Pozdnyakova irina: Автор: Позднякова Ирина Юрьевна | новинки 2022

Жив или мертв?

По нашей базе Ирина Позднякова жива.

Краткие сведения:

Вот несколько интересных фактов об Ирине Поздняковой:

* Родом из России.

* Ее знак зодиака — Телец, а элемент знака зодиака — Земля.

* Ее двойственность пассивна, а противоположный солнечный знак — Скорпион.

Часто задаваемые вопросы (FAQ):

Ссылка: Вики и газеты.

Субкомплекс PTIP-PA1 способствует транскрипции для переключения класса IgH независимо от ассоциированного метилтрансферазного комплекса MLL3/MLL4 Комплекс метилтрансферазы MLL4″,

abstract = «Рекомбинация переключения классов (CSR) диверсифицирует антитела для продуктивных иммунных ответов, сохраняя при этом стабильность генома В-клеток. Транскрипция в локусе тяжелой цепи иммуноглобулина (Igh) нацелена на повреждение ДНК, связанное с CSR, и стимулируется PTIP, содержащим домен BRCT (белок, взаимодействующий с доменом трансактивации Pax). Хотя PTIP является уникальным компонентом хроматин-модифицирующего комплекса смешанной линии лейкемии 3 (MLL3)/MLL4, механизмы того, как PTIP способствует транскрипции, остаются неясными. Здесь мы проанализировали минимальные структурные требования PTIP и его различных белковых комплексов, используя количественную протеомику в первичных лимфоцитах.Мы обнаружили, что PTIP функционирует в транскрипции и CSR отдельно от его ассоциации с комплексом MLL3/MLL4 и от его локализации в местах повреждения ДНК. Мы идентифицировали тандемный домен BRCT PTIP, достаточный для CSR, и идентифицировали PA1 как его основной функциональный белок-партнер. В совокупности мы предоставляем генетические и биохимические доказательства того, что субкомплекс PTIP-PA1 функционирует независимо от комплекса MLL3/MLL4, опосредуя транскрипцию во время CSR. Эти результаты способствуют нашему пониманию того, как многофункциональные комплексы, модифицирующие хроматин, организованы с помощью подкомплексов, которые обладают уникальной и отличной активностью.»,

ключевых слов = «53BP1, реаранжировка антигенных рецепторов, домены BRCT, повреждение ДНК, метилирование гистонов, PTIP»,

автор = «Старнес, {Линда М.} и Дэн Су и Пиккупеура, {Лаура М.} и Вейнерт , {Брайан Т.} и Сантос, {Маргарида А.} и Андреас Мунд и Ребека Сориа и Чо, {Янг Вук} и Ирина Позднякова и Хойфельдт, {Мартина Кубец} и Андреа Вала и Вэньцзин Ян и Бланка L{\’o}pez-M{\’e}ndez и Lee, {Ji Eun} и Weiqun Peng и Joan Yuan и Kai Ge и Guillermo Montoya и Andr{\’e} Nussenzweig и Chunaram Choudhary и Daniel, {Jeremy А.}»,

примечание = «Авторские права издателя: {\textcopyright} 2016 Starnes et al.»,

год = «2016»,

месяц = ​​январь,

день = «15»,

doi = «10.1101 /gad.268797.115»,

language = «Английский (США)»,

volume = «30»,

pages = «149—163»,

journal = «Genes and Development»,

issn = «0890-9369»,

издатель = «Cold Spring Harbour Laboratory Press»,

номер = «2»,

}

Ирина Беспалова — биография, возраст, вики, факты и семья

Ирина Беспалова О

She is a celebrity video star web.»> Ирина Беспалова была родилась 15 июля 1987 (34 года) в Россия .Она знаменитость видео звезды сети.

Видеореклама

Ирина Беспалова Биография

Ибеспалова — российская личность в Instagram, которая делится фотографиями своей семьи и путешествий в своем аккаунте ibespalova. У ее аккаунта в Instagram почти 700 000 подписчиков.

В апреле 2018 года она разместила фотографию своего сына и дочери в своем аккаунте в Instagram.

В январе 2014 года она сделала свой первый пост в Instagram.

«> Она ездила в Дакар в Сенегале в ноябре 2017 года.

Ирина Беспалова — Чистая стоимость

Информация о собственном капитале Ирины Беспаловой в 2021 году обновляется infofamouspeople.com как можно скорее. Вы также можете нажать «Изменить», чтобы сообщить нам, какой собственный капитал Ирины Беспаловой составляет

Ирина Беспалова еще жива?

Ирина Беспалова жива и здорова и является звездой видео сети

Ирине Беспаловой 34 года. Рост Ирины Беспаловой сейчас неизвестен, а вес недоступен.Параметры Ирины Беспаловой, размеры одежды и обуви скоро будут обновлены, или вы можете нажать кнопку редактирования, чтобы обновить рост и другие параметры Ирины Беспаловой.

Она и Алина Боз — популярные российские звезды Instagram.

Дома, автомобили и люксовые бренды

Дом, автомобиль и люксовый бренд Ирины Беспаловой в 2021 году как можно скорее обновляются in4fp. com. Вы также можете нажать «Изменить», чтобы сообщить нам об этой информации.

Жидкое расслоение внутренне неупорядоченных белков засевается поли(АДФ-рибозой)

PAR запускает сборку IDP в местах повреждения ДНК

что образование PAR жестко регулируется, при этом уровни PAR повышаются в основном в условиях клеточного стресса и, в частности, в ответ на повреждение ДНК (дополнительная рис.1a), мы разработали гипотезу о том, что образование PAR может представлять собой событие нуклеации, чтобы инициировать специфичное для сайта жидкостное расслоение белков, содержащих LCD. В поддержку этого предположения мы ранее идентифицировали LCD в белке SAFB1 (скаффолдный фактор прикрепления B1) как сенсор образования PAR, который необходим и достаточен для рекрутирования в места повреждения ДНК ¹⁰ . Запросы базы данных белков с использованием базы данных PrePPI ¹¹ показали потенциальные взаимодействия между SAFB1 и различными другими LCD-содержащими РНК-связывающими белками (дополнительные данные 1). Более того, мы заметили значительное перекрытие между белками, способными подвергаться жидкостному расслоению ⁵ , и белками, ранее идентифицированными протеомными подходами как связанные с PAR ¹² (рис. 1а). Напротив, не было обнаружено значительного перекрытия между белками, связанными с PAR, и контрольной группой, содержащей 225 ядерных протеинкиназ (рис. 1b; дополнительная рис. 1b). Среди ЖК-содержащих белков, ассоциированных с PAR, были IDP FUS/TLS (слитые в саркоме/транслоцированные в саркоме), EWS (саркома Юинга), TAF15 (TATA-бокс-связывающий белок-ассоциированный фактор 68 кДа) (собирательно обозначаемые как белки FET). , также называемый семейством белков TET) и ряд гетерогенных ядерных рибонуклеопротеинов (hnRNP; дополнительные данные 2).В частности, три белка FET привлекли наше внимание по следующим причинам: во-первых, различные точечные мутации в генах FET были связаны с патологической агрегацией белков при нейродегенеративных заболеваниях, в частности, при боковом амиотрофическом склерозе (БАС) и лобно-височной долевой дегенерации (ЛВЛД). ² . Одним из способов того, как такие мутации могут способствовать протеинопатии, является увеличение склонности к внутриклеточной агрегации, как недавно продемонстрировано для FUS ¹³ .Во-вторых, белки FET часто обнаруживают генную транслокацию при раке человека, и новые данные указывают на их физическое взаимодействие с повреждениями ДНК и, таким образом, участие в поддержании целостности генома ^{14,15,16,17,18} . В-третьих, из-за высокой степени внутреннего структурного беспорядка эти белки представляют собой прототипы IDP, каждый из которых содержит прионоподобный амино-концевой LCD, богатый SYQG, и расширенный карбоксильный концевой LCD, богатый RGG, содержащий 18–22 повтора RGG (рис. 1с). Таким образом, мы решили проверить гипотезу о том, что PAR может зародить разделение фаз и расслоение жидкости, используя три белка FET в качестве прототипа IDP и клеточный ответ на повреждение ДНК в качестве модельной системы, используя тот факт, что уровни PAR сильно индуцируются в местах разрывов ДНК. ¹⁹ .

( a ) Перекрытие белков, связанных с гранулами РНК (синий), преципитаты b-изокса и in vitro сгенерированные гидрогели (оранжевый) и PAR (зеленый). ( b ) Перекрытие белков, связанных с PAR (зеленый) и контрольной группой из 225 ядерных киназ (коричневый). ( a , b ) Звездочками отмечены правосторонние значения P (точный критерий Фишера).( c ) Организация белкового домена LCD-содержащих белков FET FUS, EWS и TAF15, каждый из которых содержит прионоподобные SYQG-богатые амино-концы и карбоксильные концы, богатые RGG-повторами. Звездочками отмечены участки онкогенных транслокаций. ( d ) Кинетика набора GFP-FUS в места лазерного микрооблучения в отсутствие или в присутствии ингибитора PARP олапариба (10   мкМ). Показаны кадры замедленной съемки первых 15 минут после облучения. Белые стрелки указывают ориентацию лазерной линии.См. Также дополнительный фильм 1. ( e ) Кинетика набора GFP-EWS в места лазерного микрооблучения. ( f ) Кинетика набора GFP-TAF15 в места лазерного микрооблучения. Масштабные линейки, 10  мкм.

Чтобы вызвать локальное повреждение ДНК, мы использовали протоколы лазерного микрооблучения, разработанные ранее в нашей лаборатории ²⁰ , что позволило нам отслеживать самые ранние клеточные реакции на разрывы нити ДНК в режиме реального времени и с непревзойденным до сих пор временным разрешением.В соответствии с недавней работой ^15,16,17 мы наблюдали быстрое и временное накопление зеленого флуоресцентного белка (GFP)-FUS, GFP-EWS и GFP-TAF15 в местах повреждения ДНК (рис. 1d-f, верхние панели). , Дополнительный фильм 1). Однако, в соответствии с нашей гипотезой, мы заметили, что накопление всех трех белков происходило с одинаково быстрой кинетикой и строго зависимым от PAR образом (рис. 1d–f, нижние панели), предполагая, что PAR является обычным засевом вверх по течению. событие, которое инициирует сборку ЖК-содержащих белков.Мы подтвердили, что уровни эндогенного белка были достаточными для накопления белка FET в местах повреждения ДНК, и что накопление эндогенных белков происходило по кинетике, очень похожей на слияния GFP (дополнительная рис. 1c), а также совпадало с локальным образованием PAR, следуя кинетике его раннего появления и последующего исчезновения (дополнительный рис. 1d – f). Более того, PAR-зависимое накопление не ограничивалось повреждением ДНК, вызванным лазером, потому что временное и PAR-зависимое накопление белков FET на хроматине также наблюдалось после обработки перекисью водорода, хорошо зарекомендовавшим себя активатором ферментов PARP, что действительно приводило к в быстром, независимом от фазы клеточного цикла образовании PAR, которое совпало с накоплением белка FET, как было обнаружено с помощью количественной автоматизированной микроскопии (дополнительная рис.2а–г). Вместе эти данные свидетельствуют о том, что образование PAR является общим триггером для сборки прототипов ЖК-содержащих белков. Они также предполагают, что LCD-содержащие белки могут взаимодействовать с передачей сигналов PAR для улучшения поддержания целостности генома. Таким образом, мы пришли к выводу, что потеря белков FET должна повысить чувствительность клеток к условиям, когда образование PAR нарушено, но будет эпистатической в ​​условиях, когда образование PAR полностью заблокировано. Анализы образования колоний действительно показали сенсибилизацию путем нокдауна белка FET к низким концентрациям ингибитора PARP олапариба, тогда как при высоких концентрациях ингибитора дальнейшего снижения клоногенной выживаемости не наблюдалось (дополнительная рис.3). Т.о., белки FET появляются как эффекторы передачи сигналов PAR. Поэтому мы решили исследовать механизм их PAR-зависимой сборки и, учитывая их высокую внутреннюю склонность к фазовому разделению ⁵ , может ли этот процесс включать динамическое расслоение жидкости.

Модули RGG являются сенсорами формирования PAR

Поскольку индукция PAR связана с генерацией высокой локальной плотности отрицательных зарядов, мы сначала проверили, могут ли положительно заряженные повторы RGG, присутствующие в белках FET и часто мутирующие при ALS/FTLD, участвовать в восприятии образования ФАР. Мы сконструировали мутанты, содержащие разное количество повторов RGG, и проверили их накопление в местах лазерного микрооблучения. Конструкция GFP-TAF15, содержащая 20 из исходных 22 повторов RGG, но лишенная амино-концевой половины белка, показала выраженное рекрутирование в места повреждения ДНК PAR-зависимым образом (рис. 2а). Конструкция GFP-EWS, содержащая 16 из исходных 22 повторов RGG, также накапливалась PAR-зависимым образом, но в несколько уменьшенной степени (Fig. 2b).Самый короткий мутант GFP-FUS, содержащий 8 повторов RGG, рекрутировался лишь слабо, но измеримо и снова зависимым от PAR образом (Fig. 2c). Таким образом, LCDs, богатые повторами RGG, по-видимому, ощущают локальное накопление PAR в зависимости от количества повторов. Чтобы проверить, необходим ли положительный заряд, обеспечиваемый остатком аргинина, для PAR-зависимой сборки, мы мутировали все восемь аргининов, присутствующих в коротком фрагменте GFP-FUS, серинами. В отличие от конструкции дикого типа мутант SGG не накапливался в местах лазерного микрооблучения (рис. 2г). Таким образом, положительные заряды в повторах RGG действительно необходимы для электростатического взаимодействия PAR.

( a ) Кинетика рекрутирования GFP–TAF15 320–592 (20 RGG) в места лазерного микрооблучения в отсутствие или в присутствии ингибитора PARP олапариба (10  мкМ). Показаны кадры замедленной съемки первых 15 минут после облучения. Белые стрелки указывают ориентацию лазерной линии.( b ) Кинетика набора GFP-EWS 445–656 (16 RGG) в места лазерного микрооблучения. ( c ) Кинетика набора GFP-FUS 468–526 (8 RGG) в места лазерного микрооблучения. ( d ) GFP-FUS 468–526, в котором RG/RGG были заменены на SG/SGG; клетки подвергали лазерному микрооблучению и визуализировали как в a – c . Масштабные линейки, 10  мкм.

Разделение фаз прионоподобных доменов путем жидкостного расслоения

Прионоподобные амино-концевые домены, богатые SYQG, представляют собой по своей природе склонные к агрегации последовательности, которые участвуют в формировании сборок белков FET более высокого порядка ²¹ . Мы заметили, что изолированные амино-концы, полученные из трех белков FET, спонтанно собирались в удивительно сферические структуры при экспрессии в клетках человека (рис. 3a–c; дополнительная рис. 4a). Мы считали, что такие спонтанные сборки возникают в результате жидкостного расслоения последовательностей, изначально склонных к агрегации, когда внутриклеточные концентрации превышают пороговые уровни. Действительно, количественная визуализация предоставила доказательства того, что для всех трех белков FET пороговые уровни определяют образование сферических внутриклеточных капель (рис.3г–е). Кроме того, в соответствии с идеей образования капель жидкости, цейтраферная визуализация показала, что белковые сборки были подвижными, подвергались событиям слияния и деления и увеличивались в размерах по мере увеличения уровня экспрессии (рис. 3g; дополнительный фильм 2). Все эти особенности, наблюдаемые для прионоподобных доменов FET (сферическая структура, вероятно, из-за минимального поверхностного натяжения, резкий переход к образованию капель при увеличении концентрации белка, внутриклеточная подвижность, события слияния и деления), являются отличительными чертами жидких капель, образующихся при расслоении жидкости ²² . Поразительно и полностью согласующееся с компартментализацией путем разделения фаз, мы обнаружили, что коэкспрессируемые прионоподобные домены различных белков FET стабильно сосуществуют исключительно с одними и теми же большими каплями жидкости, что указывает на то, что расслоение жидкости включает как гомотипические, так и гетеротипические взаимодействия между FET. белков, и что гетеротипические взаимодействия могут способствовать процессу разделения (рис. 3h; дополнительная рис. 4b).

( a ) GFP-FUS 1-211 экспрессировался в течение 24 ч в клетках U-2-OS, и с помощью флуоресцентной и фазово-контрастной (ПК) микроскопии было обнаружено спонтанное образование внутриклеточных капель. ( b ) GFP-EWS 1–285 был выражен и проанализирован как a . ( c ) GFP-TAF15 1–216 был выражен и проанализирован как a . ( d ) Субъядерное образование капель GFP-FUS 1–211, оцененное и количественно оцененное с помощью программного анализа изображений с использованием системы Olympus ScanR, изображено как функция экспрессии GFP-FUS 1–211 для выявления резкий переход к каплеобразованию после достижения внутриядерных концентраций, достаточных для запуска самопроизвольного расслоения жидкости.( e ) Субъядерное образование GFP-EWS 1–285 оценивали и анализировали как d . ( f ) Субъядерное образование GFP-TAF15 1–216 оценивали и анализировали, как в d . ( г ) GFP-FUS 1-211 экспрессировался как a и контролировался в реальном времени с помощью покадровой визуализации в течение 1 часа с 2-минутными интервалами. Предусмотрены кадры фильмов и увеличения капель внутриклеточной жидкости. Белые звездочки отмечают событие слияния двух капель, а красные звездочки отмечают событие деления.См. также Дополнительный фильм 2. ( ч ) GFP-FUS 1–211 и Tomato-EWS 1–285 коэкспрессировались в течение 24 часов в клетках U-2-OS, и спонтанное образование гетеротипических капель было обнаружено с помощью флуоресценции и фазы. -контрастная (ПК) микроскопия. ( i ) GFP-FUS 1-211 экспрессировали как a , клетки фиксировали и окрашивали на эндогенный FUS с использованием антитела против карбоксильного конца белка. ( j ) GFP-FUS 1-211 экспрессировали как a , клетки фиксировали и окрашивали на эндогенный TAF15.( k ) GFP-FUS 1–211 и Tomato-EWS 1–285 коэкспрессировались, как и в ч , клетки фиксировали и окрашивали на эндогенный hnRNPUL1. ( l ) Tm-EWS 1–285 экспрессировали в течение 24 часов, клетки подвергали микрооблучению лазером и визуализировали, как на рис. 2a–d. Показаны кадры замедленной съемки первых 15 минут после облучения. Белые стрелки указывают ориентацию лазерной линии. ( м ) Tm-EWS 1–285 и GFP-EWS коэкспрессировались в течение 24 часов, клетки подвергались лазерному микрооблучению и визуализировались, как на рис.2а–г. Показаны кадры замедленной съемки первых 15 минут после облучения. Масштабные линейки, 10  мкм.

По определению, расслоение жидкости создает безмембранные компартменты внутри субклеточного пространства, в которых одни компоненты обогащаются, а другие исключаются. Ярким примером является ядрышко, которое сильно обогащено рибосомной РНК и рибосомальными РНК-связывающими белками, но не пермиссивно для других ядерных компонентов, включая определенные ответвления реакции на повреждение ДНК. Мы заметили, что капли жидкости, генерируемые прионоподобными доменами белков FET, приводили к четко различимому изменению дифракции света, очень сравнимому с картинами дифракции света, связанными с ядрышками (рис.3а–в,з). Заинтригованные этим открытием, мы стремились проверить, могут ли белковые сборки FET, как и другие безмембранные компартменты, такие как ядрышки, функционировать как молекулярное сито, чтобы включать одни и исключать другие клеточные компоненты. Таким образом, мы исследовали ассоциации эндогенных белков в каплях жидкости FET с помощью непрямой иммунофлуоресценции и обнаружили, что капли, содержащие эктопически экспрессированный прион-подобный амино-конец FUS, также привлекали эндогенный FUS, что было обнаружено антителом против его карбоксильного конца (рис. 3и). Поразительно, но он может даже локально обогащать эндогенный TAF15 (Fig. 3j). Более того, в этих сферических структурах присутствовали не только эндогенные белки FET, самособиравшиеся in vivo в гетеротипические капли жидкости, но и hnRNPUL1, другой LCD-содержащий хранитель генома ^23,24 (рис. 3k; дополнительная рис. 4c). ). Вместе эти данные показывают, что прионоподобные домены белков FET могут самособираться гомотипическим и гетеротипическим образом, и что такие сборки локально концентрируют дополнительные LCD-содержащие белки для дальнейшего управления фазовым разделением.

В отличие от специфического обогащения LCD-содержащих белков в каплях жидкости, несколько глобулярных (то есть полностью свернутых) канонических факторов DDR, включая Ku70, NBS1, MDC1 и 53BP1, были частично исключены из этих компартментов, так как они были из ядрышки (дополнительная рис. 4d – g), что указывает на то, что фазовые переходы, опосредованные ЖК-белком, действительно могут функционировать, временно захватывая некоторые и исключая другие ядерные белки.

Учитывая гомотипическую и гетеротипическую сборку белков FET в капли жидкости, мы затем проверили, могут ли прионоподобные домены также собираться в местах повреждения ДНК, где уровни PAR кратковременно всплескиваются.В нормальных условиях изолированные прионоподобные домены собирались в субъядерные капли, как наблюдалось ранее, но мы не обнаружили заметного рекрутирования в места лазерного микрооблучения (рис. 3l). Однако, когда мы совместно экспрессировали полноразмерный EWS вместе с его прионоподобным доменом, мы наблюдали временное накопление обоих белков в местах повреждения ДНК с очень сравнимой кинетикой (рис. 3m). Эти данные подтверждают представление о том, что FET-белки могут образовывать гомотипические и гетеротипические сборки, которые, по крайней мере, частично опосредованы их прионоподобными доменами, а также указывают на то, что прионоподобные домены участвуют в сборке FET-белков в местах повреждения ДНК.Действительно, и в соответствии с предыдущими выводами ¹⁷ , слияние прионоподобного домена FUS (аминокислоты 1–211) с его карбоксиконцевыми повторами RGG (аминокислоты 468–526) приводило к более выраженному накоплению в участках, облученных лазером. по сравнению с одним только карбокси-концом, богатым RGG (дополнительная рис. 4h). В совокупности эти результаты предполагают, что RGG-повторы, чувствительные к PAR, и склонные к агрегации прионоподобные домены функционально взаимодействуют для создания сборок LCD-содержащих белков более высокого порядка в местах повреждения ДНК.

Расщепление жидкости семян PAR в местах повреждения ДНК

Вышеприведенные данные согласуются с идеей о том, что спонтанные сборки изолированных прионоподобных доменов и сборки полноразмерных ЖК-содержащих белков, связанные с повреждением ДНК, имеют схожие физико-химические свойства. Таким образом, мы подозревали, что точно так же, как образование капель жидкости через прионоподобные домены, PAR-зависимая сборка IDP в местах повреждения ДНК может изменить локальное ядерное окружение до такой степени, что ее можно будет обнаружить как физическое изменение.Чтобы решить эту проблему, мы использовали покадровую светлопольную и фазово-контрастную микроскопию живых клеток после микрооблучения, чтобы отслеживать изменения в дифракции света, связанные с немедленным ответом на повреждение ДНК. Чтобы максимизировать вероятность наблюдения физических изменений в живых клетках, вызванных ФАР, мы сначала применили умеренно более высокую мощность лазера, чтобы увеличить локальную плотность разрывов ДНК. В этих условиях мы стабильно наблюдали преходящее образование отчетливых светорассеивающих темных полос именно на микрооблученных участках (рис.4а), который по картине дифракции света очень похож на описанный выше в ядрышках и в каплях жидкости, полученных из прионов FET. Поскольку кинетика изменения дифракции света отражала образование PAR и быстрые сборки белков, зависимых от PAR, в местах повреждения ДНК (рис. 1; дополнительная рис. 1), мы пришли к выводу, что они могут быть механически связаны с событиями, засеянными PAR. и что повышение стабильности PAR может поэтому усилить этот клеточный ответ. Действительно, когда мы истощали фермент, разлагающий PAR, гликогидролазу PAR (PARG) с помощью короткой интерферирующей РНК (siRNA), локальное увеличение дифракции света было более выраженным, продолжалось значительно дольше и обнаруживалось даже после снижения интенсивности лазера для повреждения ДНК. (Инжир.4б; Дополнительный фильм 3). Наблюдаемое изменение дифракции света было видно как с помощью светлопольной, так и фазово-контрастной микроскопии, развивалось с течением времени и было полностью обратимым (дополнительная рис. 5a, b), не происходило на микрооблученных участках вне ядра клетки (дополнительная рис. 5c ), и его можно было даже наблюдать в условиях, когда микрооблучению подвергались гораздо меньшие участки ядра и, следовательно, вызывалось меньшее повреждение ДНК (дополнительная рис. 5d), что вместе предполагает, что это представляет собой добросовестное физическое последствие молекулярных событий, вызванных повреждением ДНК. .Более того, химическое ингибирование образования PAR ингибиторами PARP полностью устраняло временные изменения в дифракции света (рис. 4c), не оказывая очевидного влияния на степень индуцированного повреждения ДНК, о чем свидетельствует отчетливо видимое образование γh3AX вдоль облучаемой лазерной дорожки (дополнительная информация). Рис. 5д,е). Кроме того, постепенное истощение PARP1/ARTD1 (дополнительная рис. 5g), фермента, в основном ответственного за образование PAR, вызванного генотоксическим стрессом, снижало как локальную индукцию PAR (дополнительная рис.5h) и сопутствующее изменение дифракции света дозозависимым образом (дополнительная рис. 5i), подтверждая, что PARилирование контролирует этот клеточный ответ.

( a ) Светлопольные изображения, изображающие переходную генерацию отчетливых светорассеивающих полос в местах лазерного микрооблучения в условиях повышенной лазерной энергии. Белые стрелки указывают ориентацию лазерной линии, черные стрелки указывают на светорассеивающие полосы.Звездочка и пунктирные линии указывают на светорассеивающие ядрышки. Подробнее см. в дополнительных материалах. ( b ) Изображения в светлом поле, изображающие усиленное и продолжительное образование отчетливых светорассеивающих полос в местах лазерного микрооблучения в клетках с дефицитом PARG. См. Также дополнительный фильм 3. ( c ) Яркопольные изображения клеток, истощенных лазерным микрооблучением PARG, в присутствии ингибитора PARP. ( d ) Светлопольные изображения микрооблученных лазером клеток siPARG/FET.( e ) Временная эктопическая экспрессия GFP-EWS усиливает генерацию светорассеивающих полос в ранее наивных клетках U-2-OS. После лазерного микрооблучения клетки фиксировали и окрашивали на PAR. Белые стрелки в b – e указывают направление лазерной линии, черные стрелки указывают на светорассеивающие полосы. Масштабные линейки, 10  мкм.

Затем мы спросили, связаны ли наблюдаемые физико-химические изменения с PAR-зависимой сборкой ЖК-содержащих белков в местах повреждения ДНК.Действительно, подобно прекращению образования PAR, совместное истощение трех белков FET с помощью siRNA (см. дополнительную рис. 5j, k для эффективности нокдауна) отменило ранние лазерно-индуцированные изменения в дифракции света (рис. 4d; дополнительная рис. 5l), и это влияние не было связано ни с уменьшением количества повреждений ДНК (дополнительная рис. 5l,m), ни с уровнями PARP1/ARTD1 (дополнительная рис. 5k), ни с нарушением генерации PAR, вызванной повреждением ДНК (дополнительная рис. 5n) . Наоборот, эктопическая сверхэкспрессия отдельных белков FET значительно усиливала этот клеточный ответ, что приводило к появлению светорассеивающих полос даже при слабом воздействии лазера (рис.4д). Кроме того, мы наблюдали быструю мобилизацию прионоподобных доменов в каплях жидкости, когда расслоение жидкости запускалось в непосредственной близости лазерным микрооблучением (рис. 5а), что позволяет предположить, что эти два компартмента имеют общие физико-химические свойства и могут легко обмениваться составляющими. В поддержку этого представления временная сборка полноразмерных ЖК-содержащих белков в местах повреждения ДНК часто распадалась на микрокапли (рис. 5b). Вместе эти данные свидетельствуют о том, что фазовое разделение LCD-содержащих белков происходит в местах повреждения ДНК таким образом, который зависит как от локального образования PAR, так и от присутствия IDPs, чувствительных к PAR.

( a ) Истощенные по PARG клетки U-2-OS котрансфицировали полноразмерным GFP-EWS и прионоподобными доменами EWS и FUS, слитыми с RFP. Клетки были подвергнуты лазерному микрооблучению, и были показаны кадры замедленной съемки с первых 10 минут после облучения. Зеленые стрелки (верхние панели) указывают на привлечение полноразмерных GFP-EWS к участкам повреждения ДНК.Красные стрелки (средние панели) указывают на перераспределение капли жидкости, содержащей прионоподобный домен, вблизи лазерного следа. Отметим, что появление отчетливой светорассеивающей полосы в области лазерного микрооблучения сопровождается растворением капли светорассеивающей жидкости, образованной прионоподобными доменами (нижние панели). Прионный домен, содержащий капли в дистальных отделах ядра и в цитоплазме, оказался стабильным в течение всего периода наблюдения. ( b ) PARG-истощенные клетки U-2-OS трансфицировали полноразмерным Tm-EWS. Клетки были подвергнуты лазерному микрооблучению, и были показаны кадры замедленной съемки с первых 10 минут после облучения. Красные стрелки (верхние панели) указывают на рекрутирование Tm-EWS в местах повреждения ДНК. Обратите внимание, что полноразмерный белок Tm-EWS растворяется в микрокапли в более поздние моменты времени. Масштабные линейки, 10  мкм.

Жидкость, разделяющая белки, фильтрует взаимодействия

Белок 53BP1, отвечающий за геном, интенсивно накапливается на хроматине, окружающем участки спонтанных повреждений ДНК в пролиферирующих клетках ²⁵ .Мы заметили, что, в отличие от ФАР-зависимого накопления ЖК-содержащих белков, накопление 53BP1 не вызывало увеличения дифракции света на фазово-контрастных изображениях, а вместо этого коррелировало с заметным снижением дифракции света (рис. 6а, белая стрелка). . Более того, LCD-содержащий белок EWS был исключен из фазово-контрастного светлого 53BP1-декорированного хроматина и, наоборот, мы обнаружили, что 53BP1 всегда исключен из фазово-контрастных темных областей накопления EWS (рис. 6а, белые и черные стрелки, соответственно).Эти результаты согласуются с наблюдаемым исключением 53BP1 из капель жидкости, полученных из прионного домена FET (дополнительная рис. 4g), и предполагают взаимоисключающее заполнение субъядерного пространства физико-химически различными типами белковых сборок. Чтобы напрямую проверить, может ли PAR-индуцированное жидкостное расслоение IDP в местах повреждения ДНК влиять на кинетику рекрутирования хранителей глобулярного генома, мы экспрессировали EWS в PARG-истощенных клетках (которые демонстрируют сниженную деградацию PAR) и одновременно отслеживали накопление 53BP1. , ЭВС и сопутствующие им изменения дифракции света при лазерном микрооблучении.Эти эксперименты показали, что накопление 53BP1 задерживалось специфически в клетках, экспрессирующих EWS, и даже предотвращалось его связывание с областями с самым высоким накоплением EWS (Fig. 6b). Как наблюдалось ранее (рис. 6а), накопление EWS коррелировало с фазово-контрастными темными областями, тогда как накопление 53BP1 коррелировало с фазово-контрастными светлыми областями (рис. 6b, нижние панели). Количественный анализ очагов 53BP1, индуцированных ионизирующим излучением, подтвердил, что экспрессия EWS способна подавлять накопление 53BP1 в поврежденном хроматине (дополнительная рис.6а). Интересно, что более проксимальный компонент клеточного ответа на разрыв ДНК, большой адапторный белок MDC1, был способен накапливаться вместе с EWS в местах индуцированного повреждением ДНК жидкостного расслоения, инициированного PAR (дополнительная рис. 6b, c). Следует отметить, что, поскольку ранее мы наблюдали, что в нуклеоплазме клеток, не подвергшихся стрессу, как 53BP1, так и MDC1 исключены из образования прионоподобных жидких капель (дополнительная рис. 4f, g), эти данные указывают на то, что PAR-засеянная жидкость расслаивается на участках ДНК Повреждение представляет собой клеточное средство для дифференцированной модуляции зависимых от фосфорилирования и убиквитилирования сборок «смотрителей» генома (MDC1 и 53BP1, соответственно).См. Обсуждение). В совокупности наши данные показывают, что фазовое разделение IDPs с помощью PAR-засеяния отличается от других типов накопления субнуклеарных белков, в частности от сборки хроматинового компартмента 53BP1, и потенциально может модулировать доступ хранителей генома к участкам повреждение ДНК.

( a ) Фазово-контрастные и флуоресцентные изображения, показывающие, что субъядерное накопление хранителя генома GFP-53BP1 коррелирует с уменьшением дифракции света и снижением уровней Tm-EWS (белые стрелки), в то время как накопление Tm-EWS коррелирует с повышенной дифракцией света и сниженным уровнем GFP-53BP1 (черные стрелки).( b ) Моментальные снимки из экспериментов по лазерному микрооблучению коэкспрессирующих клеток GFP-53BP1/Tm-EWS, на которых показано снижение накопления GFP-53BP1 в местах накопления EWS при длительном расслоении жидкости в клетках, истощенных по PARG. Красные стрелки указывают на накопление Tm-EWS, зеленые стрелки указывают на накопление GFP-53BP1. Масштабные линейки, 10  мкм.

Изолированные цепи PAR ускоряют агрегацию LCD

Поскольку наши данные свидетельствуют о фазовом разделении IDP с посевом PAR in vivo , важным прогнозом является то, что изолированные цепи PAR должны усиливать внутреннюю склонность к агрегации очищенных LCD- содержащие белки, зародышами их сборки и, следовательно, способствуя их агрегации — конечной точке разделения фаз жидкость-жидкость — в бесклеточной системе ²⁶ . Чтобы непосредственно проверить это предсказание, мы сначала использовали модельный пептид, содержащий короткую ранее охарактеризованную прионоподобную последовательность ²⁷ в сочетании с тройным повтором RGG (рис. 7а). Как и ожидалось, этот пептид спонтанно образовывал аморфные агрегаты in vitro , что было обнаружено с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ; рис. 7b, левая панель; дополнительная рис. 7a, для дополнительных примеров пептидных агрегатов). Поразительно, что совместная инкубация с субстехиометрическими количествами очищенного PAR при физиологических условиях pH значительно усиливала процесс агрегации, приводя к более крупным и более конденсированным агрегатам (рис.7б, средняя панель; Дополнительный рисунок 7b для дополнительных примеров пептидных агрегатов). Сопоставимые структуры отсутствовали только в контрольных образцах PAR или буфера (рис. 7b, правая панель; дополнительная рис. 7c, d). Количественное определение пептидных агрегатов на основе ПЭМ подтвердило, что более крупные агрегаты были значительно обогащены в образцах, инкубированных с PAR (рис. 7c). Важно отметить, что это увеличение размера агрегата было полностью потеряно, когда PAR был расщеплен рекомбинантным PARG перед добавлением пептида (дополнительная рис.7д). Вместе эти данные свидетельствуют о том, что изолированные цепи PAR зарождаются и, таким образом, способствуют агрегации внутренне неупорядоченных модельных пептидов in vitro . В соответствии с ролью повторов RGG в качестве датчика PAR посредством электростатических взаимодействий, изменение заряда путем замены аргинина на глутамат отменяет зависимое от PAR усиление процесса агрегации (дополнительная рис. 7f). Аналогичные результаты были получены, когда модельный пептид содержал дополнительный отрицательный заряд, обеспечиваемый амино-концевым фосфорилированием серина (дополнительная фиг.7г). Поскольку PAR способствовал процессу агрегации даже тогда, когда ингибитор PARP присутствовал на протяжении всей реакции (дополнительная рис. 7h), исключая остаточную ферментативную активность PARP, эти данные подтверждают, что агрегация с затравкой PAR зависит от нековалентных электростатических взаимодействий с PAR.

( a ) Последовательность модельного пептида, разработанная для анализа агрегации засеянного PAR in vitro .Модельный пептид содержит последовательность прионоподобного гексапептида, за которой следуют три последовательных повтора RGG. ( b ) Модельный пептид инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов с субстехиометрическими количествами изолированных полидисперсных цепей PAR или без них, а спонтанные агрегаты анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). ( c ) Как и в случае b , модельный пептид инкубировали с PAR или без него, и размеры агрегатов определяли по изображениям ПЭМ ( n =137 для образца пептида; n =116 для пептид+PAR образец).*** P <0,0001 (критерий Манна–Уитни). ( d ) Полноразмерный рекомбинантный FUS инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов с субстехиометрическим количеством очищенного PAR или без него, и белковые агрегаты анализировали с помощью ПЭМ. ( e ) Полноразмерный рекомбинантный EWS инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов с субстехиометрическим количеством очищенного PAR или без него, и белковые агрегаты анализировали с помощью ПЭМ. ( f ) Полноразмерный рекомбинантный TAF15 инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов с субстехиометрическим количеством очищенного PAR или без него, и белковые агрегаты анализировали с помощью ПЭМ.Все эксперименты с ПЭМ повторялись не менее трех раз, и показаны репрезентативные изображения. Дополнительные изображения представлены в качестве дополнительного рисунка 8. Масштабные линейки, 500 нм. ( г ) Полноразмерный рекомбинантный EWS инкубировали с очищенным PAR или без него, сшивали в 0,4% формальдегиде (FA) в течение 15 мин и анализировали с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (3–8% Трис-ацетат). После обнаружения комплексов EWS (левая панель) мембрану удаляли и повторно исследовали с антителом против PAR (правая панель).Сигналы от вестерн-блоттинга против EWS были количественно оценены с помощью ImageJ.

Модельный пептид, использованный в наших экспериментах с ПЭМ, объединил ранее охарактеризованную склонную к агрегации гексапептидную последовательность ²⁷ с тремя PAR-чувствительными повторами RGG, таким образом отражая общее наращивание белков FET. Чтобы непосредственно проверить, будет ли PAR вызывать агрегацию также полноразмерных белков, мы инкубировали рекомбинантные FUS, EWS и TAF15 с субстехиометрическими количествами PAR. Подобно модельному пептиду, полноразмерные белки FET образовывали спонтанные агрегаты in vitro , и эти агрегаты были постоянно больше в присутствии PAR (фиг.7г–е). В качестве независимого подхода к оценке PAR-опосредованного образования белковых структур более высокого порядка мы провели эксперименты по поперечному связыванию формальдегида с рекомбинантными FUS и EWS в отсутствие и в присутствии PAR. Подобно результатам наших анализов ПЭМ, добавление очищенного PAR усиливало образование димеров и мультимеров сшитых белков по сравнению с мономерами (рис. 7g; дополнительная рис. 7i, j). В совокупности и в соответствии с нашими анализами in vivo эти данные свидетельствуют о внутренней способности цепей PAR образовывать ядра агрегации LCD-содержащих IDP.

Ирина Полежаева | АДВС | УСУ

Награды

Научный сотрудник факультета CAAS, 2020 г.