастритис, П. Л., Бонвин, А. М., и Вангоне, А. (2016). PRODIGY: веб-сервер для прогнозирования аффинности связывания белково-белковых комплексов. Биоинформатика 32, 3676–3678. doi: 10.1093/биоинформатика/btw514 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Ян, Дж., Ян Р., Рой А., Сюй Д., Пуассон Дж. и Чжан Ю. (2015). I-TASSER Suite: предсказание структуры и функции белка. Нац. Методы 12, 7–8. doi: 10.1038/nmeth.3213 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Zanet, J., Benrabah, E., Li, T., Pélissier-Monier, A., Chanut-Delalande, H., Ronsin, B., et al. (2015). Пептиды Pri sORF индуцируют селективный процессинг белков, опосредованный протеасомами. Наука 349, 1356–1358. doi: 10.1126/наука.аас5677 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Занет, Дж., Чанут-Делаланд, Х., Плаза, С., и Пайр, Ф. (2016). Малые пептиды как новички в контроле развития дрозофилы. Курс. Вверх. Дев. биол. 117, 199–219. doi: 10.1016/bs.ctdb.2015.11.004 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Чжан Дж., Лян Ю. и Чжан Ю. (2011). Уточнение структуры белка на атомном уровне с использованием выборки конформации методом молекулярной динамики на основе фрагментов. Структура 19, 1784–1795 гг. doi: 10.1016/j.str.2011.09.022 Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google Чжу М., Ху Х., Цао Г., Сюэ Р. и Гонг К. (2018). Функции и влияние tal-подобных генов у животных в прикладном аспекте.
| ||||||||||||||||||||||||||||
У сборной Японии отличились Цуэ Шохей, 10 лет, и Ютчиро Накагава, Макото и Такаумт Накано, набравшие по 6 очков каждый.
У Мексики забили Гизелла Мерц (20) и Сира Кастанеда (18). и по 14 от Лизы Маки и Кристин Мейнард. За Японию забил Нодока Хатагути с 8 и 5 у Мики Охазамы и Харуны Канды.
10.2006
blogspot.fi/
Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.
(смОРС) или кОРС (Pueyo et al., 2016a; Chekulaeva, Rajewsky, 2018). smORF, ORF размером менее 100 аминокислот, были описаны как фундаментальные для нескольких процессов развития насекомых (Savard et al., 2006; Галиндо и др., 2007 г.; Kondo et al., 2007), хотя методы предсказания генов, как правило, отбрасывают smORF в полногеномных предсказаниях (обзор в Saghatelian and Couso, 2015). Сравнительный геномный анализ видов дрозофилид показал неожиданную консервативность smORF-содержащих генов, указывая на важную биологическую роль этого нового класса генов (Ladoukakis et al., 2011).
В последние годы прямые доказательства масштабной трансляции smORF были получены с помощью рибосомного профилирования полисомных фракций у Drosophila с использованием техники Poly Ribo-Seq (Aspden et al., 2014). Это исследование позволило классифицировать smORF на две группы: «более длинные» smORF, содержащие около 80 аминокислот, напоминающие канонические белки, в основном содержащие трансмембранные мотивы, и более короткие («карликовые») smORF.Эти «карликовые» smORF обычно короче (длиной около 20 аминокислот), менее консервативны и в основном обнаруживаются в 5′-UTR и некодирующих РНК.
, 2007 г.; Kondo et al., 2007), а совсем недавно — у двукрылых (Jiménez-Guri et al., 2018) и чешуекрылых (Cao et al., 2018). У T. castaneum mlpt действует как гэп-ген во время процесса эмбриональной сегментации, регулируя гены Hox и спецификацию грудной клетки по сравнению с брюшной; нокдаун mlpt приводит к эмбрионам с множественными ногами, mille-pattes по-французски (Savard et al., 2006). В D. melanogaster, tarsal-less (tal) был идентифицирован у спонтанного мутанта с дефектами дистальной части ног, предплюсны (Galindo et al., 2007). Независимо, в том же году было показано, что пептиды полированного риса (Pri) необходимы для организации F-актина во время морфогенеза трихом; эмбрионы, лишенные pri , обнаруживают внешние дефекты кутикулы, напоминающие полированного риса (Kondo et al., 2007). Совсем недавно было показано, что пептиды Mlpt регулируются экдизоном, определяя начало развития эпидермальных трихом, посредством посттрансляционного контроля фактора транскрипции Shavenbaby (Svb) (Chanut-Delalande et al.
, 2014). В целом, пептиды Mlpt демонстрируют контекстно-специфические роли и взаимодействия в различных процессах развития.
, 2017) . Доступные геномные и транскриптомные ресурсы R. prolixus (Medeiros et al., 2011; Ribeiro et al., 2014; Mesquita et al., 2015; Marchant et al., 2016; Brito et al., 2018), установленная эмбриональная стадия система (Berni et al., 2014) и недавняя доступность методов гибридизации in situ и РНК-интерференции являются большими преимуществами этой модельной системы (Nunes-da-Fonseca et al., 2017). Недавно функцию mlpt исследовали у нескольких насекомых, включая два вида полужесткокрылых, водомерку Gerris buenoi (Hemiptera, Gerridae) и молочая Oncopeltus fasciatus (Hemiptera, Lygaeidae) (Ray et al., 2019). Этот анализ предоставил доказательства того, что пептиды Mlpt, ubiquitin-ligase Ubr3 и фактор транскрипции Shavenbaby (Svb), составляют древний онтогенетический модуль, необходимый для раннего формирования паттерна эмбрионов насекомых.
prolixus . Во-первых, анализ последовательности идентифицировал новый специфичный для Hemiptera пептид в полицистронной мРНК mlpt , ген, консервативный во всей кладе Pancrustacean.Во-вторых, анализ молекулярного докинга показывает, что небольшой пептид, содержащий консенсусный мотив LDPTG(L/Q/T)Y, взаимодействует с N-концом транскрипционного фактора Svb, как в D. melanogaster . В-третьих, экспрессия и функциональный анализ показывают, что ортолог mlpt действует во время эмбриональной сегментации, регулируя переход между торакальной и брюшной идентичностью, сходно с его ролью, ранее описанной у T. castaneum . В-четвертых, также наблюдалась законсервированная роль в формировании паттерна предплюсны.В целом, сегментация и паттерн предплюсны сохраняются, а предковые роли mlpt и наши данные свидетельствуют о том, что генерация новых пептидов из smORFs может представлять собой недооцененный механизм эволюции новых генов.
, 2016a; Zanet et al., 2016). Функция mlpt была в значительной степени исследована у насекомых с холометаболом, в то время как о его функции у насекомых с гемиметаболизмом сообщалось только недавно (Ray et al., 2019). В текущей рукописи мы описываем биоинформатический и функциональный анализ функции mlpt у целующегося жука R. prolixus .
Эти ортологи кодируют от двух до нескольких копий пептида из 11–32 аминокислот, содержащего консенсусный мотив LDPTG(L/Q/T)Y (рис. 1А – красные прямоугольники, рис. 1В).Ранее было показано, что эти пептиды опосредуют переключение фактора транскрипции svb с репрессора на активатор (Kondo et al., 2010) посредством убиквитин-конъюгирующего комплекса, UbcD6-Ubr3, и рекрутирования протеасом (Zanet et al. , 2015). Примечательно, что ортологи hemiptera mlpt не только содержат две smORF, кодирующие консенсусный мотив LDPTG(L/Q/T)Y (рис. 1A — красные квадраты), но также содержат более крупную smORF, специфичную для Hemiptera, состоящую примерно из 80 аминокислот (рис. 1A). – зеленые прямоугольники и рисунок 1C).Мы назвали этот новый пептид smHemiptera из-за его ограниченного филогенетического распространения. Интересно, что в транскриптоме R. prolixus пищеварительного тракта был идентифицирован полицистронный транскрипт, содержащий все вышеперечисленные смОРС (Ribeiro et al.
, 2014 и наши собственные наблюдения). Этот пептид, по-видимому, меньше и менее консервативен у видов полужесткокрылых с базальным ветвлением, имеющих около 60 аминокислот в геноме гороховой тли Acyrthosiphon pisum и Pseudococcus longispinus и более 80 аминокислот в триатомах, таких как Rhodnius prolixus . и Triatoma pallidipennis .smHemiptera содержит консервативный участок из 14 аминокислот (GHR(S/N)WMTHLPLSRP) почти у всех производных видов полужесткокрылых с доступными транскриптомами (рис. 1А,С). Единственным исключением является геном молочая O. fasciatus (Panfilio et al., 2019), в котором отсутствует последовательность гена mlpt в текущей сборке. Of — mlpt стенограмма, недавно опубликованная Ray et al. (2019) не содержит smHemiptera. Таким образом, либо O. fasciatus mlpt гена smHemiptera утеряны, либо опубликованная расшифровка неполна.Мы склоняемся к последней возможности, поскольку smHemiptera также присутствует в mlpt генах всех проанализированных видов, включая недавно опубликованную последовательность mlpt водомерок, Gerris buenoi (Hemiptera, Gerridae) (Ray et al.
, 2019). Наконец, еще один пептид из 14 аминокислот был идентифицирован в 3′-области двух видов триатоминов (рис. 1А — розовые прямоугольники и рис. 1D).
(C) Выравнивание специфичного для полужесткокрылых пептида примерно из 80 аминокислот (зеленые прямоугольники в A ). (D) Выравнивание триатомин-консервативных пептидов, кодируемых smORF (розовые прямоугольники). # указывает на то, что в этой последовательности трансляция не прерывается.
Наши результаты показывают, что как Dmel-Svb, так и Rprol-Svb демонстрируют в основном неупорядоченные и спиральные области (дополнительные рисунки 1, 2), как предполагалось ранее (Zanet et al., 2015). Неупорядоченные и спиральные области появляются в больших доменах обоих белков, перемежаясь небольшими альфа-спиралями и короткими бета-листами (рис. 2A-R; дополнительные рисунки 2A, B).Согласно DISOPRED3, около С-конца в обоих Svbs вероятность беспорядка уменьшилась, что указывает на то, что двойной домен Zinc-finger, расположенный в этой области, более упорядочен. Меньшие пептиды, содержащие мотивы LDPTG(L/Q/T)Y, Dmel-pptd1 (дополнительная фигура 2C), Rprol-Mlpt1 (дополнительная фигура 2E) и Rprol-Mlpt2 (дополнительная фигура 2F) принимали неупорядоченные конформации. Напротив, Dmel-Mlpt4 (дополнительная фигура 2D), пептид с 32 аминокислотами и неизвестной функцией (Galindo et al., 2007; Kondo et al., 2007) представил упорядоченную структуру с двумя альфа-спиралями, интеркалированными двумя небольшими неупорядоченными областями.
Более того, программа DISOPRED3 также предсказала сайты связывания белка на N-конце Dmel-Svb в диапазоне от Leu19 до Asn23 и в Rprol-Svb от Ser24 до Leu42 (дополнительные рисунки 1A, B). Интересно, что наши выводы о взаимодействиях Dmel-Svb-Mlpt подтверждают предыдущие выводы Zanet et al. (2015), которые показали, что область между первыми 11 (N11) и 31 (N31) аминокислотами необходима для Mlpt-опосредованного процессинга.Поэтому мы дополнительно провели анализы стыковки с Svb и Mlpts, принимая во внимание предсказание данных и ранее опубликованные биологические данные (Zanet et al., 2015).
Ленты Dmel-Svb (B) и Rprol-Svb (K) (рисунок внизу) были окрашены от синего к красному, чтобы указать на переход от N- к C-концу соответственно. N-концевой участок (C, L) был увеличен, и предсказанная область сайта связывания белка Leu19-Asn23 была показана красным цветом для Dmel-Svb (C) , а область Ser24-Leu42 для Rprol-Svb (L ) . Dmel-Mlpt1 (D) , Dmel-Mlpt4 (G) , Rprol-Mlpt1 (M) и Rprol-Mlpt2 (P) представлены в виде ленты, окрашенной от синего до красного по мере развития полипептидной цепи. от N-конца до C-конца, каждый в соответствующем районе стыковки на поверхности Shavenbaby.Остатки боковых цепей Mpts показаны в виде палочек.
Были предсказаны возможные взаимодействия на сложных интерфейсах (дополнительная фигура 3), вклад свободной энергии связывания на остаток (дополнительная таблица 2), а также их теоретическое сродство к взаимодействию (дополнительная таблица 2).Аффинность связывания, измеренная программой HawkDock с использованием метода MM/GBSA, показала, что Dmel-Svb_Dmel-Mlpt4 имеет самую высокую аффинность, за ней следует Rprol-Svb_Rprol-Mlpt1, после Rprol-Svb_Rprol-Mlpt2 и Dmel-Svb_Dmel-Mlpt1 (дополнительный Таблица 3). Константа диссоциации (Kd) была измерена программой PRODIGY и предполагает низкое сродство между ними (дополнительная таблица 3). Количество связей и контактов было измерено с помощью PDBsum (дополнительная фигура 3; дополнительная таблица 3), и результаты показывают, что модель взаимодействия Rprol-Svb_Rprol-Mlpt1 имеет наибольшее количество несвязанных контактов, за которой следует Rprol-Svb_Rprol-Mlpt2. .Rprol-Svb_Rprol-Mlpt1 и Dmel-Svb_Dmel-Mlpt4 установили наибольшее количество водородных связей, но Dmel-Svb_Dmel-Mlpt4 имеет наибольшее количество солевых мостиков.
Дальнейший анализ сайт-направленного мутагенеза in silico подтвердил вклад каждой аминокислоты в связывание пептида с ТФ (дополнительная фигура 4). Важно отметить, что предсказания изменений аффинности связывания при мутациях указывают на то, что в глобальном масштабе не менее 30% остатков на поверхности раздела являются критическими для стабилизации белковых комплексов.Анализ изменений аффинности связывания при мутациях подтверждает предыдущие биологические данные Zanet et al. (2015), поскольку одиночные мутации лейцинов (L24, L25 и L19) и глутаминовой кислоты (E20) в N-концевой области Dmel-Svb влияют на взаимодействие этой области с Dmel-Mlpt1 (дополнительная фигура 4). Эти аминокислоты лежат в области, ранее экспериментально продемонстрированной как необходимая для процессинга Dmel-Svb, опосредованного Dmel-Mlpt1 (Zanet et al., 2015). Подводя итог, предлагаемая модель смогла восстановить ранее полученные данные о биологическом взаимодействии Dmel-Svb_Dmel-Mlpt (Zanet et al.
, 2015) и предложить предполагаемые области взаимодействия между Rprol-Svb и Rprol-Mlpts.
, 2007). У полужесткокрылых O. fasciatus и G. buenoi mlpt экспрессируется в переднем домене на ранних стадиях, во время удлинения зародышевой полосы через недавно добавленные сегменты кпереди от зоны роста, а более поздняя экспрессия наблюдается в презумптивных нейронах в центральных нейронах. нервной системы, а также в зачатках конечностей и ротовом отделе (Ray et al., 2019).
3B, 12–18 ч AEL).Полужесткокрылые, такие как R. prolixus , подвергаются эмбриональному инверсионному движению, называемому анатрепсисом (Panfilio, 2008). На стадии 3A (24–30 ч AEL), во время этого инверсионного движения (рис. 3C, C’) и в начале удлинения зародышевой полосы на стадии 3B (рис. 3D, D’ 30–36 ч AEL) Rp- mlpt экспрессируется на новообразованных грудных и брюшных сегментах, но не в самой задней области, зоне добавления сегмента (SAZ) или зоне роста (Auman et al., 2017; Paese et al., 2018). На стадии 4, во время удлинения полосы gem, экспрессия Rp-mlpt остается перед SAZ и в переднем домене экспрессии головы (Рисунки 3E-J, 36-48 ч AEL).На стадии 5 (48–60 ч AEL), незадолго до окончания сегментации и когда сегментарные зачатки вот-вот должны появиться, Rp-mlpt экспрессируется только в самой задней области (рис. 3K, 48–60 ч AEL). Между стадиями 5 и 6 (60–72 ч) сегментация брюшка завершается, и экспрессия Rp-mlpt наблюдается на кончиках ног и в головных долях (рис.
3L). Между стадией 7 (72–84 ч AEL) и стадией 8 (84–96 ч AEL), которая характеризуется ростом проксимально-дистальной оси ноги и утолщением брюшных сегментов, можно визуализировать экспрессию в латеральной, будущей дорсальной эмбриональной области. Рисунок 3М).На стадии 9 (96–108 ч AEL), в начале ретракции зародышевого диска, Rp-mlpt наблюдается только на антенне, органе, претерпевающем значительное увеличение в размерах на стадиях 9 и 10 (рис. 3N; Berni et al. ., 2014). В целом экспрессия mlpt является высокодинамичной, что указывает на множественные роли во время эмбрионального развития R. prolixus .
Вентральный вид яйца (A,B,C ‘ ,D ‘ ,G,H,I) . Яйца, выделенные из желтка (L,M,N) (A) Стадия 1B, ~10 ч после откладки яиц (AEL) mlpt Экспрессия выявляется в виде широкого средне-переднего домена, перекрывающегося с будущей головкой . (B) Через несколько часов (стадия 2А – 12–18 ч AEL) кроме переднего домена наблюдается еще и задний домен. (C,C ‘ ,D,D ‘ ) На стадии 3A (24–30 ч AEL) во время анатрепсиса задний домен экспрессии находится на поверхности (эктодерме), но не распространяется к задний отдел зародышевого диска. (E–J) На стадии 3B (30–36 ч AEL) экспрессия остается впереди задней области и в небольшом билатеральном домене в голове и начинает исчезать по мере завершения элонгации. (K) Стадия 4 (36–48 ч) в начале головной и грудной сегментации наблюдается экспрессия на заднем конце.
(L) Стадия 5 (48–60 ч AEL) во время роста ног наблюдается окрашивание, в частности, на кончиках ног и в мочках головы. (M) На стадии 7 (72–84 ч AEL) сегментация брюшной полости очевидна, и наблюдается экспрессия в кластерах латеральных сегментарных клеток, потенциально соответствующих периферическим нейронам, как ранее предполагалось для T. castaneum (Savard et al., 2006). (N) Стадия 9 (96–108 ч AEL) во время экспрессии ретракции зародышевых полос ограничена антеннами. Система стадирования эмбрионов R. prolixus была описана Berni et al. (2014).
В целом, эти данные RT-qPCR показывают, что экспрессия Rp-mlpt выше на стадиях зиготической сегментации, чем мРНК, депонированные материнским путем.
(А,А ‘ ) Стадия 3А. Удлинение зародышевой полосы кажется нерегулярным у эмбрионов RNAi по сравнению с контролями. (B,B ‘ ) Стадия 5. Неправильная сегментация грудной и гнатальной частей эмбриона RNAi. (C,C ‘ ) Стадия 7. Слияние сегментов грудной клетки и неправильная сегментация брюшной полости в сегментации эмбрионов РНКи по сравнению с контролем. (D, D ‘ ) Стадия 9. Третий грудной сегмент сочетает в себе отсутствие брюшной сегментации и дорсальное закрытие по сравнению с контролем (E, E ‘ ) Стадия 10.Поздний эмбрион mlpt RNAi с четырьмя парами ног по сравнению с тремя парами ног в контроле. Система стадирования эмбрионов R. prolixus была описана Berni et al. (2014).
5A-D). Красную пигментацию грудной клетки можно использовать для сравнения эмбрионов дикого типа и РНКи. В первом фенотипическом классе Rp-mlpt RNAi (20 из 45 эмбрионов-45%) могут быть идентифицированы эмбрионы с двумя парами грудных сегментов, что указывает на неправильную сегментацию грудного отдела (Рисунки 5B-B ‴ ).Во втором классе (15 из 45 эмбрионов-33%) присутствуют четыре грудных сегмента (рис. 5C-C ‴ ), а в третьем классе (10 из 45 эмбрионов-22%), самый сильный нокдаун фенотипа , у поздних эмбрионов наблюдается нарушение удлинения зародышевых полос и большая часть брюшной сегментации утрачена, в то время как дорсальное закрытие демонстрирует явные дефекты (Рисунки 5D-D ‴ ). Мы заметили, что введение более высоких концентраций дцРНК Rp-mlpt увеличивало частоту третьего фенотипического класса и наблюдение дефектов головки, которые не были идентифицированы ни в одном из ранее описанных классов (см. ниже).
Фенотипические классы mlpt РНКи поздних эмбрионов. mlpt нокдаунных эмбрионов были классифицированы по трем фенотипическим классам по сравнению с контролем (А-А ‴ ). (B–B ‴ ) Класс 1 — Эмбрионы, имеющие только два грудных сегмента и удвоение дистальных отделов ног (звездочка) (B–D) . Абдоминальная сегментация кажется нормальной, за исключением некоторых асимметричных сегментарных делений на левой и правой сторонах (звездочка) (20 из 45 эмбрионов). (C–C ‴ ) Класс 2 — Эмбрионы с четырьмя грудными сегментами и неправильной сегментацией брюшка (15 из 45 эмбрионов). (D–D ‴ ) Класс 3 — более короткие эмбрионы, имеющие только грудные сегменты и меньше брюшных сегментов, чем контрольные (10 из 45 эмбрионов).
Слияние сегментов и дефекты ног после mlpt РНКи. (A,B) Контроль (A) и mlpt RNAi нимфа (B,B ′ ,B ″ ). (B’) mlpt Нимфа RNAi, показывающая одностороннее слияние ног L1 и L2. (B ‘ , B ″ ) Более сильное увеличение дистальных областей сросшихся ног показывает морфологию, которая отличается от картины дикого типа. Несколько фенотипических изменений по сравнению с паттерном дикого типа наблюдаются после mlpt RNAi, такие как отсутствие дистальных областей, таких как предплюсна (Ts) и когти, как выделено в (B ″ ) . ТБ, большеберцовая кость; Ц, предплюсна; С, когти. Шкала бар 500 мкМ.
4, 5).Поскольку уменьшение или увеличение числа грудных сегментов наблюдалось на поздних эмбриональных стадиях после Rp-mlpt RNAi, мы оценили экспрессию ортолога гена полярности сегмента hedgehog (hh) в контроле и Rp-mlpt эмбрионов РНК-интерференции. Как и у других насекомых, задняя область каждого сегмента экспрессирует Rp-hh во время эмбриональной сегментации, а грудные и брюшные сегменты могут быть идентифицированы по их дифференциальной ширине (Рис. 7А).Фенотипическая серия Rp-mlpt RNAi эмбрионов показывает, что расстояние между сегментарными полосками уменьшено и что различие между грудными и брюшными сегментами менее четкое. Примечательно, что у явно более сильных фенотипов нокдауна также наблюдалось отсутствие самых передних сегментов головы (рис. 7А, звездочка). Окрашивание hh этих самых сильных фенотипов mlpt на стадии 9 подтверждает, что голова поражается на более поздних стадиях (рис. 7А’). Фенотипические дефекты в голове наблюдались только при инъекциях более высоких концентраций dsRNA (от 4 до 6 мкг на микролитр) и при низкой частоте (~10% эмбрионов).
Этот сильнейший фенотип нельзя отнести ни к одному из трех ранее описанных классов. В целом анализ экспрессии Rp-hh показывает, что Rp-mlpt необходим для правильного различения грудных и брюшных сегментов и для формирования головы.
(B) Окрашивание антител ANTP в контроле и эмбрионах Rp-mlpt RNAi. Антитело ANTP маркирует первую и вторую ноги (L1 и L2) и три грудных сегмента у контрольных эмбрионов.Средний ряд — Rp-mlpt Эмбрионы показывают два сросшихся сегмента (L1 и L2) и третью ногу (L3), которая не экспрессирует ANTP. Крайний правый эмбрион показывает четыре ноги с вероятной дупликацией L3, так как две самые задние ноги не экспрессируют ANTP. (C) Экспрессия pb в контрольных эмбрионах и эмбрионах РНКи. У контрольных эмбрионов на стадии 6 pb экспрессируется в третьем сегменте бородки, соответствующем предполагаемой губе. После mlpt RNAi pb либо не затронуты (правая сторона), либо имеют неправильную форму (левая сторона).Дупликации или отсутствие окрашивания не наблюдались после mlpt RNAi. Эмбрионы Kr RNAi демонстрируют паттерны дупликации, эмбрионы gt RNAi демонстрируют меньшую группу экспрессирующих клеток и отсутствие передних гнатальных сегментов.
svb RNAi демонстрирует явные отклонения сегментации от паттерна дикого типа, но не показывает изменений в окрашивании pb . (D) Экспрессия Ubx в контрольных эмбрионах и эмбрионах РНКи. Экспрессия Ubx сильнее на первом сегменте брюшка и в концентрических кольцах третьей ноги.После mlpt RNAi Ubx по-прежнему сильно экспрессируется в первом брюшном сегменте, а не в концентрических кольцах третьей ноги. Эмбрионы Kr RNAi демонстрируют диффузное окрашивание в брюшной области. В сильном фенотипе эмбрионов gt RNAi отсутствует брюшная экспрессия Ubx , в то время как этот маркер экспрессируется в двух последовательных парах ног, предполагая дублирование третьей ноги (L3). Эмбрионы Hb RNAi демонстрируют экспрессию Ubx в передних (гнатальных) сегментах.Окрашивания Ubx в ногах не наблюдалось. У сильного эмбриона svb RNAi отсутствует задняя брюшная часть, но обнаруживается экспрессия Ubx .
( Хб) .Мы выполнили родительскую РНК-интерференцию против ортологов этих трех гэп-генов и проанализировали экспрессию Hox-генов. Krüppel (Kr) и гигантский ( gt ) РНКи-фенотипы были опубликованы в другом месте (Lavore et al., 2012, 2014). Экспрессия гена Hox proboscipedia ( pb ) в третьем гнатальном сегменте сравнима у контрольных эмбрионов и эмбрионов mlpt RNAi, хотя задняя область при нокдауне была явно затронута (рис. 7С).Напротив, экспрессия pb дублируется после Rp-kr РНКи, значительно снижается после Rp-gt РНКи и слегка изменяется после Rp-Hb РНКи (рис. 7C).
Анализ эмбриона с четырьмя парами ног (фенотип класса 2) показал, что только самая задняя нога экспрессирует Ubx , указывая на то, что эта нога соответствует L3 и что должна иметь место дупликация L1 или L2. Интересно, что экспрессия Ubx в L3 происходит не в виде концентрического кольца, как в контроле, а скорее на одной стороне ног, что позволяет предположить, что формирование паттерна ног также было затронуто (рис. 7С).Кроме того, небольшое расширение Ubx в сторону задних сегментов наблюдалось у эмбрионов mlpt RNAi (рис. 7C). Экспрессию Ubx также анализировали при нокдауне других генов gap, таких как Kr, gt и hunchback ( Hb) pRNAi. Эмбрионы Kr RNAi показывают только две пары ног и отсутствие окрашивания Ubx в ногах, что позволяет предположить, что третья нога (L3) отсутствует. Кроме того, наблюдалось большое расширение экспрессии Ubx в сторону задней области у эмбрионов Kr RNAi.
Эмбрионы Rp-gt RNAi лишены гнатального и брюшного сегментов и обнаруживают дупликацию L3. Эмбрионы Rp-Hb RNAi обнаруживают большую экспансию задних судеб в сторону передней области, что также указывает на главную роль этого гена gap в R. prolixus (Fig. 7D). В целом эти результаты свидетельствуют о том, что роль сегментации Rp-mlpt у R. prolixus довольно ограничена и в основном сосредоточена на переходе между грудным и брюшным отделами и что классические гены разрыва, такие как kr, gt, hb , проявляют более широкую роль в сегментарном каскаде полужесткокрылых R.prolixus (рис. 7). Дальнейшее подтверждение гипотезы о том, что функция mlpt в основном необходима для различения торакальных и абдоминальных клеток, обеспечивается иммуногистохимическим анализом с использованием моноклональных антител против гомеобоксного транскрипционного фактора ANTP. ANTP разграничивает грудные сегменты (T1-T3) и ноги один и два (L1 и L2) в контроле (рис.
7B). Как и в контроле, ANTP экспрессируется только в L1 и L2 у эмбрионов мл дцРНК с четырьмя ногами (L1-L4), что позволяет предположить, что L4 у этих эмбрионов может быть дупликацией L3 (Ray et al., 2019).
, 2015; Pueyo et al., 2016a). mlpt — наиболее широко изученный полицистронный ген, кодирующий smORF у насекомых.Предыдущие исследования и наш собственный анализ последовательности, представленный здесь, показали, что mlpt не присутствует в геномах хелицеровых и многоножек, будучи ограниченным Pancrustacea.
, 2010; Zanet et al. др., 2015). Новый специфичный для полужесткокрылых пептид, идентифицированный здесь (smHemiptera), примерно на 35% длиннее у R. prolixus , чем у проанализированных видов с наиболее базальным ветвлением, Pseudococcus longispinus (рис. 1A, C).Недавно было высказано предположение, что smORF могут эволюционировать в основные ORF посредством паттерна «удлинения» (Couso and Patraquim, 2017). Хотя smHemiptera не является основной ORF, распределение размеров пептида smHemiptera в филогении полужесткокрылых подтверждает эту гипотезу. Будущие исследования должны рассмотреть функцию smHemiptera. Маловероятно, что предсказанный пептид smORF с участком из 14 аминокислот со 100% идентичностью в течение 240 миллионов лет будет нефункциональным. Следует учитывать, что использованная в нашем исследовании методика pRNAi приводит к нокдауну зрелого транскрипта и, предположительно, всех предсказанных пептидов, кодируемых геном полужесткокрылых mlpt .Технология редактирования Cas9/CRISPR была установлена у других немодельных видов членистоногих (Gilles et al.
, 2015), и ее внедрение в R. prolixus может помочь раскрыть специфическую функцию каждого небольшого пептида, присутствующего в Rp-mlpt . транскрипция на разных стадиях развития. Недавние исследования показали, что mlpt необходим для активации Svb во взрослых тканях, особенно в почечных и кишечных стволовых клетках D. melanogaster (Al Hayek et al., 2019). Поскольку mlpt также экспрессируется в желудочно-кишечном тракте R. prolixus (Ribeiro et al., 2014 и наши собственные наблюдения), также будет интересно рассмотреть функциональную роль этого гена, содержащего smORF, в других контекстах развития.
melanogaster Svb. Вторичная структура и укладка как для Svb, так и для Mlpts, а также сайты связывания белка на N-конце Svbs были смоделированы и согласуются с (Zanet et al., 2015). Оба Svbs (Dmel и Rprol) демонстрируют около 80–90% консервативных неупорядоченных областей, но было предсказано, что двойной домен цинкового пальца возле C-конца будет более упорядоченным (дополнительная фигура 1C). Результаты анализов стыковки и изменения аффинности связывания при мутации ключевых остатков на границе взаимодействия предлагают интересную возможность предложить теоретическую модель взаимодействия для Svb-Mlpt обоих видов (дополнительные рисунки 3, 4).Лейцины (L24, L25 и L19) и глутаминовая кислота (Е20) в N-концевой области Dmel-Svb влияют на его взаимодействие с Dmel-Mlpt1, аминокислотами, ранее идентифицированными в области взаимодействия между Dmel-Svb и Dmel_Mlpt1 (Zanet и др., 2015). Кроме того, наши результаты предполагают, что оба организма используют по крайней мере половину остатков мотива LDPTG(L/Q/T)Y для закрепления на N-концевой области Shavenbaby.
Все эти данные in silico могут быть полезны для будущих подходов ЯМР для проверки этих структурных предсказаний и для проверки эффектов мутаций в пептидах smORF с использованием технологии Cas9/CRISPR.
и др., 2018). Так, как наблюдалось для T. castaneum (Savard et al., 2006) и совсем недавно у полужесткокрылых O. fasciatus и G. buenoi (Ray et al., 2019), Rp-mlpt является сначала экспрессируется в переднем домене, перекрывающемся с головой, и вскоре после экспрессии в заднем домене, перекрывающемся с проспективными грудными сегментами (рис. 3).Позже, во время удлинения зародышевого диска и закрытия спины, динамическая экспрессия Rp-mlpt наблюдается в нескольких тканях, включая кончики ног, голову и антенну (рис. 3). В то время как выражение в голове и в ногах было зарегистрировано у других видов (Ray et al., 2019), выражение в антеннах на более поздних стадиях, насколько нам известно, было сообщено только здесь и недавно у другого вида полужесткокрылых. O. fasciatus (Ray et al., 2019).
отложенные или неоплодотворенные яйца (0–6 ч AEL) (дополнительный рисунок 6).Хотя время развития процесса материнско-зиготического перехода у R. prolixus неизвестно, эти результаты позволяют предположить, что большие изменения уровней транскрипции mlpt происходят зиготически, на более поздних стадиях (36–48 ч AEL). Возможно, что транслированные пептиды Mlpt могут посттранскрипционно переключать Svb с репрессора на активатор через 36–48 ч AEL, как сообщалось ранее для D. melanogaster (Kondo et al., 2010; Zanet et al., 2015). ).
7), показало четкие различия (рис. 7). Эмбрионы с нокдауном mlpt обнаруживают локализованные фенотипические изменения в основном на переходе между грудным и брюшным сегментами, в то время как нокдаун вышеупомянутых факторов транскрипции показывает более сильные эффекты и изменения в экспрессии молекулярных маркеров (Рис. 7).Наши результаты можно согласовать с несколькими недавно опубликованными исследованиями о 90 613 мл. 90 614 в других отрядах насекомых (рис. 8A, B). У T. castaneum нокдаун mlpt приводит к обширным гомеозисным трансформациям, и эмбрионы обнаруживают до шести пар ног (Savard et al., 2006). Недавние данные по двум другим полужесткокрылым показали, что нокдаун трех генов mlpt, Ubr3 и svb демонстрирует сходные фенотипические эффекты, которые мы описываем здесь для R. prolixus , такие как усечение сзади со слиянием/потерей грудных сегментов, укороченные ноги и придатки головы (Ray et al., 2019). В то время как у R. prolixus наблюдались эмбрионы mlpt RNAi с четырьмя парами ног, O.
fasciatus и G. buenoi нокдаун эмбрионов демонстрируют слияние грудных сегментов, и об увеличении количества грудных сегментов не сообщалось. Поскольку формирование эктопического сегмента после mlpt RNAi происходит с низкой частотой у R. prolixus , возможно, что оно также происходит с низкой частотой у нокдауна O. fasciatus и G. buenoi mlpt .Интересно, что у этих трех видов 90 613 mlpt 90 614 в основном требуется, когда происходит удлинение зародышевых полос и сегментация брюшка, и будущие исследования с использованием эмбриональной живой визуализации, как недавно описано для других видов насекомых (Benton, 2018), могут помочь понять роль mlpt во время удлинения зародышевой полосы и спецификации грудного и брюшного сегментов.
(B) Множественные роли mlpt в эволюции насекомых, основанные на выводах Galindo et al. (2007), Пуэйо и Кузо (2011), Чанут-Делаланд и др. (2014), Zanet et al. (2015), Цао и др. (2018), Хименес-Гури и др.(2018), Zhu et al. (2018) и Рэй и соавт. (2019) и текущая рукопись.
8А). Наши данные важны для определения множественных ролей mlpt в эмбриогенезе R. prolixus , особенно во время раннего формирования паттерна.Поскольку недавний анализ двух других видов полужесткокрылых, O. fasciatus и G. buenoi , продемонстрировал аналогичную роль mlpt и его партнеров по взаимодействию в процессах раннего развития (Ray et al., 2019), можно сделать вывод. что у общего предка Paraneoptera mlpt уже выполняли множественные роли (рис. 8В). Большинство этих ролей mlpt были описаны у Diptera и Coleoptera, и они остаются открытыми, если все они сохраняются у гемиметаболических насекомых, а также его наследственная функция у насекомых (Рис. 8B).Наконец, наши данные вносят вклад в изучение эволюции mlpt , обеспечивая интересное открытие нового консервативного пептида полужесткокрылых, функция которого должна быть изучена в будущих функциональных исследованиях.
melanogaster и T. castaneum использовали для поиска BLAST (Altschul et al., 1997) по доступным геномам и транскриптомам членистоногих с использованием ослабленных параметров, чтобы максимизировать шансы получить гены, кодирующие smORF.Виды, использованные для идентификации smORF, показаны в дополнительной таблице 1. Rp-mlpt/tal/pri был идентифицирован в геноме и транскриптомах R. prolixus (Medeiros et al., 2011; Ribeiro et al., 2014; Mesquita). и др., 2015; Маршан и др., 2016). Результаты BLAST и архитектуры доменов были аннотированы вручную.
Глобальное и локальное стереохимическое качество всех предсказанных моделей было выполнено с помощью MolProbity (Chen et al., 2010), Verify 3D (Eisenberg et al., 1997), ProSA (Wiederstein and Sippl, 2007), VoroMQA (Olechnovic and Venclovas, 2017). ), ProQ3D (Uziela et al., 2017), Qprob (Cao and Cheng, 2016), DeepQA (Cao et al., 2016) и SVMQA (Manavalan and Lee, 2017).Наиболее подходящие структурные модели были уточнены с помощью ModRefiner (Xu and Zhang, 2011), 3Drefine (Bhattacharya et al., 2016), GalaxyRefine (Heo et al., 2013) и FG-MD (Zhang et al., 2011). Анализы стыковки белков и пептидов были направлены на N-концевую область Shavenbaby (первые 31 а.о.), что было вдохновлено выводами Zanet et al. (2015). Предсказания вторичных структур, неупорядоченных областей и участков связывания пептидов у Shavenbabys были дополнительно проанализированы с помощью PSIPRED (Jones, 1999), Porter (Mirabello and Pollastri, 2013), SPOT-Disorder (Hanson et al., 2017) и DISOPRED3 (Jones and Cozzetto, 2015) соответственно.
Докинги выполнены HADDOCK (van Zundert et al., 2016). Лучшие комплексы взаимодействия были отобраны после исчерпывающего анализа с помощью программ DockScore (Malhotra et al., 2015), PPCheck (Sukhwal, Sowdhamini, 2015) и CCharPPI (Moal et al., 2015). После выбора лучшего комплекса дальнейшие уточнения проводились с помощью GalaxyRefineComplex (Heo et al., 2016). Уточнения были выполнены с использованием функции « Минимизация энергии боковых цепей » на веб-сервере PDB_Hydro (Azuara et al., 2006). Прогноз свободной энергии связывания (ΔG) с использованием метода MM/GBSA был выполнен HawkDock (Weng et al., 2019), прогноз константы диссоциации ( K d ) был выполнен PRODIGY (Xue et al., 2016). ), а анализ аминокислот в горячих точках, расположенных на границе взаимодействия, был выполнен с помощью HotRegion (Cukuroglu et al., 2012) и ANCHOR (Meireles et al., 2010) соответственно. Расчеты изменения энергии связывания белок-белкового комплекса при мутациях в остатках на границе взаимодействия были выполнены с помощью BindProfX (Xiong et al., 2017). Электростатические расчеты проводились с помощью PDB2PQR и APBS (Долинский и др., 2004; Унни и др., 2011). Межатомные контакты и типы взаимодействий, поддерживаемые на интерфейсах Svbs-MLTP, были проанализированы с помощью PDBsum (Laskowski et al., 2018). Изображения комплексов Svbs-MLTPs были получены с помощью UCSF Chimera 1.13.1 (Pettersen et al., 2004).